JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы демонстрируем изменения внеклеточного многоквартирных техника съемки, чтобы охарактеризовать запах вызывал ответ в течение первых трех этапах беспозвоночных обонятельных путей. Эти методы могут быть легко адаптированы для изучения ансамбля деятельность в других нейронных систем.

Аннотация

Обнаружение и интерпретация обонятельные сигналы имеют решающее значение для выживания многих организмов. Примечательно, что виды на филы были поразительно похожи обонятельной системы предполагая, что биологический подход к химической зондирования была оптимизирована в течение эволюционного времени 1. В насекомого обонятельной системы, отдушки трансдуцированных обонятельными рецепторами нейронов (ORN) в антенне, которые преобразуют химические раздражители в поездах потенциалов действия. Сенсорный ввод с ORNs затем передаются на усиков доли (AL; структуру, аналогичную позвоночных обонятельные луковицы). В AL, нейронных представлений для запаха в форме пространственно-временной модели стрельбы распределены по ансамблей основных нейронов (векселей; также называют проекцией нейронов) 2,3. Выход AL впоследствии обработанные клетки Кеньон (КЦ) в нижнем тело гриба (MB), структуры, связанной с обонятельной памяти и обучения 4,5. Еее, мы представляем электрофизиологические методы записи для мониторинга запах вызывал нервных реакций в этих обонятельных схемы.

Во-первых, мы представляем один метод записи сенсиллы для изучения запахов вызванных ответов на уровне популяций ORNs 6,7. Мы обсудим использование солевого раствора заполнены заостренные стеклянных пипеток в качестве электродов для мониторинга внеклеточно ORN ответов. Далее мы представляем метод внеклеточно мониторинг PN ответы с помощью коммерческого 16-канальный электрод 3. Аналогичный подход с использованием заказных 8-канальный витая тетрод продемонстрировали Kenyon клетки записей 8. Мы предлагаем детали нашей экспериментальной установки и настоящим представителем записи следов для каждого из этих методов.

протокол

1. Подготовка запах и доставки

  1. Развести запаха решений в минеральном масле по объему для достижения желаемого уровня концентрации. Храните 20 мл смеси минерального масла и одоранта в 60 мл стеклянную бутылку. Вставьте две иглы шприца в резиновую пробку (манометрическое 19), один снизу, а другой сверху, чтобы обеспечить вход и выход линии. Закройте стеклянную бутылку с резиновой пробкой и прикрепить специально разработанный фильтр с активированным углем на входе линии (рис. 1А).
  2. Угольный фильтр осуществляется с помощью двух 6 шприцов мл. Разрежьте пополам шприцы и выбросить плунжера конца. Заполните каждый из оставшихся частей с хлопком и активированного угля перед подключением их вместе с помощью термоусадочной трубки.
  3. Подключить линии выхода запах бутылку (с использованием полиэтиленовых труб, ID 0,86 мм) в пластиковой трубки (Nalgene FEP труб, ID 5,8 мм), что обеспечивает постоянный поток воздуха через антенны (рис. 1б ).
  4. Прямая углерод-фильтром, осушенный воздух (газ-носитель; расход, 0,75 л / мин) в сторону саранчи с помощью пластиковой трубки помещены в течение нескольких см от саранчи антенны.
  5. Для стимуляции запах, сворачивайте постоянного объема (0,1 л / мин) от статического пространство над запах раствора в бутылке. Это достигается путем введения равное количество осушенный воздух в бутылку, используя Pico-насос (WPI, PV-820). Пары от запаха бутылки направляются через выходную линию на трубе воздушный поток (рис. 1б).
  6. Снимите доставлен паров запахов, создав вакуум воронку ~ 10 см за саранчой антенны.

