Varias unidades Métodos de grabación para caracterizar la actividad neuronal en el Locust (<em&gt; Schistocerca americana</em&gt;) Circuitos olfativas

Resumen

Demostramos variaciones de la técnica de grabación extracelular de múltiples unidades para caracterizar el mal olor respuestas evocadas en las tres primeras etapas de la vía olfativa invertebrado. Estas técnicas se pueden adaptar fácilmente para examinar la actividad conjunto en otros sistemas neurales también.

Resumen

La detección e interpretación de señales olfativas son críticos para la supervivencia de muchos organismos. Cabe destacar que las especies a través de phyla han sistemas olfativos sorprendentemente similares sugiere que el enfoque biológico para la detección química ha sido optimizada en el tiempo evolutivo ^1. En el sistema olfativo de insectos, sustancias odoríferas son transducidas por neuronas receptoras olfativas (ORN) en la antena, que convierten los estímulos químicos en los trenes de potenciales de acción. La información sensorial desde los ORNs entonces se retransmite al lóbulo antenal (AL; una estructura análoga a la del bulbo olfatorio de vertebrados). En la Liga Americana, representaciones neurales de los olores en forma de patrones de disparo espacio-temporales distribuidos a través de conjuntos de neuronas principales (PN, también conocida como las neuronas de proyección) ^2,3. La salida AL se procesa posteriormente por células de Kenyon (KCS) en el cuerpo de hongo aguas abajo (MB), una estructura asociada con la memoria y el aprendizaje olfativo ^4,5. Ellae, se presentan técnicas electrofisiológicas de registro para controlar el mal olor respuestas evocadas en estos circuitos neuronales olfatorios.

En primer lugar, se presenta un método sensillum sola grabación para estudiar el mal olor respuestas evocadas en el nivel de las poblaciones de ORNs ^6,7. Se discute el uso de pipetas de vidrio llenos de solución salina afilados como electrodos para monitorear las respuestas ORN extracelularmente. A continuación, se presenta un método para monitorear las respuestas extracelularmente PN utilizando un canal comercial 16-electrodo ^3. Un enfoque similar utilizando un tetrodo alambre a medida 8-canal trenzado se demuestra para células Kenyon grabaciones ^8. Nosotros proporcionamos detalles de nuestra configuración experimental y presentes trazas de grabación representativos para cada una de estas técnicas.

Protocolo

1. Olor Preparación y entrega

1. Las soluciones diluidas de olor en aceite mineral en volumen para alcanzar el nivel de concentración deseado. Almacene una mezcla de 20 ml de aceite mineral y el olor en un frasco de vidrio de 60 ml. Insertar dos agujas de jeringa en un tapón de goma (calibre 19), una de la parte inferior y la otra desde la parte superior, para proporcionar una entrada y una línea de salida. Sellar la botella de vidrio con tapón de caucho y este adjuntar un diseño personalizado filtro de carbón activado a la línea de entrada (Figura 1A).
2. El filtro de carbono se hace utilizando dos jeringas 6 ml. Cortar las jeringas en la mitad y descartar el extremo del émbolo. Rellenar cada una de las piezas restantes con algodón y carbón activado antes de conectar juntos utilizando calor tubo retráctil.
3. Conectar la línea de salida de la botella de olor (con tubo de polietileno, ID 0,86 mm) para el tubo de plástico (Nalgene Tubos FEP, ID 5,8 mm) que suministra un flujo de aire constante a través de la antena (Figura 1B ).
4. Directo carbono-filtrada, aire deshumidificado (gas portador; caudal, 0,75 L / min) hacia la langosta usando un tubo de plástico que se coloca dentro de unos pocos cm de la antena de la langosta.
5. Para la estimulación olor, desplazar un volumen constante (0,1 L / min) de la cámara de aire estática por encima de la solución de olor en la botella. Esto se consigue mediante la inyección de una cantidad igual de aire deshumidificado en el frasco utilizando un Pico-bomba (WPI, PV-820). Los vapores de la botella de olor se dirige a través de la línea de salida en el tubo de flujo de aire (Figura 1B).
6. Retire los vapores de olor entregados mediante la colocación de un embudo vacío ~ 10 cm detrás de la antena contra la langosta.

