El uso de la cistometría en pequeños roedores: un estudio de la vejiga chemosensation

Resumen

Cystometry es una técnica eficaz para medir la función de la vejiga de animales pequeños In vivo. La vejiga se infundió continuamente a velocidades controladas a través de un catéter intravesical, mientras que la uretra se deja libre para la micción. Esto permite repetitivo de llenado y vaciado de la vejiga, mientras que la presión intravesical y volumen evacuado se registran.

Resumen

Protocolo

1. Animales de Laboratorio

1. Los animales (ratones, ratas) están alojados en una instalación de animales especializada con un 12-horas de luz-oscuridad ciclo y el acceso ad libitum al agua y pastillas estándar de alimentos. Tanto la edad y el sexo de los animales son parámetros importantes que deben ser estandarizados de acuerdo con las necesidades. Nos suelen realizar cistometría en 10 a 12 semanas de edad, las hembras ^5,6.
2. Todos los experimentos con animales se realicen de conformidad con las directrices europeas en materia comunitarias Consejo y aprobado por el comité de ética local.

2. Anestesia

1. Anestesia con isoflurano se utiliza para realizar pequeños procedimientos quirúrgicos, ya que es fácil de dosificar debido a su vida media corta. Gas de desecho adecuado de barrido es necesario cuando se utiliza el isoflurano.
   1. Los animales se colocan en una caja cerrada, gaseados con isoflurano 5% en oxígeno puro (1 l / min).
   2. Después de la inducción, anestesia en el l apropiadoevel es mantenida por una pequeña máscara (un corte jeringa 10 ml) en 0,8 - 1 l / min de oxígeno con 1 a 1,5% de isoflurano.
2. Para los ratones, la anestesia de uretano se utiliza durante las grabaciones funcionales (cfr. infra). Anestesia con uretano se utiliza durante las grabaciones funcionales porque, en contraste con la mayoría de otros anestésicos, el reflejo de micción no se suprime por este agente anestésico ^4. Uretano de 1,2 g / kg de peso corporal se administra por vía subcutánea (sc) 60 min antes del inicio de las grabaciones. Si es necesario, la dosis de uretano necesario para obtener la anestesia adecuada se pueden valorar mediante la administración de dosis adicionales (0,1 g / kg) por vía subcutánea. Cabe señalar, sin embargo, que la anestesia adicional puede alterar la eficiencia de la micción y por consiguiente la frecuencia de la micción ^7,8. Por lo tanto, las grabaciones cistométricos deben ser estrechamente vigilados y se desecha cuando desviaciones significativas de la conducta de control se observan. Los anestésicos no deben administrarse mientras pruebacompuestos se aplican para evitar una interpretación errónea de los datos.

3. Procedimiento quirúrgico - Implantación del catéter vesical

1. Los instrumentos quirúrgicos se esterilizaron en un autoclave antes de su uso. Afeitar el abdomen del animal, desinfectar con etanol 70% y realizar una laparotomía media baja para exponer la vejiga.
2. Bajo un microscopio quirúrgico, coloque una sutura en bolsa de tabaco en la cúpula de la vejiga usando un no-absorbible, sutura monofilamento (tamaño 6-0).
3. Realizar una cistostomía pequeña (que preferentemente usan una aguja 18 G) en el interior del cordón de bolsa e insertar un catéter de polietileno PE 50, con un pequeño manguito en el extremo (obtenido calentando con precaución el tubo) a través de este agujero. En nuestras manos, tubos más delgados (PE 10) tienen una mayor resistencia y más variable. El tubo puede ser desinfectado colocándolas en una solución de etanol al 70% o esterilizado en un autoclave. Antes de la implantación, el tubo debe ser lavada con solución salina.
4. Fije la bolsa strING alrededor del tubo con un nudo de cirujano. Tire del catéter ligeramente hacia fuera hasta que la punta en forma de campana se coloca justo debajo de la sutura. Empuje un pedazo de catéter G 18 hacia la sutura para evitar fugas.
5. Infundir un volumen pequeño de solución salina (100 - 200 l) suavemente para comprobar las fugas. Si hay fugas, una sutura adicional debe ser colocado.
6. Cerrar los músculos abdominales utilizando suturas de monofilamento, dejando un paso para el catéter en la parte superior de la incisión.
7. Túnel del tubo a la región interescapular, utilizando una barra de metal hueco, evitando así que los animales para morder el tubo durante el experimento.
8. La piel se cierra utilizando no absorbibles, las suturas de monofilamento. El catéter implantado se lava con solución salina para comprobar su permeabilidad.
9. Antes de que los animales de despertar, los analgésicos se administran subcutáneamente (buprenorfina, 0,05 mg / kg).

