Multi-unit Recording Methoden zur neuronalen Aktivität in der Locust Charakterisieren (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfaktorische Circuits

Zusammenfassung

Wir zeigen Varianten der extrazellulären Multi-Unit-Aufnahmetechnik, um Geruch hervorgerufenen Reaktionen in den ersten drei Stufen der wirbellosen olfaktorischen charakterisieren. Diese Techniken können leicht an ensemble Aktivität in anderen neuronalen Systemen sowie zu untersuchen.

Zusammenfassung

Erkennung und Interpretation der Geruchssinn sind entscheidend für das Überleben vieler Organismen. Bemerkenswert ist, haben Arten in phyla auffallend ähnlich olfaktorischen Systeme darauf hindeutet, dass die biologische Ansatz zur chemischen Sensorik über evolutionäre Zeit ¹ wurde optimiert. Im Insekt olfaktorische System werden Riechstoffe Geruchsrezeptor Neuronen (ORN) in der Antenne, die chemische Stimuli umzuwandeln in Züge von Aktionspotentialen transduziert. Sensorischen Input der ORN wird dann dem Antennallobus (; eine Struktur analog zu der Wirbeltier Riechkolben AL) weitergeleitet. In der AL, nehmen neuronale Repräsentationen für Gerüche in Form von raumzeitlichen Brennen Muster über Ensembles der wichtigsten Neuronen (PNs, auch als Projektionsfläche Neuronen genannt) verteilt ^2,3. Die AL-Ausgang wird nachfolgend durch Kenyonzellen (KCS) in der stromabwärtigen Pilzkörper (MB), eine Struktur mit olfaktorischen Gedächtnis und Lernen ^4,5 assoziiert verarbeitet. Ihre, präsentieren wir elektrophysiologische Aufnahmetechniken, um Geruch hervorgerufenen neuronalen Antworten in diesen olfaktorischen Schaltungen überwachen.

Zunächst präsentieren wir einen einzigen Sensillum Aufnahme Methode, um Geruchs-evozierte Potentiale auf der Ebene von Populationen von ORN ^6,7 studieren. Wir diskutieren die Verwendung von Kochsalzlösung gefüllte geschärft Glaspipetten als Elektroden, um extrazellulär überwachen ORN Antworten. Weiter präsentieren wir eine Methode, um extrazellulär überwachen PN Reaktionen unter Verwendung eines handelsüblichen 16-Kanal-Elektrode ^3. Ein ähnlicher Ansatz mit einem maßgeschneiderten 8-Kanal-twisted wire Tetrode für Kenyon Zellen Aufnahmen ⁸ demonstriert. Wir stellen Details unserer experimentellen Aufbau und Gegenwart repräsentative Aufzeichnung Spuren für jede dieser Techniken.

Protokoll

Ein. Geruch Vorbereitung und Lieferung

1. Verdünnte Geruch Lösungen in Mineralöl Vol. um die gewünschte Konzentration zu erreichen. Speichern einer 20 ml Mischung aus Mineralöl und dem Duftstoff in einer 60 ml Glasflasche. Legen Sie zwei Spritze Nadeln in einen Gummistopfen (Gauge 19), eine von unten und die andere von oben, um einen Einlass und einen Auslass Linie bereitzustellen. Verschließen Sie die Glasflasche mit diesem Gummistopfen und fügen Sie eine kundenspezifische Aktivkohlefilter mit der Zuleitung (Abbildung 1A).
2. Der Aktivkohlefilter wird mit zwei 6 ml Spritzen. Schneiden Sie die Spritzen in der Hälfte und entsorgen Sie die Kolben Ende. Füllen Sie jedes der restlichen Stücke mit Baumwolle und Aktivkohle, bevor Sie sie zusammen mit Schrumpfschlauch.
3. Verbinden der Ausgangsleitung des Geruchs Flasche (mit Polyethylenschlauch, 0,86 mm ID), um den Kunststoffschlauch (Nalgene FEP Tubing, ID 5,8 mm), die einen konstanten Luftstrom liefert über die Antenne (1B ).
4. Direkte Kohlenstoff-gefilterten, entfeuchtete Luft (Trägergas; Fließgeschwindigkeit, 0,75 l / min) in Richtung der Johannisbrotgummi über einen Kunststoffschlauch in wenigen cm des Johannisbrotgummi Antenne.
5. Für Duftstimulation, verdrängen ein konstantes Volumen (0,1 l / min) des statischen Kopfraum über der Geruch Lösung in der Flasche. Dies wird durch Injizieren einer gleichen Menge von entfeuchteter Luft in die Flasche unter Verwendung eines Pico-Pumpe (WPI, PV-820) gelöst. Die Brüden aus der Flasche sind Geruch durch die Auslassleitung in die Luftströmungsrohr (1B) gerichtet ist.
6. Entfernen Sie die gelieferte Geruch Dämpfen, indem ein Vakuum Trichter ~ 10 cm hinter der Heuschrecke Antenne.