2. Preparación para la grabación de Antena Locust sensillum individual

1. Seleccione una langosta de adultos jóvenes de ambos sexos con alas totalmente crecido, pero antes de la etapa de apareamiento de una colonia llena de gente. Para frenar la langosta, en primer lugar amputar las piernas. Selle los sitios de amputación con adhesivo tisular (Vetbond, 3M). Secure tél langosta a una cámara de diseño personalizado con un pequeño trozo de cinta aislante envuelto alrededor de su tórax (Figura 2A).
2. Bajo un microscopio de disección, hacer una ranura poco profunda en la plataforma de cera (Figura 2A) para la colocación de la antena. Coloque la antena en la ranura y estabilizar usando cera batik en los dos extremos de la antena (Figura 2B; una electrowaxer se utiliza para la fusión de la cera).
3. Inserte un electrodo de tierra (alambre de plata clorada) en el tórax (~ 1 cm de distancia de la cabeza). Use cera batik tanto el sello del sitio de la incisión y mantenga el cable de tierra en su lugar (Figura 2A).

3. Grabación sensillum Individual de Seguimiento de olor-evocó las respuestas de las neuronas receptoras olfativas (ORNs)

1. Coloque la antena langosta estabilizado bajo un microscopio estereoscópico (Leica M205C) en una tabla de aislamiento de vibraciones (TMC) (Figura 3A). Asegúrese de que la base de la sensillum grabación es claraLy visible (Figura 3B).
2. Use un extractor de micropipeta (Sutter P-1000) para la fabricación de electrodos de vidrio (impedancia de 3-10 mW cuando se llena con solución salina ⁹ langosta, m diámetro de la punta 1-3) utilizando un tubo capilar de vidrio de borosilicato (OD 1,2 mm, ID 0,69 mm).
3. Coloque el electrodo de vidrio en un soporte micropipeta que está unido a un micromanipulador motorizado (Sutter MP-285). Suavemente insertar el electrodo en la base de un sensillum (Figura 3B). Tenga en cuenta que cada sensillum puede contener 3-50 ORNs en langostas ^10.
4. Amplificar la señal (10.000 veces) utilizando un amplificador AC (Grass P-55). Filtrar la señal de entre 0,3 a 10,0 kHz y adquirir a una velocidad de muestreo de 15 kHz (Figura 3D) usando un sistema de adquisición de datos (LabView, PCI-MIO-16E-4 tarjetas DAQ; National Instruments).

4. Locust Procedimiento para la disección del lóbulo antenal y grabaciones de setas del cuerpo

1. Siga el restrainiprocedimientos ng como se describe en la sección 2.1. Coloque la langosta en una cámara diseñada a tal como se muestra en la Figura 4A y B.
2. Para la perfusión de solución salina durante y después del procedimiento de disección, construir una taza de cera alrededor de la cabeza de la langosta. La taza de cera debe comenzar justo por encima de las partes de la boca, y se extienden más allá de los ojos compuestos que abarca la región entre las dos antenas como se muestra en la Figura 4C.
3. Para permitir que las antenas para pasar a través de la copa de cera, crear pequeños túneles en ambos lados con plástico (polietileno) tubo (5 mm de largo, 0,86 mm ID). Asegúrese de que el tubo de plástico se puede deslizar a través de la copa de cera. Esto último se logra mediante el uso de una junta de goma que envuelve herméticamente alrededor del tubo de plástico, pero está unido a la cera-taza (Figura 4C).
4. Uso de resina epoxi, una la base de las antenas con el extremo inferior del tubo de plástico. Este paso asegura que las antenas se mantiene en su lugar, incluso después de los alrededorescutícula se retira.
5. Mantenga la copa cera llena con solución salina ⁹ desde este punto en adelante. Comenzar por la eliminación de una región rectangular central entre las dos antenas (lado más largo del rectángulo alineado con el eje anteroposterior). Posteriormente, retirar cutícula en las regiones vecinas sin molestar a los ojos compuestos y cutícula en la base de la antena (Figura 4D).
6. Con unas pinzas finas, retire suavemente sacos de aire y los cuerpos grasos que rodean el cerebro. Al final de este paso, el cerebro langosta debe ser visto claramente (Figura 4D). Nótese que las regiones del cerebro que procesan la información olfativa (con pigmentación amarillo claro) está situado entre las dos antenas.
7. En el intestino langostas pasa por debajo del cerebro y a lo largo de la longitud del cuerpo. Para evitar el movimiento de los intestinos de potencialmente desestabilizar la preparación, tire suavemente del intestino anterior y lo cortó con unas tijeras finas. Haga una pequeña incisión en el abdomen justopor encima del recto y quitar el intestino tirando del intestino posterior con pinzas gruesas. Para evitar una fuga de solución salina, atar el abdomen inmediatamente anterior al sitio de la incisión con hilos de sutura.
8. Utilice una pequeña plataforma hecha de un alambre fino recubierto con una fina capa de cera para elevar el cerebro y estabilizarla durante ¹¹ electrofisiología como se muestra en la Figura 4D.
9. El cerebro de los insectos está cubierto por una funda aislante delgada que necesita ser eliminado antes de los experimentos. Para desheath el cerebro, se extendió suavemente una pequeña cantidad de una enzima (0.3-0.4 mg de proteasa, Sigma Aldrich) sobre la superficie del cerebro utilizando unas pinzas finas ^9. Después de s ~ 5-10 de aplicación de enzima, enjuagar el cerebro a fondo con solución salina. Con super-finas pinzas muy suavemente pellizcar y tirar de la vaina y posteriormente romper abrirlo en los lugares de grabación (AL y MB, se muestra en la Figura 4E, F).

