Multi-unit Metodi di registrazione per caratterizzare l&#39;attività neurale nel Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Circuiti olfattive

Riepilogo

Dimostriamo variazioni del extracellulare più unità tecnica di registrazione per la caratterizzazione degli odori-risposte evocate nelle prime tre fasi del percorso olfattivo invertebrati. Queste tecniche possono essere facilmente adattati per esaminare l'attività ensemble in altri sistemi neuronali pure.

Abstract

Rilevazione e l'interpretazione dei segnali olfattivi sono fondamentali per la sopravvivenza di molti organismi. Sorprendentemente, specie in tutto phyla sono sistemi olfattivi sorprendentemente simili suggerisce che l'approccio biologico chimico rilevamento è stato ottimizzato nel tempo evolutivo ^1. Nel sistema olfattivo degli insetti, odoranti sono trasdotte dai neuroni recettori olfattivi (ORN) in antenna, che convertono gli stimoli chimici in treni di potenziali d'azione. Input sensoriali dai ORNs viene quindi trasmessa al lobo antennale (AL, una struttura analoga al bulbo olfattivo vertebrati). Nel AL, rappresentazioni neurali per gli odori assumere la forma di modelli spazio-temporali di cottura distribuiti in gruppi di neuroni principali (PN, noto anche come i neuroni di proiezione) ^2,3. L'uscita AL viene successivamente elaborato da cellule Kenyon (KC) nel corpo funghi valle (MB), una struttura associata memoria olfattiva e apprendimento ^4,5. Suoe, presentiamo tecniche di registrazione elettrofisiologiche di monitorare odori evocate risposte neurali in questi circuiti olfattivi.

Primo, presentiamo un singolo metodo di registrazione sensillum studiare odori risposte evocate a livello di popolazioni di ORNs ^6,7. Si discute l'uso di soluzione salina pipette di vetro riempito affilati come elettrodi per monitorare le risposte ORN extracellulare. Successivamente, presentiamo un metodo per monitorare extracellularmente risposte PN utilizzando un commerciale a 16 canali elettrodo ^3. Un approccio simile utilizzando una misura tetrodo filo ritorto a 8 canali è dimostrata per cella Kenyon registrazioni ^8. Noi forniamo i dettagli del nostro setup sperimentale e presentano tracce rappresentative di registrazione per ciascuna di queste tecniche.

Protocollo

1. Odore di preparazione e consegna

1. Soluzioni diluite odori in olio minerale in volume per ottenere il livello desiderato di concentrazione. Memorizzare una miscela di 20 ml di olio minerale e l'odorizzante in una bottiglia di vetro 60 ml. Inserire due aghi siringa in un tappo di gomma (calibro 19), una dal basso e l'altra dalla parte superiore, per fornire un ingresso e una linea di uscita. Sigillare la bottiglia di vetro con il tappo di gomma e collegare un progettato carbone attivo filtro in aspirazione (Figura 1A).
2. Il filtro a carbone viene realizzata utilizzando due 6 ml siringhe. Tagliare le siringhe a metà ed eliminare la fine stantuffo. Riempite ciascuno dei pezzi restanti con cotone e carbone attivo prima di collegarli insieme usando una guaina termoretraibile.
3. Collegare la linea di uscita della bottiglia odore (usando tubi in polietilene, ID 0,86 millimetri), il tubo di plastica (Nalgene tubi FEP, ID 5,8 mm) che fornisce un flusso costante attraverso l'antenna (Figura 1B ).
4. Diretto carbonio filtrata, deumidificata (gas di trasporto; portata, 0,75 L / min) verso la locusta utilizzando un tubo di plastica inserito all'interno di pochi cm dell'antenna locusta.
5. Per la stimolazione odore, spostare un volume costante (0,1 L / min), lo spazio di testa sopra la soluzione statica odore nella bottiglia. Questo viene ottenuto iniettando una quantità uguale di aria deumidificata nella bottiglia mediante un Pico-pompa (WPI, PV-820). Vapori dal flacone odore vengono indirizzate verso la linea di uscita del flusso d'aria sul tubo (Figura 1B).
6. Rimuovere i vapori odore consegnati mettendo un imbuto sotto vuoto ~ 10 cm dietro l'antenna locusta.