2. Подготовка Locust антенна для однократной записи сенсиллы

  1. Выберите молодых и взрослых саранчи обоего пола с полностью выросли крылья, но до спаривания этапе от переполненных колоний. Чтобы сдержать саранчи, в первую ампутировать ноги. Печать ампутации сайтов с ткани клеем (Vetbond, 3M). Безопасные тОн саранчи в специально созданных камерой с помощью небольшой кусок изоленты вспыхнут вокруг своей грудной клетки (рис. 2A).
  2. Под микроскопом рассечение, сделать мелкий паз в воск платформы (рис. 2A) для размещения антенны. Установить антенну в паз и стабилизировать его с помощью батик воск на двух концах антенны (рис. 2В; electrowaxer используется для плавления воска).
  3. Вставьте заземляющий электрод (хлорированном серебряной проволоки) в грудной клетке (~ 1 см от головы). Используйте батик воск, как для герметизации разреза и удерживать провод заземления на месте (рис. 2A).

3. Однократной записи сенсиллы по контролю Запах-вызванных ответов от обонятельных нейронов рецептора (ORNs)

  1. Поместите стабилизировалась саранчи антенны под стереомикроскопом (Leica M205C) на столе виброизоляции (TMC) (рис. 3А). Убедитесь, что база записи сенсиллы ясноют видимой (рис. 3В).
  2. С помощью микропипетки съемник (Саттер Р-1000) для изготовления стеклянных электродов (сопротивление 3-10 МОм при заполнении саранчи солевой 9, диаметром кончика 1-3 мкм) с использованием боросиликатного стекла капиллярная трубка (диаметр 1,2 мм, 0,69 мм ID).
  3. Поместите стеклянный электрод в микропипетки держатель, который крепится к моторизованным микроманипулятора (Sutter MP-285). Аккуратно вставить электрод в базе сенсиллы (рис. 3В). Заметим, что каждый сенсиллы может содержать 3-50 ORNs в саранча 10.
  4. Усиление сигнала (10000 раз) с помощью усилителя переменного тока (Grass P-55). Фильтр сигнала между 0,3 - 10,0 кГц и приобрести на 15 кГц частотой дискретизации (рис. 3D) с использованием системы сбора данных (LabView, PCI-MIO-16E-4 DAQ карты, National Instruments).

4. Locust Dissection Порядок усиков доли и записей теле гриба

  1. Следуйте restrainiнг процедуры, как описано в разделе 2.1. Установите саранчи в специально разработанных камеры, как показано на рисунке 4A и B.
  2. Чтобы заливать солевые во время и после процедуры вскрытия, построить воск чашку вокруг саранчи голову. Воск чашка должна начинаться чуть выше устья частей, и выходят за рамки сложных глаз охватывает область между двумя антеннами, как показано на рисунке 4С.
  3. Для того чтобы антенна проходит через воск чашки, создают небольшие туннели с обеих сторон с использованием пластиковых (полиэтилен) трубы (5 мм, 0,86 мм ID). Убедитесь, что пластиковая трубка может скользить через воском чашку. Последнее достигается с помощью резиновой прокладкой, плотно оборачивается вокруг пластиковой трубки, но прикреплена к восковой чашки (рис. 4в).
  4. Использование эпоксидной смолы, приложите основание антенны на нижнем конце пластиковой трубы. Этот шаг гарантирует, что антенны удерживаться на месте даже после того, как окружающиекутикула удаляется.
  5. Держите воск кубок, наполненный солевым раствором 9 от этого момента. Начните с удаления центральной прямоугольной области между двумя антеннами (длинная сторона прямоугольника в соответствие с передне-задней оси). Затем удалите кутикулу в соседних регионах, не нарушая сложные глаза и кутикулу у основания антенны (рис. 4D).
  6. Использование тонких щипцов, осторожно удалите воздушные мешки и жира тела, окружающей мозг. В конце этого шага, саранча мозга должно быть четко видно (рис. 4D). Обратите внимание, что области мозга, которые обрабатывают обонятельной информации (светло-желтая пигментация) расположен между двумя антеннами.
  7. В саранчи кишечник проходит ниже мозга и вдоль тела. Для предотвращения движения кишечника от потенциально дестабилизирующих подготовки, осторожно потяните кишки и вырезать его с помощью тонких ножниц. Сделайте небольшой надрез в брюшной полости тольковыше прямой кишки и удалить кишечник, потянув за заднюю кишку с грубыми щипцами. Для предотвращения утечки солевого, связать живот сразу перед разрезом сайт с швом нитями.
  8. Используйте небольшой платформе изготовлены из тонкой проволоки, покрытой тонким слоем воска, чтобы поднять мозга и стабилизировать его 11 во время электрофизиологии как показано на рисунке 4D.
  9. Насекомое мозга покрыты тонким изолирующую оболочку, которая должна быть удалена перед экспериментами. Для desheath мозга, мягко распространяться небольшое количество фермента (0.3-0.4 мг протеазы, Sigma Aldrich) на поверхности мозга с помощью тонких щипцов 9. После ~ 5-10 с фермента приложений, промыть мозг полностью с физиологическим раствором. Использование супер-тонкий пинцет очень осторожно зажимать и тянуть оболочку и затем разорвать ее открыть на запись местах (AL и МБ; показано на рисунке 4E, F).