4. Configuración y cistometría

1. Dependiendo de la experimental questien (y las especies utilizadas) cistometría se realiza despierto (moderación o el desenfreno) o anestesiados con uretano animales. Considerando que la cistometría es perfectamente factible en ratas conscientes, que tienden a mantener la calma en un entorno restringido, por lo general realizar cistometría bajo anestesia con uretano (1,2 mg / kg, por vía subcutánea) utilizando ratones ^3,5,6,9.
2. En ratones anestesiados, la temperatura corporal se controla constantemente y se mantuvo a 36,5 ° C ± 0,2 ° C por medio de una sonda de temperatura y una lámpara de calentamiento.
3. La puesta a punto es calibrado antes de cada experimento de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
4. El catéter implantado está conectado por un trozo luer a un grifo de 3-way, que está conectado al transductor de presión (Edwards Lifesciences) en un lado y una bomba de infusión por la otra (Harvard Apparatus). El transductor de presión está conectado a través de un amplificador (78534c monitor, Hewlett Packard) para el sistema de adquisición de datos (DI-730-USB, DATAQ instruments) y un computer. Windaq / Lite software puede ser utilizado para la grabación.
5. La bomba de infusión se inicia, lo que permite la infusión de solución salina o PBS a, por ejemplo, 100 l / min (en ratas) o 20 l / min (en ratones). Como tal, la vejiga se llena a una velocidad constante, mientras que la presión intravesical se registró.
6. La Figura 5 representa una traza de presión típico: durante la infusión de fluido, hay una acumulación de presión lenta en la vejiga, hasta un cierto volumen / presión se alcanza, el umbral de micción. Una vez que se alcanza este umbral, la vejiga se contrae y, posteriormente, el esfínter urinario se abrirá, permitiendo el paso de la orina a través de la uretra. Como tal, se vacía la vejiga, la contracción se detiene y la presión caerá de nuevo a la "basal" nivel.
7. A medida que la rata se coloca en una jaula metabólica y por encima de una balanza digital, el volumen evacuado se pueden medir simultáneamente, proporcionando información sobre el volumen evacuado. Debido a los pequeños volúmenes anulados en mice, puede ser muy difícil de usar este sistema. Por lo tanto, volumen vacío se determina utilizando pequeños papeles de filtro pesados ​​antes y después de la micción.
8. Típicamente, se deja que el sistema se equilibre durante 30 min, seguido por un período de registro de 30 min. Entonces, los medicamentos pueden ser administrados sistémicamente o por vía intravesical y otros 30 min se registran.
9. Los datos registrados se pueden exportar como archivos csv. Que se pueden importar en un software especializado para el análisis cuantitativo. Nos suelen utilizar Origin (OriginLab Corporation, MA, EE.UU.).
10. Después de los experimentos, los animales se sacrificaron por dislocación cervical (ratones) o CO ₂ intoxicación (ratas).

5. Los resultados representativos

Figura 1. Panorama laparotomía. A) Coloque la rata en la posición supina. B) Shave y antisépticamente preparar el sitio quirúrgico. C) La incisión de la piel. D) Incisión oe los músculos abdominales y la exposición vejiga.

Figura 2. Una sutura en bolsa de tabaco.

Figura 3. Implantación de un catéter.

Figura 4. Excavación de túneles del catéter.

Ejemplos de mediciones de la presión intravesical obtenidos durante la perfusión de solución salina en una rata consciente y un ratón anestesiado se muestra en la Figura 5. Múltiples parámetros pueden ser extraídos de la señal de presión (por ejemplo, el intervalo de intercontractile, la presión de referencia y la presión de umbral). Para obtener una descripción completa de estos parámetros, consulte Andersson et al. (Ref. 4) y Yoshiyama et al. ( ref 10).