2. Preparazione Antenna Locust per la registrazione Sensillum Singola

1. Selezionare un giovane-adulto locusta di ambo i sessi con completamente messo le ali, ma prima della fase di accoppiamento da una colonia affollato. Per contenere la locusta, prima amputare le gambe. Sigillare i siti di amputazione con tessuto adesivo (Vetbond, 3M). Sicuro tha locusta ad una camera progettato con un piccolo pezzo di nastro isolante avvolto intorno al suo torace (Figura 2A).
2. Sotto un microscopio di dissezione, una scanalatura poco profonda nella piattaforma cera (Figura 2A) per il posizionamento dell'antenna. Posizionare l'antenna nella scanalatura e stabilizzarlo con cera batik alle due estremità dell'antenna (Figura 2B, un electrowaxer viene utilizzata per fondere la cera).
3. Inserire un elettrodo di massa (filo d'argento chlorided) nel torace (~ 1 cm di distanza dalla testa). Utilizzare cera batik per riparare il sito di incisione e tenere il filo di terra in posizione (Figura 2A).

3. Registrazione Sensillum unico per il monitoraggio di odori evocati risposte da neuroni recettori olfattivi (ORNs)

1. Posizionare l'antenna locusta stabilizzato allo stereomicroscopio (Leica M205C) su un tavolo di isolamento di vibrazione (TMC) (Figura 3A). Assicurarsi che la base del sensillum registrazione è chiaroly visibile (Figura 3B).
2. Utilizzare un estrattore micropipetta (Sutter P-1000) per fabbricare elettrodi di vetro (impedenza 3-10 MW quando è riempita di soluzione salina ⁹ robinie, micron diametro in punta 1-3) utilizzando un tubo di vetro borosilicato capillare (diametro esterno 1,2 mm, ID 0,69 millimetri).
3. Posizionare l'elettrodo di vetro in un supporto micropipetta che è collegato a un micromanipolatore motorizzato (Sutter MP-285). Inserire delicatamente l'elettrodo nella base di un sensillum (Figura 3B). Si noti che ogni sensillum può contenere 3-50 ORNs in locuste ^10.
4. Amplificare il segnale (10.000 volte) usando un amplificatore AC (Grass P-55). Filtrare il segnale tra 0,3-10,0 kHz e acquisire a una velocità di campionamento 15 kHz (Figura 3D) utilizzando un sistema di acquisizione dati (LabView, PCI-MIO-16E-4 schede DAQ, National Instruments).

4. Locust Procedura dissezione per lobo antennale e Recordings corpo funghi

1. Seguire la restrainiprocedure ng come descritto nella sezione 2.1. Posizionare la locusta in una custom-designed camera come mostrato in Figura 4A e B.
2. Per perfusione soluzione salina durante e dopo la procedura di dissezione, costruire una tazza di cera intorno alla testa locusta. La tazza cera dovrebbe iniziare appena sopra le parti di bocca, e si estendono oltre gli occhi composti che comprendono la regione tra due antenne come mostrato nella figura 4C.
3. Per consentire le antenne di passare attraverso la coppa cera, creare piccoli tunnel su entrambi i lati con plastica (polietilene) tubo (5 mm di lunghezza, ID 0,86 millimetri). Assicurarsi che il tubo di plastica può scorrere attraverso la coppa cera. Quest'ultimo è ottenuto utilizzando una guarnizione in gomma che avvolge strettamente attorno al tubo di plastica, ma è collegato alla cera tazza (Figura 4C).
4. Utilizzando resina epossidica, fissare la base delle antenne all'estremità inferiore del tubo di plastica. Questo passaggio garantisce che le antenne sono tenuti in posizione anche dopo il circostantecuticola viene rimosso.
5. Tenere la coppa cera riempito con soluzione salina ⁹ da questo punto in poi. Iniziare rimuovendo una regione centrale rettangolare tra due antenne (lato maggiore del rettangolo allineato con l'asse antero-posteriore). Successivamente, rimuovere le cuticole in regioni vicine senza disturbare gli occhi composti e cuticole alla base dell'antenna (Figura 4D).
6. Utilizzando una pinza sottile, rimuovere delicatamente sacche d'aria e gli organismi di grasso che circondano il cervello. Al termine di questa fase, il cervello locusta deve essere chiaramente visto (Figura 4D). Si noti che le regioni del cervello che elaborano le informazioni olfattive (con luce pigmentazione gialla) si trovano tra due antenne.
7. In locuste l'intestino passa sotto il cervello e lungo la lunghezza del corpo. Per evitare che il movimento dell'intestino dal potenzialmente destabilizzare la preparazione, tirare delicatamente il foregut e tagliare con le forbici sottili. Fai una piccola incisione nell'addome appenasopra il retto e rimuovere l'intestino tirando il hindgut con una pinza grossolani. Per evitare una perdita di soluzione salina, legare l'addome immediatamente anteriore al sito di incisione con fili di sutura.
8. Utilizzare una piccola piattaforma costituito da un filo sottile rivestito con un sottile strato di cera per elevare il cervello e stabilizzarla durante elettrofisiologia ¹¹ come mostrato in figura 4D.
9. Il cervello insetto è coperto da una guaina isolante sottile che deve essere rimosso prima di esperimenti. Per desheath il cervello, delicatamente diffondere una piccola quantità di un enzima (0,3-0,4 mg proteasi, Sigma Aldrich) sulla superficie del cervello utilizzando una pinza sottile ^9. Dopo s ~ 5-10 applicazione enzima, lavare il cervello a fondo con soluzione salina. Utilizzo di super-sottili pinze molto delicatamente pizzicare e tirare la guaina e il successivo strappo aperto oltre le posizioni di registrazione (AL e MB, mostrato in figura 4E, F).