5. Multi-единицы Записи из усиков доли иГриб тела

  1. Поместите саранчи подготовки (рис. 5А) под стереомикроскопом отстранен от бума стенд на столе изоляции вибрации.
  2. Поддерживайте постоянную скорость перфузии солевым (около 0,04 л / ч) на протяжении всего эксперимента. Используйте хлорированном серебряной проволоки погружен в заполненные физиологическим раствором воска чашку в качестве основного электрода.
  3. Для записи PN используется 16-канальный кремниевый зонд (NeuroNexus Technologies, пункт № A2x2-тет-3мм-150-150-121-A16, рис 5B). Перед каждым экспериментом, гальванизировать электроды с золотом для достижения сопротивления в 200-300 кОм. С помощью схемы, показанной на рисунке 7 для гальваники.
  4. Поместите электрод близко к поверхности усиков доли и аккуратно вставьте его в ткани с помощью ручного микроманипулятора (WPI, M3301R) (рис. 5D).
  5. Переход электрода в ~ 10 мкм шаги. Подождите 2-3 минут на каждом шагу и оценки приобретаютD качество сигнала. В идеальном сайте записи, внеклеточные сигналы будут подобраны несколько каналов записи и будет иметь высокое отношение сигнал-шум (SNR> 3-5 раза шума SDS).
  6. Для записи KC, используют заказные витой провод тетрода (рис. 5C, шаг за шагом, изготовление процедура представлена ​​в разделе 6). Гальванического эти электроды, как описано в пункте 5.3. Поместите тетрод на поверхность MB (Рис. 5E), как KC somata ограничивается поверхностным слоем MB 8.
  7. Оба PN и KC записи могут быть сделаны одновременно с подготовкой саранчи же, как схематически показано на рисунке 5а.
  8. Подождите не менее 15 минут после нахождения место съемки, чтобы стабилизация электродов.
  9. Приобретать все внеклеточные сигналы на частоте 15 кГц, фильтр между 0.3-6 кГц, и усилить (10000 раза), используя 16-канальный усилитель переменного тока (биология магазин электроники, Калифорнийский технологический институт, Пасадена, Калифорния) (Рисунок 6а, б).