2. Vorbereiten Locust Antenne für Einzel Sensillum Recording

1. Wählen Sie ein junger Erwachsener locust beiderlei Geschlechts mit ausgewachsenen Flügel, aber vor der Paarung Etappe von einem überfüllten Kolonie. Um die Heuschrecke zurückzuhalten, erste amputieren den Beinen. Verschließen Sie die Amputation Seiten mit Gewebekleber (Vetbond, 3M). Sichere ter Heuschrecken zu einer maßgeschneiderten Kammer mit einem kleinen Stück Isolierband um seine Brust drapiert (Abbildung 2A).
2. Unter einem Dissektionsmikroskop, einen flachen Nut in dem Wachs Plattform (2A) für die Antenne Platzierung. Die Antenne in die Nut und stabilisieren diese mit batik Wachs an den beiden Enden der Antenne (2B; ein electrowaxer wird zum Schmelzen des Wachses verwendet).
3. Legen Sie eine Masseelektrode (chlorierten Silberdraht) in den Thorax (~ 1 cm vom Kopf). Verwenden Batik Wachs sowohl Siegel der Inzisionsstelle und halten Sie die Erdungsdraht (Abbildung 2A).

3. Einzel Sensillum Aufnahme auf Odor-evozierte Antworten von olfaktorischen Rezeptor-Neuronen (ORN) überwachen

1. Legen des stabilisierten, Johannisbrotgummi Antenne unter einem Stereomikroskop (Leica M205C) auf einer Schwingungsisolierung Tisch (TMC) (3A). Stellen Sie sicher, dass die Basis der Aufnahme Sensillum klar ist,ly sichtbar (Abb. 3B).
2. Verwenden eines Feinpipettenziehvorrichtung (Sutter P-1000) zu Glaselektroden (Impedanz 3-10 MOhm, wenn sie mit Johannisbrotgummi Kochsalzlösung ^9, Spitzendurchmesser 1-3 um gefüllte) unter Verwendung eines Borsilikat-Glaskapillare (OD 1,2 mm, 0,69 mm ID) herzustellen.
3. Das Glas Elektrode in eine Mikropipette Halter, der an einem motorisierten Mikromanipulator (Sutter MP-285) angebracht ist. Schieben Sie die Elektrode in die Basis eines Sensillum (3B). Beachten Sie, dass jedes Sensillum können 3-50 ORN in Heuschrecken ¹⁰ enthalten.
4. Verstärken des Signals (10.000 mal) mit einem AC-Verstärker (Grass P-55). Filter das Signal zwischen 0,3 bis 10,0 kHz und erwerben bei 15 kHz Abtastrate (3D) mit einem Datenerfassungssystem (LabView, PCI-MIO-16E-4 DAQ-Karten; National Instruments).

