Бактериальные Иммобилизация для обработки изображений методом атомно-силовой микроскопии

Резюме

Живая грамотрицательных и грамположительных бактерий, может быть иммобилизованным на желатин покрытием слюда и отображается в жидкости с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ).

Аннотация

АСМ с высоким разрешением (нм масштабе) изображения инструментом, который механически зондов поверхность. Она имеет способность изображения клеток и биомолекул, в жидкой среде, без необходимости обращаться к химически образца. Для достижения этой цели, образец должен достаточно придерживаться монтажной поверхности, чтобы предотвратить удаление силами со стороны кантилевера сканирования АСМ. Во многих случаях успешное изображения зависит от иммобилизации образца к монтажной поверхности. Оптимально, иммобилизация должна быть минимально инвазивной к образцу, что обменные процессы и функциональные атрибуты не нарушена. Покрывая свежесколотой слюды поверхности свиньи (свинья) желатина, отрицательно заряженные бактерии могут быть иммобилизованных на поверхности и отображается в жидкости с помощью АСМ. Иммобилизация клеток бактерий на желатин покрытием слюда, скорее всего, из-за электростатического взаимодействия между отрицательно заряженными бактериями и положительно заряженные желатин. Ряд факторов может повлиять на бактериальную иммобилизации, в том числе химических составляющих жидкость, в которой бактерии приостановлено, времени инкубации бактерий на желатин покрытые слюдой, поверхностные характеристики бактериального штамма и среды, в которой бактерии образ. В целом, использование желатина покрытые слюдой оказывается вообще применимо для клеток изображений микроорганизмов.

протокол

1. Слюда подготовки:

1. Вырезать слюды (наук Электронная микроскопия) с ножницами, чтобы размер необходимых, чтобы соответствовать микроскоп AFM (около 22 × 30 мм).
2. Клив слюды с обеих сторон, как правило, с помощью липкой ленты для удаления наружного слоя, пока только гладкой непрерывной слои остаются.

2. Подготовка раствора желатина:

1. Добавить 100 мл дистиллированной воды в лабораторию бутылку.
2. Тепло бутылку в микроволновой печи, пока вода не закипит. (Если микроволновая печь не доступен, воду можно нагревать в химическом стакане на горячей плите.)
3. Взвесьте из 0,5 г желатина (Sigma G-6144, G-2625 или G-2500) и добавить в горячей дистиллированной воде.
4. Аккуратно водоворот бутылка пока желатин полностью не растворится.
5. Охладите раствор желатина до 60-70 ° С.
6. Налейте примерно 15 мл в небольшой стакан (20 мл), в которую сократить расщепляется слюды может быть ближнего.

3. Слюда покрытия:

1. Погрузите слюды квадратов на нагревали раствор желатина и снимать быстро, что слюда покрытием (рис. 1а).
2. После нанесения покрытия, поддержка слюды сразу же, на краю, на бумажное полотенце, чтобы сухой в атмосферном воздухе (рис. 1б). Желатин покрытые слюдой могут быть использованы, по крайней мере 2 недели. Избыток раствора желатина можно хранить в холодильнике и использовать в течение примерно месяца просто нагревательных маточного раствора в пределах от 60-70 ° C. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы желатин не кипяченой во нагревательных.

4. Монтаж бактерий на желатин покрытые слюдой:

1. Гранул 1 мл бактериальной культуры (0,5 - 1,0 ОП при 600 нм) при 800 до 4500 RCF. В зависимости от бактерий, использовать минимальное RCF, что будет гранул клеток в ~ 5 минут.
2. Вымойте гранул в том же объеме с фильтром деионизированной водой или буфером.
3. Сбор клетки снова с помощью центрифугирования.
4. Ресуспендируют гранулы быстро в 500 мкл NanoPure деионизированной водой или буфером. (Бактериальной суспензии должны быть визуально мутными, чтобы иметь адекватные концентрации клеток для АСМ-изображений.)
5. Применение клеточной суспензии (10-20 мкл) в желатин покрытием слюда и выкладывают на поверхность с помощью пипетки (рис. 1в). Следует проявлять осторожность, чтобы не физически коснуться желатин поверхность с кончика пипетки при применении или распространение бактериальной решение.
6. Разрешить поверхности, чтобы отдохнуть в течение 10 минут и смыть струей воды или буфера (рис. 1 кд). На протяжении процедуры, принять меры к тому, что образец не может высохнуть.

5. Представитель Результаты:

На рисунке 2 показан пример изображения бактериальной клетки, которые были установлены на желатин покрытием слюда и изображено АСМ. В наших лабораториях образцы, как правило, отображаемого использованием PicoPlus атомно-силового микроскопа (Agilent Technologies, Храм, AZ) оснащен 100 голов сканирования мкм. Прибор работает при 128-512 пикселов на линии сканирования при сканировании скорость 0,5-1,0 строк / сек Консолей, которые обычно используются в Veeco нитрида кремния зондов (MLCT-AUHW, Veeco в Санта-Барбаре, Калифорния) с номинальным константы весной в диапазоне от 0,01 до 0,1 нН / нм.

Рисунок 1. Желатин при температуре 60-70 ° С находится в 20 мл стакан. Использование пинцета свежесколотой слюды квадратов полностью погружены в желатин () изъяты и помещены в вертикальном положении на бумажное полотенце, прислонившись к стойке микро центрифуги (б). Капли бактериального образец помещается на слюде и распространяются с наконечником пипетки в обоих направлениях х и у (с). После учета образец для инкубации на поверхности слюды, по крайней мере, 10 минут, смойте образца в потоке дистиллированной воды. Если иммобилизация работали, вы сможете увидеть непрозрачные пятна на слюду, как показано на правой панели (г). Если иммобилизация не работали, вы получите ясный кусок слюды, как в левой панели. Непрозрачная точка на весы слюды, чтобы концентрация бактерий в капле которые вы размещаете на желатин лечение слюды.

Рисунок 2. АСМ изображения E. палочки. В панель (а), клетки расположены на желатин покрытием слюда и отображается в 0,005 М PBS. Для сравнения, образ бактериальных клетках установлены на желатин покрытием слюда и отображается в воздухе показано на графике (б). Хотя перегородками отчетливо видны на изображении, собранных в жидкости, более высокое разрешение, о чем свидетельствует наличие пили (вставка панели (б)), могут быть получены в воздухе.

Обсуждение

Различные факторы могут повлиять на микробную клетку монтажа и обработки изображений с помощью АСМ. Желатин, который используется для покрытия слюды очень важно. Коммерческая желатин изолирован от числа позвоночных, включая рыб, коров и свиней. Оба происхождения и способа обработки о?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Имя	Компания	Номер в каталоге
Желатин	Sigma, Сент-Луис, Миссури	G6144, G2625 и G2500
PicoPlus атомно-силовой микроскоп	Компания Agilent Technologies, Темпе, AZ
АСМ-кантилеверы	Veeco в Санта-Барбаре, штат Калифорния	MLCT-AUHW