6. Процедуры для витой Сварочная проволока для записи KC

  1. Чтобы создать многоквартирных электродов для записи KC, используйте изолированный провод никеля хрома (RO800, 0,0005 "нити) 8.
  2. Если восемь электродов желаемого затем обернуть проволоку вокруг 10-15 см в длину кусок картона в 4 раза. Концы картона может быть покрыта пластиковой трубки, чтобы предотвратить края от резки проволоки. В то время как упаковка, убедитесь, что есть немного вялый, но убедитесь, что провода не натянуты. Обращайтесь с проводом тщательно, как он легко ломается.
  3. Букет провода вместе в верхней части картона и использовать кусок ленты (лента времени, Т-534-RP), чтобы держать их вместе. Разрежьте нити на другом конце. Снимите жилы и группа провода на срез, а с помощью другой кусок ленты.
  4. Использование титр шейкере (Thermo Scientific, модель 4625Q), ветер нити вместе (~ 72 об / мин в течение 3мин) с образованием одной витой проволоки. В нижней части лентой нити можно закрепить на роторе пластины титров и верхнюю можно закрепить к буму стенде. В процессе намотки, провод должен иметь немного вялый, но не быть натянута.
  5. Растопить изоляцию вместе с тепловой пушкой (Weller 6966C) придерживаться отдельные пряди вместе и образуют единый провод. 3-4 медленных проходов (3-4 сек каждый) по всей длине провода должно быть достаточно, чтобы нагреть и соединить нити вместе. Затем отпустите провод от дна и дайте ему отдохнуть. Обрезать провода рядом с концами, чтобы удалить ленту.
  6. Вставьте один конец провода через 5-6 см длиной, стекло капиллярная трубка (диаметр 1,0 мм, 0,58 мм ID). Tease, кроме витой провод на одном конце с помощью тонкой пинцет и удалите покрытие на очень кратко поджог конца с помощью пламени. Этот шаг должен быть выполнен тщательно, подвергая провод к пламени слишком долго будет вызывать нити таять и клубок.
  7. Аккуратно отделить от 8 нитей на пылали концай пайки каждую прядь отдельно в 8-контактный разъем IC. Пальто верхней части IC розетка с эпоксидным держать нити и стеклянный капилляр на месте. Также поместите небольшую каплю эпоксидной на другом конце капилляра провести провода в месте (рис. 5С).
  8. Наконец, обрежьте кончик проволоки на угол 45 градусов с карбидом ножницами около 0,5 см от капиллярной чаевых.

Результаты

Запах, вызвала реакцию одного ORN к двум различным спирты показано на рисунке 3D. В зависимости от записи месте (сенсилл типа, размещение электродов) многоквартирных записи могут быть достигнуты.

Сырье внеклеточной сигнал от записи AL показано на рис 6А. По...

Обсуждение

Большинство сенсорные раздражители вызывают комбинаторных ответов, которые распределены по ансамбли нейронов. Таким образом, одновременный мониторинг нескольких нейронной активности необходимо понять, как стимул конкретной информации представлены и обработаны с помощью нейронных...

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить за финансирование этой работы: щедрое запуска средства из кафедрой биомедицинской инженерии в Университете Вашингтона, McDonnell центр неврологии системы грантов, Управление военно-морских исследований Грант (Grant #: N000141210089) в BR