4. Locust Dissection Vorgehensweise für Antennallobus und Pilzkörper Recordings

1. Folgen Sie dem restraining Verfahren wie in Abschnitt 2.1 beschrieben. Positionieren Sie die Heuschrecke in einem individuell gestalteten Kammer, wie in Abbildung 4A und B gezeigt.
2. Um perfundieren Kochsalzlösung während und nach der Dissektion Verfahren, bauen ein Wachs cup rund um die Heuschrecken Kopf. Das Wachs Tasse sollte knapp oberhalb der Mundwerkzeuge beginnen, und sich über die Facettenaugen umfasst den Bereich zwischen den beiden Antennen wie in 4C gezeigt.
3. Damit die Antennen durch das Wachs Kelch an, erstellen kleine Tunnel auf beiden Seiten mit Kunststoff (Polyethylen)-Schlauch (5 mm lang, ID 0,86 mm). Stellen Sie sicher, dass das Kunststoffrohr kann durch das Wachs Tasse gleiten. Letztere wird unter Verwendung einer Gummidichtung, die eng umschlingt das Kunststoffrohr erreicht, aber mit dem Wachs-Becher (4C) befestigt sind.
4. Verwendung von Epoxydharz, befestigen die Basis der Antennen mit dem unteren Ende des Kunststoffschlauchs. Dieser Schritt stellt sicher, dass die Antennen an Ort und Stelle bleiben auch nach der Umgebung stattNagelhaut wird entfernt.
5. Halten Sie das Wachs Tasse mit Kochsalzlösung ⁹ ab diesem Zeitpunkt gefüllt. Beginnen durch Entfernen eines zentralen rechteckigen Bereichs zwischen den beiden Antennen (längere Seite des Rechtecks ​​mit dem anteroposterioren Achse ausgerichtet). Anschließend entfernen Nagelhaut in benachbarten Regionen, ohne die Facettenaugen und Nagelhaut an der Basis der Antenne (4D).
6. Mit feinen Pinzette vorsichtig entfernen Luftsäcke und Fett umgebenden Körpern das Gehirn. Am Ende dieses Schritts sollte das Johannisbrotgummi Gehirn deutlich zu erkennen (Figur 4D). Beachten Sie, dass die Hirnregionen, die olfaktorische Information (mit Licht gelbe Pigmentierung) verarbeiten zwischen den beiden Antennen befinden.
7. Heuschrecken in der Darm verläuft unterhalb des Gehirns und entlang der Länge des Körpers. Um die Bewegung des Darms von potenziell destabilisierenden die Vorbereitung zu verhindern, ziehen Sie die Vorderdarm und schneiden Sie es mit einer feinen Schere. Machen Sie einen kleinen Schnitt in den Bauch nurüber dem Rektum und entfernen Sie den Darm, indem Sie den Enddarm mit groben Pinzette. Um eine Kochsalzlösung Leck zu verhindern, binden den Bauch sofort anterior der Inzisionsstelle mit Nähfäden.
8. Mit einem kleinen Plattform eines dünnen Drahtes mit einer dünnen Schicht aus Wachs, das Gehirn zu erhöhen und zu stabilisieren ¹¹ während Elektrophysiologie wie in 4D gezeigt, beschichtet ist.
9. Das Insekt Gehirn wird durch eine dünne isolierende Hülle, die vor der Experimente entfernt werden muss abgedeckt. Um das Gehirn desheath sanft verteilt eine kleine Menge eines Enzyms (0,3 bis 0,4 mg Protease, Sigma Aldrich) über die Oberfläche des Gehirns mit feinen Pinzetten ^9. Nach ~ 5-10 s von Enzym-Anwendung, spülen Sie das Gehirn gründlich mit Kochsalzlösung. Mit super-feinen Pinzette sehr sanft kneifen und ziehen Sie die Hülle und danach reißt es über die Aufnahmeorte (AL und MB; siehe Abbildung 4E, F) zu öffnen.