5. Multi-unit registrazioni dal lobo antennale eil fungo del corpo

1. Mettere la preparazione locusta (Figura 5A) allo stereomicroscopio sospeso ad una giraffa posto su un tavolo isolamento dalle vibrazioni.
2. Mantenere una velocità costante di perfusione soluzione fisiologica (circa 0,04 L / h) durante l'esperimento. Utilizzare un filo di argento chlorided immerso nella soluzione salina tazza cera come l'elettrodo di massa.
3. Per le registrazioni PN, utilizzare un 16 canali di silicio sonda (Tecnologie NeuroNexus, elemento # a2x2-tet-3mm-150-150-121-A16, Figura 5B). Prima di ciascun esperimento, gli elettrodi elettroplaccatura con oro per ottenere impedenze nell'intervallo 200-300 k. Utilizzare il circuito mostrato in Figura 7 per elettrodeposizione.
4. Posizionare l'elettrodo vicino alla superficie del lobo antennale e inserirla delicatamente il tessuto utilizzando un micromanipolatore manuale (WPI, M3301R) (Figura 5D).
5. Avanzare l'elettrodo in ~ 10 passi micron. Attendere 2-3 min ad ogni passo e valutare l'acquisizioned qualità del segnale. In un sito registrazione ideale, segnali extracellulari sarà raccolto da molteplici canali di registrazione e avrà un alto rapporto segnale-rumore (SNR> 3-5 volte rumore SDS).
6. Per le registrazioni KC, utilizzare una misura tetrodo intrecciato fili (figura 5C, passo-passo procedura di fabbricazione presentato nella sezione 6). Placcare questi elettrodi come discusso nel passo 5,3. Posizionare il tetrodo sulla superficie del MB (Figura 5E) come KC somata sono limitati allo strato superficiale della MB ^8.
7. Sia PN e registrazioni KC può essere fatta simultaneamente dalla preparazione locusta stesso come schematicamente mostrato in figura 5A.
8. Attendere almeno 15 minuti dopo l'individuazione della posizione di registrazione per consentire la stabilizzazione degli elettrodi.
9. Acquisire tutti i segnali extracellulari a 15 KHz, filtro tra 0,3-6 KHz, e amplificare (10.000 volte) utilizzando un canale di 16 AC amplificatore (Biologia Officina elettronica, Caltech, Pasadena, CA) (Figura 6A, B).

