A imobilização de bactérias for Imaging por Microscopia de Força Atômica

Resumo

Vivem as bactérias Gram-negativas e Gram-positivos podem ser imobilizadas em gelatina-mica revestidas com imagens e em líquido usando Microscopia de Força Atômica (AFM).

Resumo

AFM é um de alta resolução (escala nm) ferramenta de imagem que mecanicamente um sondas de superfície. Ele tem a capacidade de células e biomoléculas imagem, em um ambiente líquido, sem a necessidade de tratar quimicamente a amostra. A fim de atingir esse objetivo, a amostra deve suficientemente aderir à superfície de montagem para evitar a remoção por forças exercidas pela ponta cantilever digitalização AFM. Em muitos casos, a imagem de sucesso depende de imobilização da amostra à superfície de montagem. Idealmente, a imobilização deve ser minimamente invasivo para a amostra de tal forma que os processos metabólicos e atributos funcionais não sejam comprometidas. Por superfícies de revestimento recém clivada com mica suína (porco) gelatina, bactérias carga negativa pode ser imobilizada na superfície e fotografada em líquido por AFM. Imobilização de células bacterianas em gelatina-mica revestida é mais provável devido à interação eletrostática entre as bactérias com carga negativa e positivamente carregada a gelatina. Vários fatores podem interferir com a imobilização de bactérias, incluindo componentes químicos do líquido em que as bactérias estão suspensos, o tempo de incubação da bactéria na gelatina mica revestidas características, superfície da estirpe bacteriana e do meio em que as bactérias são gravadas. No geral, o uso de gelatina revestido mica é encontrado para ser geralmente aplicável para as células microbianas imagem.

Protocolo

1. Preparação Mica:

1. Corte a mica (Ciências Microscopia Eletrônica) com uma tesoura para o tamanho necessário para caber o microscópio AFM (cerca de 22 × 30 mm).
2. Cleave a mica em ambos os lados, geralmente usando a fita para remover a camada externa, até que apenas suaves camadas ininterrupta permanecem.

2. Preparação da solução de gelatina:

1. Adicione 100 ml de água destilada para um frasco de laboratório.
2. Aqueça a garrafa em um forno de microondas até que a água começa a ferver. (Se um microondas não está disponível, a água pode ser aquecido em um copo sobre uma chapa quente.)
3. Pesar 0,5 gramas de gelatina (Sigma G-6144, G-2625-2500 ou G) e adicione à água quente destilada.
4. Agite suavemente o frasco até que a gelatina esteja completamente dissolvido.
5. Arrefecer a solução de gelatina a 60-70 ° C.
6. Despeje aproximadamente 15 mL para um copo pequeno (20 mL) em que a mica clivada corte podem ser mergulhados.

3. Mica revestimento:

1. Submergir as praças mica na solução aquecida gelatina e retirar rapidamente de modo que a mica é revestido (Fig. 1a).
2. Após o revestimento, o apoio da mica imediatamente, no limite, sobre um papel toalha para secar no ar ambiente (Figura 1b). A mica revestidas de gelatina pode ser usada por pelo menos duas semanas. O excesso de solução de gelatina pode ser mantido refrigerado e usado por aproximadamente um mês, basta aquecer a solução de ações para entre 60-70 ° C. Cuidados devem ser tomados para assegurar que a gelatina não é fervida durante o aquecimento.

4. Montagem de bactérias em mica revestidas de gelatina:

1. Pellet 1 mL de uma cultura bacteriana (0,5-1,0 OD a 600 nm) em 800 a 4500 rcf. Dependendo da bactéria, use o mínimo rcf que irá agregar as células em ~ 5 minutos.
2. Lavar o sedimento em um mesmo volume de água filtrada ou deionizada buffer.
3. Coletar as células por centrifugação novamente.
4. Ressuspender o sedimento em 500 mL de imediato de água deionizada NanoPure ou buffer. (A suspensão bacteriana deve ser visivelmente turva, a fim de ter uma concentração adequada de células para AFM).
5. Aplicar a suspensão de células (10-20 mL) para a mica revestidas de gelatina e espalhe sobre a superfície usando uma ponteira de pipeta (Fig. 1c). Cuidados devem ser tomados para não tocar fisicamente a superfície da gelatina com a ponta da pipeta enquanto aplica ou espalhar a solução bacteriana.
6. Permitir que a superfície em repouso por 10 minutos e enxágüe com um fluxo de água ou tampão (Fig. cd 1). Durante todo o procedimento, tome cuidado para assegurar que a amostra não é permitida para secar.

5. Resultados representativos:

A Figura 2 mostra imagens de exemplo de células bacterianas que foram montadas em gelatina-revestido mica e fotografada pela AFM. Em nossos laboratórios, amostras são tipicamente fotografada usando um microscópio de força atômica PicoPlus (Agilent Technologies, Temple, AZ) equipado com uma cabeça de digitalização 100 mm. O instrumento é operado em 128-512 pixels por linha de varredura a uma velocidade de varredura de linhas de 0,5-1,0 / s. As vigas que são normalmente utilizados são sondas Veeco nitreto de silício (MLCT-AUHW, Veeco, Santa Barbara, CA) com constantes primavera nominal variando ,01-0,1 nN / nm.

Figura 1. Gelatina a uma temperatura de 60-70 ° C é colocado em um copo de 20 ml. Usando um par de pinças recém clivada quadrados de mica são totalmente imerso na gelatina (a) retirada e colocada na vertical sobre uma toalha de papel encostado a um rack de micro centrífuga (b). Uma gota de amostra bacteriana é colocada sobre a mica e espalhar com a ponta da pipeta em ambas as direções X e Y (c). Depois de permitir que a amostra para incubar na superfície mica de pelo menos 10 minutos, lavar a amostra em um fluxo de água destilada. Se a imobilização trabalhou você será capaz de ver uma mancha opaca na mica, como mostrado no painel direito de (d). Se a imobilização não trabalho que você vai pegar um pedaço de mica clara como no painel esquerdo. A mancha opaca na balança mica para a concentração das bactérias na gota que você coloque na mica gelatina tratada.

Imagens figura 2. AFM da E. coli. No painel (a), as células são montadas em gelatina-mica revestidas e fotografada em 0,005 M PBS. Para efeito de comparação, uma imagem de células bacterianas montados em gelatina-mica e revestido com imagens no ar é mostrado no painel (b). Embora septos são claramente visíveis em imagens coletadas no estado líquido, maior a resolução, como indicado pela presença de pili (painel inset (b)), podem ser obtidas no ar.

Discussão

Vários fatores podem afetar célula microbiana de montagem e de imagem por AFM. A gelatina que é usado para o revestimento da mica é importante. Comercial de gelatina é isolado a partir de um número de vertebrados, incluindo peixes, vacas e porcos. Tanto a origem eo método de processamento de determinar a adequação da gelatina para imobilização de bactérias. Várias fontes e tipos de gelatina foram avaliados quanto à sua eficácia em bactérias imobilizar [1]. As duas gelatinas mais eficazes foram encontrado...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome	Companhia	Número de catálogo
Gelatina	Sigma, St. Louis, MO	G6144, G2625 ou G2500
PicoPlus Microscópio de Força Atômica	Agilent Technologies, Tempe, AZ
Cantilevers AFM	Veeco, Santa Barbara, CA	MLCT-AUHW