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Имя Компания Номер в каталоге Комментарии
Электрофизиология оборудование
AC усилитель GRASS Модель P55 для одной записи сенсиллы
Аудио монитор (модель 3300) AM системы 940000
На заказ 16-канальный предварительный усилитель и усилитель Cal. Tech. Биология магазин электроники для AL и MB записей
Устройство сбора данных National Instruments BNC-2090
Волоконно-оптический свет WPI SI-72-8
Источник света 115 В WPI NOVA
Руководство микроманипулятора WPI M3301R для записи саранчи мозга
Stereomicroscope1 бум на стенде Leica M80 для записи саранчи мозга
Stereomicroscope2 Leica M205C для одной записи сенсиллы
Вибрация изоляции стол TMC 63-500 серии
Моторизованный микроманипулятора Sutter Instruments MP285 / T
Осциллограф Tektronix TD2014B
Электроды / Строительные инструменты
16-канальный электрод NeuroNexus A2x2-тет-3мм-150-121 для антенн записи доле
Боросиликатное капиллярные трубки с нитью, ID 0,69 мм Sutter Instruments BF120-69-10 для изготовления стеклянных электродов
Микропипетки съемник Sutter Instruments P-1000
Генератор функций Мультиметр склад SG1639A для позолоты электродов
Золотое покрытие решение (не цианид) SIFCO Industries NC SPS 5355
Сопротивление тестера BAK Электроника инк IMP-2 для позолоты электродов
Переключатель поворотный Electroswitch C7D0123N золото-PLating электродов
Импульсный изолятор WPI A365 для позолоты электродов
Q серии держатель электрода Warner Instruments 64-1091
Серебряная проволока 0,010 "диаметра AM системы 782500 заземляющего электрода
8-контактный разъем DIP IC Кристаллы и осцилляторы ED90032-ND
Боросиликатное капиллярные трубки с нитью, ID 0,58 мм Warner Instruments 64-0787 витой провод строительства тетрод
Тепловая пушка Weller 6966C
Rediohm-800 провод Kanthal Precision технологии PF002005
Титр шейкере ThermoНаучный 4625Q скручивания проводов
Карбид ножницы, 4,5 " Биомедицинских исследований Instr 25-1000 для резки витой тетрод
Изобразительное пинцетом точки HECO 91-EF5-SA для дразнить друг от друга проводов тетрод
Запах доставки
6 мл шприца Кендалл 1180600777 для специально созданных фильтр с активированным углем
Коричневые бутылки запах Рыбак 08-912-165
Древесный уголь BuyActivatedCharcoal.com GAC-48C
Осушитель Drierite 23005
Drierite осушки газа банке Фишер Научные 09-204
Термоусадочные трубки 3M EPS-200 Запах фильтр подготовки
Иглы для подкожных инъекций алюминия центр, манометр 19 Кендалл 8881-200136 для обеспечения входе и выходе линии для запаха бутылок
Минеральное масло Mallinckrodt химических веществ 6357-04 для запаха разбавление
Nalgene пластиковых труб, 890 FEP Thermo Scientific 8050-0310 для носителей поставки газа
Пневматические picopump WPI систем pv820 для запаха доставкой
Полиэтиленовые трубы ID 0,86 мм Intramedic 427421 для запаха бутылку выходе ConnectiДополнения и соленых труб изобилии
Пробки Лаборатория Чисто 97041 для герметизации запах бутылок
Время ленты PDC T-534-RP
Трубы Luer Cole-Parmer 30600-66
Вакуумная трубка McMaster-Carr 5488K66
Подготовка / Dissection
100 х 15 мм чашки Петри VWR International 89000-304
18 AWG медного многожильного провода Lapp Kabel 4510013 изоляция используется в качестве резиновых прокладок
22 AWG многожильный провод подключение Alphawire 1551 мозгплатформа
Батик воска Жаккард 7946000
Зубоврачебный воск периферии Henry Schein-стоматологический 6652151
Electrowaxer Almore Международного 66000
Эпоксидные, 5 мин Permatex 84101
Иглы для подкожных инъекций алюминия центр Кендалл 8881-200136
Протеаза из Streptomyces пзеиз Sigma-Aldrich P5147 для desheathing мозга саранчи
Шовный поток нестерильные Рыбак NC9087024 для связки живота после удаления кишки
Vetbond 3M 1469SB для герметизации утравычислением сайтов
Дюмон № 1 щипцов (грубо) WPI 500335
Дюмон # 5 титана щипцы (штраф) WPI 14096
Дюмон # 5SF щипцы (супер-тонкий) WPI 500085 desheathing мозга саранчи
10 см рассечение ножницами WPI 14393 для удаления ноги и крылья
Vannas ножницы (отлично) WPI 500086 для удаления кутикулы, резка кишки
Соленая Profusion
Набор удлинителей со скоростью регулятором потока Мур Медицинский 69136 для регулирования солевого потока
Внутривенного введения установлен сУ месте инъекции Мур Медицинский 73190 для регулирования солевого потока