6. Le procedure per rendere Elettrodo ritorto filo per Recordings KC

1. Per progettare un sistema multi-unità di elettrodi per le registrazioni KC, utilizzare filo isolato cromo nichel (RO800, 0,0005 "filamento) ^8.
2. Se otto elettrodi sono desiderata, quindi avvolgere il filo intorno ad un pezzo 10-15 cm lungo di cartone 4 volte. Le estremità del cartone può essere rivestita con tubi di plastica per evitare che i bordi di taglio del filo. Mentre involucro, assicurarsi che ci sia poco gioco, ma in modo che il filo non sia teso. Maneggiare con cura il filo come si rompe facilmente.
3. Mazzetto insieme i fili in alto del cartone e usare un pezzo di nastro (Tape Time, T-534-RP) per tenerli insieme. Tagliare i fili all'altra estremità. Rimuovere i trefoli e di gruppo i fili alla fine taglio e con un altro pezzo di nastro.
4. Utilizzo di un titolo agitatore (Thermo Scientific, modello 4625Q), vento i fili insieme (~ 72 giri / min per 3min) per formare un filo ritorto. La parte inferiore dei fili registrate può essere agganciato al rotore piatto titolo e la parte superiore può essere agganciato a una giraffa. Durante l'avvolgimento, il cavo deve avere po 'di cavo, ma non essere teso.
5. Fondere l'isolamento con una pistola termica (Weller 6966C) per attaccare i singoli fili insieme e formano un unico filo. 3-4 passaggi lenti (3-4 sec ciascuno) oltre la lunghezza del filo dovrebbe essere sufficiente per riscaldare e fondere i filamenti. Quindi rilasciare il filo dal basso e lasciarlo riposare. Tagliare il filo in prossimità delle estremità per rimuovere il nastro.
6. Inserire una estremità del filo attraverso un lungo 5-6 cm, tubo capillare di vetro (diametro esterno 1,0 mm, ID 0,58 millimetri). Tease a parte il filo intrecciato ad una estremità con una pinzetta sottili e rimuovere il rivestimento molto brevemente sfiammatura alla fine con una fiamma. Questo passaggio deve essere fatto attentamente, esponendo il filo alla fiamma per troppo tempo farà sì che i fili a sciogliersi e senza grovigli.
7. Delicatamente separare gli 8 fili alla fine una fiammatand saldare ogni filo separatamente in una presa a 8 pin IC. Coat parte superiore della presa IC con resina epossidica per tenere i fili e capillare di vetro in posizione. Anche mettere una piccola goccia di resina epossidica all'altra estremità del capillare per tenere il filo in posizione (Figura 5C).
8. Infine, tagliare la punta del filo ad un angolo di 45 gradi con forbici carburo di circa 0,5 cm dalla punta del capillare.

Risultati

Risposte evocate odori di un singolo ORN a due differenti alcoli sono mostrati in Figura 3D. A seconda della posizione di registrazione (tipo sensilli, posizionamento dell'elettrodo) più unità registrazioni possono essere raggiunti.

Una forma d'onda grezza extracellulare da una registrazione AL è mostrato nella figura 6A. Potenziali di azione o picchi di ampiezze diverse provenienti da diverse PN può essere osservata in questa traccia di tensione...