5. Multi-unit Aufnahmen aus der Antennallobus undPilzkörper

1. Legen Sie die Heuschrecken Vorbereitung (5A) unter einem Stereomikroskop von einem Galgen auf einer Schwingungsisolierung Tisch aufgehängt.
2. Aufrechterhaltung einer konstanten Kochsalzlösung Perfusionsrate (ungefähr 0,04 l / h) während des Experiments. Verwenden eines chlorierten Silberdraht in der Kochsalzlösung gefüllte Tasse Wachs als Masseelektrode eingetaucht.
3. Für PN-Aufnahmen, mit einem 16-Kanal-Silizium-Sonde (NeuroNexus Technologies, item # a2x2-tet-3mm-150-150-121-A16, 5B). Vor jedem Versuch, elektroplattieren der Elektroden mit Gold, um Impedanzen im Bereich von 200 bis 300 kOhm erreichen. Verwenden Sie die Schaltung in Abbildung 7 für die Galvanotechnik gezeigt.
4. Positionieren Sie die Elektrode in der Nähe der Oberfläche des Antennallobus und schieben Sie es in das Gewebe mit einer manuellen Mikromanipulator (WPI, M3301R) (Abbildung 5D).
5. Schieben Sie den Elektrode in ~ 10 um Schritte. Warten Sie 2-3 min bei jedem Schritt und bewerten die zu erwerbend Signalqualität. In einer idealen Aufnahmeort wird extrazelluläre Signale an von verschiedenen Aufzeichnungskanälen abgeholt und ein hohes Signal-zu-Rausch-Verhältnis (SNR> 3-5 mal Rauschen SDs) haben.
6. Für KC-Aufnahmen, verwenden Sie eine maßgeschneiderte verdrillte Tetrode (5C, Schritt-für-Schritt Fertigung in Abschnitt 6 dargestellt). Elektroplattieren dieser Elektroden, wie in Schritt 5.3 diskutiert. Platzieren Sie die Tetrode auf der Oberfläche des MB (5E) als KC Somata der Oberflächenschicht des MB ⁸ beschränkt sind.
7. Sowohl PN und KC Aufnahmen gleichzeitig aus derselben Johannisbrotgummi Zubereitung hergestellt werden, wie schematisch in 5A gezeigt.
8. Eine Wartezeit von mindestens 15 min nach dem Auffinden der Aufzeichnungsstelle zu einer Stabilisierung der Elektroden zu ermöglichen.
9. Erwerben Sie alle extrazellulären Signalen bei 15 KHz, Filter zwischen 0,3-6 KHz, und verstärken (10.000 Mal) mit einem 16-Kanal-AC-Verstärker (Biology Electronics Shop; Caltech, Pasadena, CA) (6A, B).

6. Verfahren zur Twisted Wire Elektrode für KC Recordings Stellen

1. Um eine Multi-Unit-Elektrode für KC-Aufnahmen gestalten, verwenden isoliert Chrom-Nickel-Draht (RO800, 0,0005 "Filament) ^8.
2. Wenn acht Elektroden gewünscht werden dann wickeln Sie den Draht um einen 10-15 cm langen Stück Pappe 4 mal. Die Enden des Kartons kann mit Kunststoffschlauch abgedeckt werden, um die Kanten von Schneiden des Drahts zu verhindern. Während wrapping, stellen Sie sicher, es gibt wenig schlaff, sondern sicherzustellen, dass der Draht nicht straff gespannt ist. Behandeln Sie den Draht vorsichtig, da es leicht bricht.
3. Bunch die Drähte zusammen an der Spitze der Karton und mit einem Stück Klebeband (Time Tape, T-534-RP), um sie zusammenzuhalten. Schneiden die Stränge an dem anderen Ende. Entfernen Sie die Drahtlitzen und Gruppe die Drähte an dem abgeschnittenen Ende sowie mit einem anderen Stück des Bandes.
4. Mit einem Titer Schüttler (Thermo Scientific, Modell 4625Q), Wind die Stränge (~ 72 U / min für 3min) zu einem verdrillten Draht zu bilden. Der Boden der abgeklebt Stränge können auf die Titerplatte Rotor befestigt werden und die obere kann zu einem Galgen befestigt werden. Beim Wickeln sollte der Draht haben wenig Spielraum, aber nicht gespannt sein.
5. Die Isolierung schmelzen zusammen mit einer Heißluftpistole (Weller 6966C), um die einzelnen Stränge aneinander haften und bilden einen einzigen Draht. 3-4 langsam Durchgängen (3-4 Sek. jeweils) über die Länge des Drahtes sollte ausreichen, um zu erwärmen und zu verschmelzen die Stränge zusammen. Dann lassen Sie den Draht aus dem Boden und lassen Sie sich zu entspannen. Schneiden Sie den Draht in der Nähe der Enden, um das Band zu entfernen.
6. Stecken Sie ein Ende des Drahtes durch einen 5-6 cm langen, Glaskapillare (OD 1,0 mm, ID 0,58 mm). Necken auseinander verdrillten Draht an einem Ende mit feinen Pinzetten und Entfernen der Beschichtung durch sehr kurz torching das Ende mit einer Flamme. Dieser Schritt muss sorgfältig durchgeführt werden; Aussetzen der Draht an der Flamme zu lange verursachen die Stränge zu schmelzen und zu verwirren.
7. Vorsichtig trennen die 8 Stränge auf der geflammten Ende einnd Lot jeder Strang separat in einem 8-poligen IC-Sockel. Beschichtung der Spitze der IC-Fassung mit Epoxid zum Halten der Stränge und Glaskapillare vorhanden. Auch einen kleinen Tropfen von Epoxid an dem anderen Ende der Kapillare, um den Draht an Ort und Stelle (5C) zu halten.
8. Schließlich schneiden die Spitze des Drahtes in einem 45 Grad-Winkel mit Hartmetall Schere etwa 0,5 cm von der Kapillarspitze.