5. Grabaciones de varias unidades del lóbulo antenal yel Consejo de la seta

1. Colocar la preparación langosta (Figura 5A) bajo un estereomicroscopio suspendido de un soporte de brazo colocado sobre una mesa de aislamiento de vibraciones.
2. Mantener un ritmo constante de perfusión de solución salina (aproximadamente 0,04 L / h) durante todo el experimento. Usar un cable de plata clorada sumergido en la taza de cera lleno de solución salina como el electrodo de tierra.
3. Para las grabaciones PN, utiliza un 16-canal de silicio sonda (Tecnologías NeuroNexus, artículo # a2x2-tet-3mm-150-150-121-A16, Figura 5B). Antes de cada experimento, electrochapar los electrodos de oro para conseguir impedancias en el rango de 200-300 kW. Utilice el circuito mostrado en la Figura 7 para la galvanoplastia.
4. Coloque el electrodo cerca de la superficie del lóbulo antenal y suavemente insertar en el tejido usando un micromanipulador manual (WPI, M3301R) (Figura 5D).
5. Haga avanzar el electrodo en ~ 10 pasos micras. Espere 2-3 minutos en cada paso y evaluar la adquisición ded calidad de la señal. En un sitio de grabación ideal, señales extracelulares será recogido por múltiples canales de grabación y tendrá una alta relación señal a ruido (SNR> 3-5 veces el ruido de las desviaciones estándar).
6. Para grabaciones de KC, use un tetrodo medida alambre trenzado (Figura 5C, paso a paso el procedimiento de fabricación presentan en la Sección 6). Electrochapar estos electrodos como se discute en el paso 5,3. Coloque el tetrodo en la superficie de la MB (Figura 5E) como KC somata están restringidas a la capa superficial de la MB ^8.
7. Tanto PN y grabaciones KC se puede hacer al mismo tiempo de preparación langosta del mismo como se muestra esquemáticamente en la Figura 5A.
8. Espere por lo menos 15 min después de encontrar la ubicación de grabación para permitir la estabilización de los electrodos.
9. Adquirir todas las señales extracelulares a 15 KHz, filtro entre 0.3-6 KHz, y amplificar (10.000 veces) usando un amplificador de 16 canales AC (Biología Electronics Shop; Caltech, Pasadena, CA) (La Figura 6A, B).