Recientemente hemos utilizado cistometría para identificar las dianas moleculares de aceite de mostaza (MO), un compuesto muy reactivo que se ha utilizado durante mucho tiempo en los modelos experimentales de inflamación y la hiperalgesia de los órganos viscerales, tales como la vejiga urinaria ^11,12. Infusión intravesical de 10 mM MO indujo un fuerte aumento de la frecuencia miccional (disminución del intervalo intercontractile) en ratones de tipo salvaje (Figura 6A, B) y una disminución del volumen vaciado ^6. Curiosamente, MO indujo cambios similares en ratones deficientes del receptor TRPA1 MO. Por el contrario, MO inducido cambios mucho más débiles en los parámetros cistométricos en TRPV1 ratones KO que en ratones WT y fue sin ningún efecto en Trpa1/Trpv1 ratones KO. Junto con las mediciones de la liberación de la calcitonina Gene Related Peptide (CGRP) ^6, estos datos indican demostrar que TRPV1 puede jugar un papel clave en la irritación visceral inducida por MO.

ve_content ">
Figura 5. Trazas representativas de la presión intravesical registrado en una rata consciente hembra (A) y en un ratón anestesiado hembra (B). La presión más baja se define como la "presión de línea de base" (flechas rojas). La presión al final de la fase de llenado está marcado con flechas azules. El volumen de líquido infundido entre estos puntos, dividido por la diferencia de presión, permite el cálculo de la conformidad de la pared de la vejiga (compliance = volumen infundido / (presión umbral -. Presión basal) El "intervalo intercontractile" (ICI) es el tiempo entre dos contracciones miccionales.

Figura 6. Efectos de la aplicación intravesical de aceite de mostaza en el patrón cistometría de tipo salvaje y ratones TRPA1, TRPV1 y Trpa1/Trpv1 nocaut.(A) Los ejemplos representativos de los cambios de presión intravesical registradas en WT, KO TRPA1, KO TRPV1 y ratones KO Trpa1/Trpv1 en respuesta a la infusión de solución salina y 10 mM MO. (B) Evolución temporal de la frecuencia miccional promedio instantánea antes y durante la infusión intravesical de MO. Para todos los ratones, los datos se normalizaron a la frecuencia media obtenida durante la infusión salina. Estos datos son una adaptación de Everaerts et al. (Ref. 6), con permiso de Elsevier.

Discusión

La técnica de la cistometría aquí se presenta permite realizar mediciones in vivo de la función vesical en modelos animales. Las ratas son probablemente el modelo animal más utilizado. Los ratones son más difíciles de manejar, pero ofrecen la ventaja de la utilización de animales manipulados genéticamente. Debido a la dificultad técnica de la utilización de ratones conscientes, que tienden a ser muy activo dando como resultado el aflojamiento del catéter implantado y los cambios en las presiones int...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Nombre comercial, empresa,	Número de catálogo	Comentarios
uretano	Uretano, Sigma-Aldrich	315419	carcinógeno grupo 2B
isoflurano	Isoba, Schering-Plough Animal Health
catéter de polietileno	Polietileno tubo PE50 Intramedic, Becton Dickinson	427411
microscopio quirúrgico	Op-Mi 6, Carl Zeiss	Op-Mi 6
sutura en bolsa de tabaco	Prolene 6/0, Ethicon	8610H
fascia y sutura de la piel	Ethilon 4/0 o 5/0, Ethicon	662G 661G o
analgésicos postoperatorios	Temgesic, Schering-Plough Animal Health		dosis para ratas: 0,05 mg / kg
amplificador	78534c monitor, Hewlett Packard
balanzas analíticas y de balanza de software de adquisición de datos	FZ 300i, A & D	FZ-300i
bombas de infusión	bomba 33, Harvard aparato	HA33
cistometría sistema de grabación	Instrumentos DATAQ, DI-730 serie y Windaq / Lite	DI-730-USB Windaq / Lite
temperatura registro	Fluke 52 Termómetro KJ	52 KJ
transductores de presión	Edwards Lifesciences, conjunto de control de presión	T322247A