Ergebnisse

Geruch hervorgerufenen Reaktionen eines einzelnen ORN an zwei verschiedene Alkohole sind in der Figur 3D dargestellt. Abhängig von dem Aufnahmeort (Sensillen Typs, die Platzierung der Elektrode) mehrgliedrige Aufnahmen erreicht werden kann.

Eine rohe extrazellulären Wellenform von einem AL Aufnahme in 6A gezeigt. Aktionspotentiale oder Spikes unterschiedlicher Amplituden aus verschiedenen PNs kann in diesem Spannungsbereich Spur beobachtet werden. Obwohl d...

Diskussion

Die meisten Sinnesreize wecken kombinatorischen Reaktionen, die über Ensembles von Neuronen verteilt sind. Daher ist die gleichzeitige Überwachung von mehreren Neuronen-Aktivität notwendig zu verstehen, wie Stimulus-spezifische Informationen dargestellt und durch neuronale Schaltkreise im Gehirn verarbeitet werden. Hier haben wir extrazelluläre Multi-Unit-Aufnahmetechniken, um Geruch hervorgerufenen Reaktionen auf die ersten drei Bearbeitungszentren entlang der Insekten olfaktorischen charakterisieren demonstriert. ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name	Firma	Catalog Number	Kommentare
			Elektrophysiologie Ausrüstung
AC-Verstärker	GRASS	Modell P55	für einzelne Sensillum Aufnahmen
Audio-Monitor (Modell 3300)	AM-Systems	940000
Custom-made 16-Kanal-Vorverstärker und Verstärker	Cal. Tech. Biologie Electronics Shop		für AL und MB-Aufnahmen
Datenerfassungseinheit	National Instruments	BNC-2090
Lichtleiter	WPI	SI-72-8
Lichtquelle 115 V	WPI	NOVA
Manuelle Mikromanipulator	WPI	M3301R	für Heuschrecken Gehirn-Aufnahmen
Stereomicroscope1 am Galgen	Leica	M80	für Heuschrecken Gehirn-Aufnahmen
Stereomicroscope2	Leica	M205C	für einzelne Sensillum Aufnahmen
Vibration-Isolation-Tabelle	TMC	63-500 Serie
Motorisierte Mikromanipulator	Sutter Instruments	MP285 / T
Oszilloskop	Tektronix	TD2014B
			Elektroden / Construction Tools
16-Kanal-Elektrode	NeuroNexus	A2x2-tet-3mm 150-121	für Antennallobus Aufnahmen
Borosilikat Kapillarrohre mit Filament, ID 0,69 mm	Sutter Instruments	BF120-69 bis 10	zur Herstellung von Glas-Elektroden
Feinpipettenziehvorrichtung	Sutter Instruments	P-1000
Funktionsgenerator	Multimeter Warehouse	SG1639A	für Gold-Plating Elektroden
Goldplattierungslösung (non Cyanid)	SIFCO Industries	NC SPS 5355
Impedanz-Tester	BAK Electronics Inc.	IMP-2	für Gold-Plating Elektroden
SWITCH ROTARY	Electroswitch	C7D0123N	für Gold-plating Elektroden
Pulse Isolator	WPI	A365	für Gold-Plating Elektroden
Q-Serie Elektrodenhalter	Warner Instruments	64-1091
Silberdraht 0,010 "Durchmesser	AM-Systems	782500	Erdungselektrode