6. Procedimientos para hacer electrodo de alambre trenzado para grabaciones de KC

1. Para diseñar un electrodo de múltiples unidades para las grabaciones de KC, utilice cable aislado cromo níquel (RO800, 0,0005 "filamento) ^8.
2. Si se desean ocho electrodos luego envolver el alambre alrededor de un pedazo largo de 10-15 cm de cartón 4 veces. Los extremos de la cartulina puede ser cubierta con un tubo de plástico para evitar que los bordes de corte del alambre. Si bien el embalaje, asegúrese de que hay poco flojo, pero asegúrese de que el cable no quede tirante. Manipule el cable con cuidado, ya que se rompe fácilmente.
3. Bunch los cables juntos en la parte superior del cartón y usar un trozo de cinta (cinta de tiempo, T-534-RP) para mantenerlos juntos. Cortar los cordones en el otro extremo. Quitar los hilos de alambre y el grupo de los hilos en el extremo de corte, así utilizando otra pieza de la cinta.
4. El uso de un título agitador de placas (Thermo Scientific, Modelo 4625Q), el viento los hilos juntos (~ 72 rev / min durante 3min) para formar un hilo trenzado. La parte inferior de las hebras grabadas puede ser recortado a la placa de titulación de rotor y la parte superior se puede enganchar a un soporte de la pluma. Durante el bobinado, el cable debe tener poco flojo, pero no estar tensada.
5. Fundir el aislamiento junto con una pistola de calor (Weller 6966C) para pegar los filamentos individuales entre sí y forman un solo cable. 3-4 pases lentos (3-4 segundos cada uno) sobre la longitud del alambre debe ser suficiente para calentar y fundir los hilos juntos. A continuación, suelte el cable desde la parte inferior y permitir que se relaje. Recorte el cable cerca de los extremos para quitar la cinta.
6. Insertar un extremo del cable a través de un tubo de vidrio de 5-6 cm de largo, capilar (OD 1,0 mm, ID 0,58 mm). Separar el alambre retorcido en un extremo con unas pinzas finas y eliminar el recubrimiento por muy brevemente quemando el extremo usando una llama. Este paso debe realizarse con cuidado; exponer el alambre a la llama durante demasiado tiempo hará que las hebras para fundir y enredo.
7. Suavemente separar las hebras 8 en el extremo de un flameadond soldadura cada capítulo por separado en una conexión de 8-pin IC. Escudo de la parte superior de la toma de IC con epoxi para mantener los filamentos de vidrio capilar y en su lugar. También coloque una pequeña gota de epoxi en el otro extremo del capilar para mantener el cable en su sitio (Figura 5C).
8. Por último, cortar la punta de la aguja en un ángulo de 45 grados con tijeras carburo de aproximadamente 0,5 cm de la punta capilar.

Resultados

Respuestas evocadas olor-de una sola ORN a dos alcoholes diferentes se muestran en la Figura 3D. Dependiendo de la ubicación de la grabación (tipo sensilla, la colocación del electrodo) de unidades múltiples grabaciones se puede lograr.

Una forma de onda prima extracelular de una grabación de AL se muestra en la Figura 6A. Los potenciales de acción o picos de amplitudes variables procedentes de PN diferentes se puede observar en esta traza de tensión....