Discussione

Stimoli sensoriali più evocano risposte combinatorie che sono distribuiti su insiemi di neuroni. Quindi, il controllo simultaneo di multi-neurone attività è necessario comprendere come stimolo informazioni specifiche è rappresentato ed elaborate da circuiti neurali nel cervello. Qui, abbiamo dimostrato extracellulari più unità tecniche di registrazione per la caratterizzazione degli odori-evocate risposte alle prime tre centri di lavorazione lungo il percorso olfattivo degli insetti. Si noti che le tecniche qui pr...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
			Elettrofisiologia Attrezzature
AC amplificatore	GRASS	Modello P55	per le registrazioni sensillum singoli
Audio monitor (modello 3300)	AM Sistemi	940000
Su misura 16 canali pre-amplificatore e amplificatore	Cal. Tech. Biologia Officina elettronica		per le registrazioni AL e MB
Acquisizione dati unità	National Instruments	BNC-2090
Illuminazione a fibre ottiche	WPI	SI-72-8
Sorgente di luce 115 V	WPI	NOVA
Micromanipolatore manuale	WPI	M3301R	per le registrazioni del cervello delle locuste
Stereomicroscope1 allo stand braccio	Leica	M80	per le registrazioni del cervello delle locuste
Stereomicroscope2	Leica	M205C	per le registrazioni sensillum singoli
Vibrazioni-isolamento tavolo	TMC	63-500 serie
Micromanipolatore motorizzato	Sutter Instruments	MP285 / T
Oscilloscopio	Tektronix	TD2014B
			Elettrodi / Construction Tools
16-channel elettrodo	NeuroNexus	A2x2-tet-3mm-150-121	per le registrazioni lobi antennali
Borosilicato tubi capillari con filamento, ID 0,69 millimetri	Sutter Instruments	BF120-69-10	per realizzare elettrodi di vetro
Micropipetta estrattore	Sutter Instruments	P-1000
Generatore di funzioni	Multimetro Magazzino	SG1639A	per doratura elettrodi
Soluzione di placcatura in oro (non cianuro)	SIFCO Industries	NC SPS 5355
Impedenza tester	BAK Electronics Inc.	IMP-2	per doratura elettrodi
Interruttore rotativo	Electroswitch	C7D0123N	per l'oro-plelettrodi ating
Pulse isolatore	WPI	A365	per doratura elettrodi
Serie Q supporto per elettrodi	Warner Instruments	64-1091
Filo di argento 0.010 "di diametro	AM Sistemi	782500	elettrodo di massa
8 pin DIP presa IC	Digikey	ED90032-ND
Borosilicato tubi capillari con filamento, ID 0,58 millimetri	Warner Instruments	64-0787	intrecciato filo costruzione tetrodo
Pistola di calore	Weller	6966C
Rediohm-800 filo	Kanthal Precision Technologies	PF002005
Titer tavola oscillante	ThermoScientifico	4625Q	fili di torsione
Forbici in metallo duro, 4,5 "	Ricerca Biomedica Instr	25-1000	per il taglio di fili intrecciati tetrodo
Pinzette punta fine	HECO	91-EF5-SA	per fili tetrodo prendere in giro a parte
			Odore di consegna
6 ml siringa	Kendall	1180600777	per il carbonio filtro personalizzato progettato attivato
Bottiglie odore Brown	Pescatore	08-912-165
Carbone di legna	BuyActivatedCharcoal.com	GAC-48C
Essiccante	Drierite	23005
Gas Drierite essiccazione vaso	Fischer Scientific	09-204
Le guaine termorestringenti	3M	EPS-200	odore preparazione filtro
Mozzo in alluminio ipodermico ago, calibro 19	Kendall	8881-200136	per fornire linee di ingresso e di uscita per bottiglie odore
Olio minerale	Mallinckrodt Chemicals	6357-04	per la diluizione odore
Nalgene tubi di plastica, 890 FEP	Thermo Scientific	8050-0310	per la consegna del gas di trasporto
Pneumatica picopump	WPI	sys-pv820	per la consegna degli odori
Tubo in polietilene ID 0,86 millimetri	Intramedic	427421	per l'odore bottiglia presa connection e tubi profusione salina
Tappi	Pure Lab	97041	per sigillare bottiglie odore
Tempo di nastro	PDC	T-534-RP
Tubi luer	Cole-Parmer	30600-66
Tubo a vuoto	McMaster-Carr	5488K66
			Preparazione / Dissection
100 x 15 mm Petri	VWR International	89000-304
18 AWG filo di rame intrecciato	Lapp Kabel	4510013	isolamento filo è usato come guarnizioni di gomma
22 AWG filo di collegamento flessibile	AlphaWire	1551	cervellopiattaforma
Batik cera	Jacquard	7946000
Periferia cera dentale	Henry-Schein Dental	6652151
Electrowaxer	Almore internazionale	66000
Epossidica, 5 min	Permatex	84101
Ago ipodermico mozzo in alluminio	Kendall	8881-200136
Proteasi dallo Streptomyces griseus	Sigma-Aldrich	P5147	per desheathing cervello locusta
Sutura filo non sterili	Pescatore	NC9087024	per legare l'addome dopo la rimozione dell'intestino
Vetbond	3M	1469SB	per sigillare amamputazione siti
Dumont # 1 pinza (grossolana)	WPI	500335
Dumont # 5 titanio pinza (fine)	WPI	14096
Dumont # 5SF Pinza (super-fine)	WPI	500085	desheathing cervello locusta
10 centimetri dissezione forbici	WPI	14393	per rimuovere le gambe e le ali
Forbici Vannas (fine)	WPI	500086	per la rimozione di cuticola, tagliando il foregut
			Profusion Saline
Estensione set con regolatore di portata	Moore Medical	69136	per regolare il flusso salino
IV set di somministrazione conY al sito di iniezione	Moore Medical	73190	per regolare il flusso salino