8 pin DIP IC-Sockel	Digikey	ED90032-ND
Borosilikat Kapillarrohre mit Filament, ID 0,58 mm	Warner Instruments	64-0787	verdrillte Tetrode Bau
Heißluftgebläse	Weller	6966C
Rediohm-800 Draht	Kanthal Precision Technologies	PF002005
Titer Plattenschüttler	ThermoWissenschaftlich	4625Q	Verdrillen von Drähten
Carbide Schere, 4,5 "	Biomedical Research Instr	25-1000	zum Schneiden von Twisted Tetrode Drähten
Feine Spitze Pinzette	HECO	91-EF5-SA	für Hänseleien Tetrode Drähte auseinander
			Geruch Lieferung
6 ml Spritze	Kendall	1180600777	für kundenspezifische Aktivkohlefilter
Brown Geruch Flaschen	Fischer	08-912-165
Holzkohle	BuyActivatedCharcoal.com	GAC-48C
Trockenmittel	Drierite	23005
Drierite Gastrocknung jar	Fischer Scientific	09-204
Schrumpfschlauch	3M	EPS-200	Geruchsfilter Vorbereitung
Injektionsnadel Aluminium-Nabe, gauge 19	Kendall	8881-200136	zum Bereitstellen und Ableitungen für Geruch Flaschen
Mineralöl	Mallinckrodt Chemicals	6357-04	Geruchs-Verdünnung
Nalgene Kunststoffschlauch, 890 FEP	Thermo Scientific	8050-0310	für Trägergas Lieferung
Pneumatische picopump	WPI	sys-PV820	Geruchs-Lieferung
Polyethylen-Schlauch ID 0,86 mm	Intramedic	427421	Geruchs-Flasche Steckdose connections und Kochsalzlösung Fülle Schlauch
Stoppers	Lab pur	97041	zum Abdichten Geruch Flaschen
Zeit tape	PDC	T-534-RP
Tubing Luer	Cole-Parmer	30600-66
Vakuumröhre	McMaster-Carr	5488K66
			Vorbereitung / Dissection
100 x 15 mm Petrischale	VWR International	89000-304
18 AWG Kupferlitze	Lapp Kabel	4510013	Drahtisolierung als Gummidichtungen verwendet
22 AWG Schaltdraht	Alphawire	1551	GehirnPlattform
Batik Wachs	Jacquard	7946000
Dental Peripherie Wax	Henry-Schein Dental	6652151
Electrowaxer	Almore Internationale	66000
Epoxy, 5 min	Permatex	84101
Injektionsnadel Alunabe	Kendall	8881-200136
Protease aus Streptomyces griseus	Sigma-Aldrich	P5147	für desheathing locust Gehirn
Faden unsteril	Fischer	NC9087024	zum Binden der Bauch nach gut Entfernen
Vetbond	3M	1469SB	zur Abdichtung amputation Seiten
Dumont # 1 Pinzette (grob)	WPI	500335
Dumont Nr. 5 Titan Pinzette (fein)	WPI	14096
Dumont # 5SF Pinzette (super-fein)	WPI	500085	desheathing locust Gehirn
10 cm Präparierscheren	WPI	14393	zum Entfernen von Beinen und Flügeln
Vannas Schere (fein)	WPI	500086	zum Entfernen von Nagelhaut, Schneiden der Vorderdarm
			Saline Profusion
Erweiterung mit Durchflussmengenregler gesetzt	Moore Medical	69136	zum Regulieren Flüssigkeitsweiterleitung
IV-Verabreichung Set mitY Injektionsstelle	Moore Medical	73190	zum Regulieren Flüssigkeitsweiterleitung