Discusión

Estímulos sensoriales más evocan respuestas combinatorias que se distribuyen a través de conjuntos de neuronas. Por lo tanto, la supervisión simultánea de múltiples neurona actividad es necesario entender como estímulo específico de información está representada y procesada por los circuitos neurales en el cerebro. En este caso, hemos demostrado extracelulares unitarios múltiples técnicas de grabación para caracterizar el mal olor respuestas evocadas en los centros de procesamiento de los tres primeros lo l...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre	Empresa	Número de Catálogo	Comentarios
			Electrofisiología Equipo
AC amplificador	HIERBA	Modelo P55	para las grabaciones individuales sensillum
Audio monitor (modelo 3300)	Sistemas AM	940000
Por encargo de 16 canales pre-amplificador y amplificador	Cal. Tech. Biología Electronics Shop		para las grabaciones de AL y MB
Unidad de adquisición de datos	National Instruments	BNC-2090
Luz de fibra óptica	WPI	SI-72-8
Fuente de luz 115 V	WPI	NOVA
Micromanipulador Manual	WPI	M3301R	para las grabaciones del cerebro de langosta
Stereomicroscope1 en el stand de la pluma	Leica	M80	para las grabaciones del cerebro de langosta
Stereomicroscope2	Leica	M205C	para las grabaciones individuales sensillum
Aislamiento de vibraciones mesa	TMC	63-500 serie
Micromanipulador motorizado	Sutter Instruments	MP285 / T
Osciloscopio	Tektronix	TD2014B
			Electrodos / Herramientas de Construcción
16-canal de electrodo	NeuroNexus	A2x2-tet-3mm-150-121	para las grabaciones de lóbulo antenal
Tubos capilares de borosilicato con filamento, ID 0,69 mm	Sutter Instruments	BF120-69-10	para la fabricación de electrodos de vidrio
Micropipetas extractor	Sutter Instruments	P-1000
El generador de funciones	Multímetro Almacén	SG1639A	para electrodos de sobrerregulación
Oro solución de chapado (no cianuro)	Industrias SIFCO	NC SPS 5355
Impedancia probador	BAK Electronics Inc.	IMP-2	para electrodos de sobrerregulación
Rotary Switch	Electroswitch	C7D0123N	para el oro-plnamiento electrodos
Pulse aislador	WPI	A365	para electrodos de sobrerregulación
Q serie portaelectrodos	Warner Instruments	64-1091
Alambre de plata .010 "de diámetro	Sistemas AM	782500	electrodo de masa
8 pin DIP socket IC	Digikey	ED90032-ND
Tubos capilares de borosilicato con filamento, ID 0,58 mm	Warner Instruments	64-0787	alambre trenzado construcción tetrodo
Heat gun	Weller	6966C
Rediohm-800 cable	Kanthal Precision Tecnologías	PF002005
Titer agitador de placas	ThermoCientífico	4625Q	alambres retorcidos
Carburo de tijeras, 4,5 "	Investigación Biomédica Instr	25-1000	para el corte de cables trenzados tetrodo
Pinzas de punta fina	HECO	91-EF5-SA	para cables tetrodo bromas aparte
			Olor de entrega
6 ml jeringa	Kendall	1180600777	diseñado para filtro de carbón activado
Botellas de color marrón de olor	Pescador	08-912-165
Carbón	BuyActivatedCharcoal.com	GAC-48C
Desecante	Drierite	23005
Gas Drierite secado tarro	Fischer Scientific	09-204
Tubo termorretráctil	3M	EPS-200	olor filtro preparación
Aguja hipodérmica buje de aluminio, calibre 19	Kendall	8881-200136	para proporcionar líneas de entrada y de salida para las botellas de olor
Aceite mineral	Mallinckrodt Químicos	6357-04	para la dilución olor
Nalgene plástico tubo, 890 FEP	Thermo Scientific	8050-0310	para el suministro de gas portador
Neumático picopump	WPI	sistema de pv820	para la entrega de olor
Tubería de polietileno de 0,86 mm ID	Intramedic	427421	para el olor botella connecti salidaComplementos y tubos profusión salina
Tapones	Pure Lab	97041	para el sellado de botellas de olor
Tiempo de cinta	PDC	T-534-RP
Tubería luer	Cole-Parmer	30600-66
Tubo vacío	McMaster-Carr	5488K66
			Preparación / Disección
100 x 15 mm plato petri	VWR International	89000-304
18 AWG cable trenzado de cobre	Lapp Kabel	4510013	aislamiento de los cables se utiliza como juntas de goma
22 AWG cable para conexión de cadena	Alphawire	1551	cerebroplataforma
Batik cera	Jacquard	7946000
Cera de periferia Dental	Henry Schein Dental-	6652151
Electrowaxer	Almore Internacional	66000
Epoxy, 5 min	Permatex	84101
Aguja hipodérmica buje de aluminio	Kendall	8881-200136
Proteasa de Streptomyces griseus	Sigma-Aldrich	P5147	para desheathing cerebro langosta
Sutura rosca no estéril	Pescador	NC9087024	para atar el abdomen después de la eliminación intestinal
Vetbond	3M	1469SB	para sellar amsitios de amputación
Dumont # 1 pinza (grueso)	WPI	500335
Dumont # 5 pinzas de titanio (muy bien)	WPI	14096
Dumont # 5SF fórceps (super-fino)	WPI	500085	desheathing cerebro langosta
10 cm Tijeras de disección	WPI	14393	para retirar las patas y las alas
Tijeras Vannas (bien)	WPI	500086	para retirar cutícula, cortando el intestino anterior
			Profusión Saline
Juego de extensión con regulador de caudal	Moore Medical	69136	para regular el flujo de solución salina
IV equipo de administración conY el sitio de inyección	Moore Medical	73190	para regular el flujo de solución salina