Ссылки

  1. Ache, B. W., Young, J. M. Olfaction: diverse species, conserved principles. Neuron. 48, 417-430 (2005).
  2. Laurent, G., Wehr, M., Davidowitz, H. Temporal representations of odors in an olfactory network. Journal of Neuroscience. 16, 3837-3847 (1996).
  3. Stopfer, M., Jayaraman, V., Laurent, G. Odor identity vs. intensity coding in an olfactory system. Neuron. 39, 991-1004 (2003).
  4. Steven de Belle, J., Heisenberg, M. Associative odor learning in Drosophila abolished by chemical ablation of mushroom bodies. Science. 263, 692-695 (1994).
  5. Cassenaer, S., Laurent, G. Conditional modulation of spike-timing-dependent plasticity for olfactory learning. Nature. 482, 47-52 (2012).
  6. Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125, 143-160 (2006).
  7. Raman, B., Joseph, J., Tang, J., Stopfer, M. Temporally diverse firing patterns in olfactory receptor neurons underlie spatiotemporal neural codes for odors. Journal of Neuroscience. 30, 1994-2006 (2010).
  8. Perez-Orive, J., et al. Oscillations and sparsening of odor representations in the mushroom body. Science. 297, 359-365 (2002).
  9. Naraghi, M., Laurent, G. Odorant-induced oscillations in the mushroom bodies of the locust. The Journal of Neuroscience. 14, 2993-3004 (1994).
  10. Ochieng, S. A., Hallberg, E., Hansson, B. S. Fine structure and distribution of antennal sensilla of the desert locust, Schistocerca gregaria (Orthoptera: Acrididae). Cell and Tissue Research. 291, 525-536 (1998).
  11. Burrows, M., Laurent, G. Synaptic Potentials in the Central Terminals of Locust Proprioceptive Afferents Generated by Other Afferents from the Same Sense Organ. Journal of Neuroscience. 13, 808-819 (1993).
  12. Pouzat, C., Mazor, O., Laurent, G. Using noise signature to optimize spike-sorting and to assess neuronal classification quality. Journal of Neuroscience Methods. 122, 43-57 (2002).
  13. Mazor, O., Laurent, G. Transient dynamics versus fixed points in odor representations by locust antennal lobe projection neurons. Neuron. 48, 661-673 (2005).
  14. Christensen, T. A., Pawlowski, V. A., Lei, H., Hildebrand, J. G. Multi-unit recordings reveal context dependent modulation of synchrony in odor-specific neural ensembles. Nature Neuroscience. 3, 927-931 (2000).
  15. Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J. Vis. Exp. (36), e1725 (2010).
  16. Geffen, M. N., Broome, B. M., Laurent, G., Meister, M. Neural Encoding of Rapidly Fluctuating Odors. Neuron. 61, 570-586 (2009).
  17. Ito, I., Ong, R. C., Raman, B., Stopfer, M. Sparse odor representation and olfactory learning. Nature Neuroscience. 11, 1177-1184 (2008).
  18. Laurent, G. Olfactory network dynamics and the coding of multidimensional signals. Nature Review Neuroscience. 3, 884-895 (2002).
  19. Brown, S. L., Joseph, J., Stopfer, M. Encoding a temporally structured stimulus with a temporally structured neural representation. Nature Neuroscience. 8, 1568-1576 (2005).
  20. MacLeod, K., Laurent, G. Distinct mechanism for synchronization and temporal patterning of odor-encoding neural assemblies. Science. 274, 976-979 (1996).
  21. Wehr, M., Laurent, G. Relationship between afferent and central temporal patterns in the locust olfactory system. The Journal of Neuroscience. 19, 381-390 (1999).
  22. Moreaux, L., Laurent, G. Estimating firing rates from calcium signals in locust projection neurons in vivo. Frontiers in Neural Circuits. 1, 1-13 (2007).
  23. Galizia, C. G., Joerges, J., Kuttner, A., Faber, T., Menzel, R. A semi-in-vivo preparation for optical recording of the insect brain. Journal of Neuroscience Methods. 76, 61-69 (1997).
  24. Galan, R. F., Sachse, S., Galizia, C. G., Hez, A. V. M. Odor-driven attractor dynamics in the antennal lobe allow for simple and rapid olfactory pattern classification. Neural Computation. 16, 999-1012 (2004).
  25. Kuebler, L. S., Schubert, M., Karpati, Z., Hansson, B. S., Olsson, S. B. Antennal Lobe Processing Correlates to Moth Olfactory Behavior. Journal of Neuroscience. 32, 5772-5782 (2012).
  26. Silbering, A. F., Bell, R., Galizia, C. G., Benton, R. Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe. J. Vis. Exp. (61), e2976 (2012).
  27. Skiri, H. T., Galizia, C. G., Mustaparta, H. Representation of Primary Plant Odorants in the Antennal Lobe of the Moth Heliothis virescens Using Calcium Imaging. Chemical Senses. 29, 253-267 (2004).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Neuroscience71KenyonSchistocerca Americana

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены