Méthodes d&#39;enregistrement multi-unités pour caractériser l&#39;activité neuronale dans le Criquet (<em&gt; Schistocerca americana</em&gt; Circuits olfactifs)

Résumé

Nous démontrons variations de la technique d'enregistrement multi-unité extracellulaire de caractériser les odeurs réponses évoquées dans les trois premières étapes de la voie olfactive invertébrés. Ces techniques peuvent être facilement adaptés pour examiner l'activité d'ensemble dans d'autres systèmes neuronaux ainsi.

Résumé

Détection et interprétation des signaux olfactifs sont essentiels pour la survie de nombreux organismes. Remarquablement, les espèces à travers phylums ont étonnamment semblables systèmes olfactifs qui suggère que l'approche biologique pour la détection chimique a été optimisé au fil du temps l'évolution ^1. Dans le système olfactif des insectes, agents odorants sont transduites par les neurones récepteurs olfactifs (ORN) à l'antenne, qui convertit les stimuli chimiques dans des trains de potentiels d'action. La stimulation sensorielle des ORNs est ensuite relayée à l'lobe antennaire (AL; une structure analogue au bulbe olfactif des vertébrés). Dans l'AL, représentations neuronales des odeurs prendre la forme de schémas spatio-temporels de tir répartis dans des ensembles de neurones principaux (PNS; aussi appelé neurones de projection) ^2,3. La sortie AL est ensuite traitée par des cellules de Kenyon (KCS) dans le corps de champignon aval (MB), une structure associée à la mémoire et de l'apprentissage olfactif ^4,5. Sone, nous présentons les techniques d'enregistrement électrophysiologiques pour contrôler les odeurs évoquées réponses neuronales dans ces circuits olfactifs.

Tout d'abord, nous présentons une méthode unique d'enregistrement sensille pour étudier les odeurs réponses évoquées au niveau des populations de ORNs ^6,7. Nous discutons de l'utilisation de pipettes en verre remplis de solution saline aiguisés comme des électrodes pour surveiller les réponses extracellulaire RRO. Ensuite, nous présentons une méthode pour surveiller les réponses extracellulaire PN en utilisant un spot publicitaire de 16 canaux électrode ^3. Une approche similaire en utilisant une tétrode sur mesure fil 8-channel torsadée est démontré pour les cellules de Kenyon enregistrements ^8. Nous fournissons des détails de notre dispositif expérimental et présentent des traces d'enregistrement représentatifs de chacune de ces techniques.

Protocole

1. Préparation d'odeur et de livraison

1. Des solutions diluées d'odeurs dans une huile minérale en volume pour obtenir le niveau de concentration désiré. Stocker un mélange 20 ml d'huile minérale et la matière odorante dans une bouteille en verre 60 ml. Insérer deux aiguilles de seringue dans un bouchon en caoutchouc (calibre 19), une au fond et l'autre par le haut, pour fournir une entrée et une ligne de sortie. Placer la bouteille en verre avec bouchon en caoutchouc et ce attachent une coutume conçue filtre à charbon actif à la ligne d'entrée (figure 1A).
2. Le filtre à charbon est faite en utilisant deux 6 seringues ml. Couper les seringues en deux et jetez l'extrémité du piston. Remplir chacune des pièces restantes avec du coton et du charbon actif avant de les raccorder ensemble à l'aide d'un tube thermorétrécissable.
3. Connecter la ligne de sortie de la bouteille d'odeur (en utilisant des tubes de polyéthylène, ID 0,86 mm) sur le tube en matière plastique (tubes Nalgene FEP, ID 5,8 mm) qui fournit un débit d'air constant à travers l'antenne (figure 1B ).
4. Liaison directe carbone-filtré, l'air déshumidifié (gaz porteur; débit, 0,75 L / min) en direction de la sauterelle l'aide d'un tube en plastique placé à l'intérieur de quelques centimètres de l'antenne acridienne.
5. Pour la stimulation de l'odeur, de déplacer un volume constant (0,1 l / min) de l'espace de tête statique au-dessus de la solution d'odeur dans la bouteille. Ce résultat est obtenu par injection d'une quantité égale d'air déshumidifié dans la bouteille à l'aide d'une pompe à Pico (WPI, PV-820). Les vapeurs de la bouteille d'odeur sont dirigés à travers la conduite de sortie sur le tube d'air (figure 1B).
6. Retirez les vapeurs odorantes livrés en plaçant un entonnoir vide ~ 10 cm derrière l'antenne acridienne.

2. Préparation d'antenne criquet pèlerin dans l'enregistrement sensille unique

1. Sélectionnez un criquet jeunes adultes des deux sexes avec cuisine entièrement pousser des ailes, mais avant l'étape de l'accouplement d'une colonie surpeuplée. Pour limiter la sauterelle, d'abord amputer ses jambes. Sceller les sites d'amputation avec de la colle tissulaire (Vetbond, 3M). T sécuriséil criquets dans une chambre spécialement conçu à l'aide d'un petit morceau de ruban électrique drapé autour de son thorax (figure 2A).
2. Sous un microscope de dissection, faire un sillon peu profond dans la plate-forme de cire (figure 2A) pour l'installation des antennes. Placer l'antenne dans la rainure et de la stabiliser à l'aide de cire batik aux deux extrémités de l'antenne (figure 2B; une electrowaxer est utilisée pour faire fondre la cire).
3. Insérez une électrode de masse (fil d'argent chloruré) dans le thorax (~ 1 cm de la tête). Utiliser de la cire batik à la fois le sceau de l'endroit de l'incision et maintenir le fil de masse en place (figure 2A).

3. Enregistrement sensille unique pour surveiller odeur évoqués réponses des neurones récepteurs olfactifs (ORNs)

1. Placez l'antenne criquets stabilisée sous un stéréomicroscope (Leica M205C) sur une table isolation contre les vibrations (TMC) (figure 3A). Assurez-vous que la base de la sensille enregistrement est évidentment visible (figure 3B).
2. Utilisez un extracteur micropipette (Sutter P-1000) pour fabriquer des électrodes de verre (impédance 3-10 MQ lorsqu'il est rempli de solution saline criquets ^9, um Embout de diamètre 1-3) à l'aide d'un tube capillaire en verre de borosilicate (OD 1,2 mm, 0,69 mm ID).
3. Placer l'électrode de verre dans un support micropipette qui est attaché à un micromanipulateur motorisé (Sutter MP-285). Insérez doucement l'électrode dans la base d'un sensille (figure 3B). Notez que chaque sensille peut contenir 3-50 ORNs des criquets ^10.
4. Amplifier le signal (10.000 fois) à l'aide d'un amplificateur à courant alternatif (Grass P-55). Filtrer le signal entre 0,3 à 10,0 kHz et d'acquérir à un taux d'échantillonnage de 15 kHz (figure 3D) en utilisant un système d'acquisition de données (LabView, PCI-MIO-16E-4 cartes d'acquisition de données; National Instruments).

4. Procédure Dissection criquet pèlerin dans l'lobe antennaire et enregistrements corps pédonculé

1. Suivez le restrainiprocédures ng tel que décrit dans la section 2.1. Placez la sauterelle dans une chambre de mesure conçu comme le montre la figure 4A et B.
2. Pour perfuser une solution saline pendant et après la procédure de dissection, de construire une tasse de cire autour de la tête acridienne. La coupe de la cire doit commencer juste au-dessus des parties de mâchoire, et s'étendent au-delà des yeux composés englobant la zone située entre les deux antennes comme représenté sur la figure 4C.
3. Pour permettre à l'antenne de passer à travers la coupe de la cire, de créer de petits tunnels sur les deux côtés à l'aide de plastique (polyéthylène) tube (5 mm de long, 0,86 mm ID). Assurez-vous que le tuyau en plastique peut glisser à travers la coupelle de cire. Celle-ci est obtenue en utilisant un joint en caoutchouc qui s'enroule fermement autour du tube en matière plastique, mais est fixé à la cire tasse (figure 4C).
4. À l'aide de résine époxy, fixer la base de l'antenne à l'extrémité inférieure du tube en matière plastique. Cette étape permet de s'assurer que les antennes sont maintenus en place même après l'entourecuticule est retiré.
5. Maintenez la tasse de cire remplis de solution saline ⁹ de ce point en avant. Commencer par enlèvement d'une région rectangulaire centrale entre les deux antennes (le côté plus long du rectangle aligné avec l'axe antéro-postérieur). Par la suite, enlever la cuticule dans les régions voisines sans déranger les yeux composés et les cuticules à la base de l'antenne (figure 4D).
6. En utilisant des pinces fines, retirer délicatement les sacs aériens et des organismes de graisse entourant le cerveau. A la fin de cette étape, le cerveau antiacridienne doit être clairement visible (figure 4D). On notera que les régions du cerveau qui traitent l'information olfactive (avec pigmentation jaune clair) sont situés entre les deux antennes.
7. Dans l'intestin criquets passe sous le cerveau et le long de la longueur du corps. Pour empêcher le mouvement de l'intestin à partir de potentiellement déstabilisant la préparation, tirez doucement sur l'intestin antérieur et le couper à l'aide de ciseaux fins. Faire une petite incision dans l'abdomen, justeau-dessus du rectum et retirer l'intestin en tirant le gros intestin avec des pinces grossières. Pour éviter une fuite de solution saline, attachez l'abdomen juste avant l'incision avec des fils de suture.
8. Utiliser une petite plate-forme constitué d'un fil mince revêtu d'une fine couche de cire pour élever le cerveau et la stabiliser au cours de l'électrophysiologie ¹¹ comme représenté sur la Figure 4D.
9. Le cerveau d'insecte est recouvert d'une gaine isolante mince qui doit être éliminée avant les expériences. Pour desheath le cerveau, écartez doucement une petite quantité d'une enzyme (0,3-0,4 mg de protéase, Sigma Aldrich) sur la surface du cerveau à l'aide de pinces fines ^9. Après s ~ 5-10 enzyme d'application, laver soigneusement le cerveau avec une solution saline. Utilisation ultra-fines pinces très doucement pincer et tirer la gaine et ensuite déchirer l'ouvrir sur les lieux d'enregistrement (AL et MB; montré dans la figure 4E, F).

5. Multi-unit enregistrements du lobe antennaire etle Conseil de champignons

1. Placez la préparation criquets (figure 5A) sous un stéréomicroscope suspendu à un pied perche placée sur une table isolation contre les vibrations.
2. Maintenir un taux de perfusion constante de solution saline (environ 0,04 L / h) tout au long de l'expérience. Utilisez un fil d'argent chloruré immergé dans la tasse de cire rempli de solution saline dans l'électrode de masse.
3. Pour les enregistrements PN, utiliser un 16-canal en silicium sonde (Technologies NeuroNexus, article # a2x2-tet-3mm-150-150-121-A16, figure 5B). Avant chaque expérience, la galvanoplastie les électrodes d'or pour atteindre impédances dans la gamme 200-300 kW. Utilisez le circuit représenté sur la figure 7 pour la galvanoplastie.
4. Placez l'électrode près de la surface du lobe antennaire et doucement l'insérer dans le tissu à l'aide d'un micromanipulateur manuel (WPI, M3301R) (figure 5D).
5. Avancer l'électrode dans ~ 10 étapes um. Attendez 2-3 min à chaque étape et d'évaluer l'acquisitionla qualité du signal d. Dans un site d'enregistrement idéal, les signaux extracellulaires sera repris par plusieurs canaux d'enregistrement et aura un fort rapport signal sur bruit (SNR> 3-5 fois le bruit DS).
6. Pour les enregistrements KC, utilisez une tétrode sur mesure torsadée (figure 5C; procédé de fabrication étape par étape présentée dans la section 6). Galvanoplastie ces électrodes comme indiqué à l'étape 5.3. Placez la tétrode sur la surface de la MB (figure 5E) comme KC somata sont limitées à la couche superficielle de la MB ^8.
7. Les deux PN et enregistrements KC peut être faite en même temps de la préparation criquets comme représenté schématiquement sur ​​la figure 5A.
8. Attendre au moins 15 minutes après avoir trouvé l'emplacement d'enregistrement pour permettre la stabilisation des électrodes.
9. Acquérir tous les signaux extracellulaires à 15 kHz, filtre entre 0,3 à 6 KHz, et amplifier (10000 fois) en utilisant un amplificateur à 16 canaux AC (Biologie Electronics Boutique, Caltech, Pasadena, CA) (La figure 6A, B).

6. Procédures pour rendre fil-électrode Twisted pour les enregistrements KC

1. Pour concevoir une électrode multi-unités pour les enregistrements KC, utilisez un fil isolé nickel-chrome (RO800, 0,0005 "filament) ^8.
2. Si huit électrodes sont souhaitées, puis enrouler le fil autour d'un morceau de 10-15 cm de long sur carton 4 fois. Les extrémités du carton peut être recouverte avec un tube en matière plastique pour éviter que les bords de coupe du fil. Bien emballage, assurez-vous il ya peu de jeu, mais faire en sorte que le fil n'est pas tendu. Manipuler le fil avec précaution car il se casse facilement.
3. Bunch les fils ensemble en haut du carton et utiliser un morceau de ruban adhésif (bande du temps, T-534-RP) pour les maintenir ensemble. Couper les brins à l'autre extrémité. Retirer les brins de fil et les fils du groupe à l'extrémité coupée et une autre pièce à l'aide de la bande.
4. L'utilisation d'un titre Agitateur de plaque (Thermo Scientific, Modèle 4625Q), le vent les brins ensemble (~ 72 tr / min pendant 3min) pour former un fil torsadé. Le fond des brins enregistrées peuvent être coupés à la plaque de rotor titre et le haut peut être fixé à un pied perche. Pendant le bobinage, le fil doit avoir peu de mou, mais ne pas être tendu.
5. Faire fondre l'isolation avec un pistolet à air chaud (Weller 6966C) pour coller les brins ensemble et forment un seul fil. 3-4 passes lentes (3-4 sec pièce) sur la longueur du fil doit être suffisante pour chauffer et fondre les brins ensemble. Relâchez ensuite le fil du bas et lui permettre de se détendre. Coupez le fil près des extrémités pour retirer la cassette.
6. Insérer une extrémité du fil à travers un tube de verre 5-6 cm de long, capillaire (OD 1,0 mm, 0,58 mm ID). Démêler le fil torsadé à une extrémité à l'aide des pinces fines et retirer le revêtement en très brièvement le feu à la fin à l'aide d'une flamme. Cette étape doit être effectuée avec soin; exposer le fil à la flamme pendant trop longtemps entraîne les fils pour faire fondre et sans enchevêtrement.
7. Séparez délicatement les 8 brins à l'extrémité d'une flambéee à souder chaque brin séparément dans une prise à 8 broches IC. Manteau de la partie supérieure de la douille IC avec un époxy pour tenir les fils de verre et capillaire en place. Également placer une petite goutte d'époxy à l'autre extrémité du capillaire pour maintenir le fil en place (Figure 5C).
8. Enfin, couper le bout du fil à un angle de 45 degrés avec des ciseaux carbure d'environ 0,5 cm de l'extrémité du capillaire.

Résultats

Réponses aux odeurs évoquées d'une ORN unique à deux alcools différents sont présentés dans la figure 3D. Selon le lieu d'enregistrement (type sensilles, le placement de l'électrode) à unités multiples enregistrements peuvent être réalisés.

Une forme d'onde brute extracellulaire partir d'un enregistrement AL est illustré à la figure 6A. Les potentiels d'action ou les pics d'amplitudes variables provenant de différe...

Discussion

Stimuli sensoriels les plus évoquer des réponses combinatoires qui sont distribués sur des ensembles de neurones. Par conséquent, la surveillance simultanée de plusieurs neurones activité est nécessaire de comprendre comment relance des informations spécifiques sont représentées et traitées par des circuits neuronaux dans le cerveau. Ici, nous avons démontré extracellulaires techniques d'enregistrement à logements multiples pour caractériser les odeurs réponses évoquées au cours des trois premiers ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
			Equipement d'électrophysiologie
AC amplificateur	GRASS	Modèle P55	pour les enregistrements sensille unique
Audio moniteur (modèle 3300)	Systèmes AM	940000
Custom-made 16 canaux pré-amplificateur et amplificateur	Californie Tech. Biologie Electronics Boutique		pour les enregistrements et AL MB
Unité d'acquisition de données	National Instruments	BNC-2090
Éclairage à fibres optiques	WPI	SI-72-8
Source lumineuse 115 V	WPI	NOVA
Micromanipulateur Manuel	WPI	M3301R	pour les enregistrements du cerveau criquets
Stereomicroscope1 sur la perche	Leica	M80	pour les enregistrements du cerveau criquets
Stereomicroscope2	Leica	M205C	pour les enregistrements sensille unique
Vibrations isolement de table	TMC	63-500 série
Micromanipulateur motorisé	Sutter Instruments	MP285 / T
Oscilloscope	Tektronix	TD2014B
			Électrodes / Outils de Construction
16-canal électrode	NeuroNexus	A2x2-tet-3mm-150-121	pour les enregistrements lobe antennaire
Borosilicate tubes capillaires à filament, ID 0,69 mm	Sutter Instruments	BF120-69-10	pour la fabrication d'électrodes de verre
Micropipette extracteur	Sutter Instruments	P-1000
Générateur de fonction	Multimètre Entrepôt	SG1639A	pour surréglementation électrodes
Solution de placage d'or (non cyanure)	SIFCO Industries	NC SPS 5355
Testeur d'impédance	BAK Electronics Inc	IMP-2	pour surréglementation électrodes
Commutateur rotatif	Electroswitch	C7D0123N	de l'or-jélectrodes ating
Pulse isolateur	WPI	A365	pour surréglementation électrodes
Porte-électrode Q série	Warner Instruments	64-1091
Fil d'argent 0,010 "de diamètre	Systèmes AM	782500	électrode de masse
8 broches DIP IC socket	Digikey	ED90032-ND
Borosilicate tubes capillaires à filament, ID 0,58 mm	Warner Instruments	64-0787	torsadée construction tétrode fil
Pistolet à air chaud	Weller	6966C
Rediohm-800 fil	Kanthal Precision Technologies	PF002005
Titre Agitateur de plaque	ThermoScientifique	4625Q	fils de torsion
Ciseaux Carbure, 4,5 "	Recherche biomédicale Instr	25-1000	pour la coupe de fils torsadés tétrode
Pince à épiler à pointe fine	HECO	91-EF5-SA	pour les fils tétrode taquiner dehors
			Livraison odeur
6 ml seringue	Kendall	1180600777	spécialement conçu pour filtre à charbon actif
Bouteilles d'odeur Brown	Pêcheur	08-912-165
Charbon de bois	BuyActivatedCharcoal.com	GAC-48C
Déshydratant	Drierite	23005
Drierite gaz de séchage pot	Fischer Scientific	09-204
Tubes thermorétrécissables	3M	EPS-200	préparation filtre à odeurs
Moyeu en aluminium aiguille hypodermique, de calibre 19	Kendall	8881-200136	pour fournir des lignes d'entrée et de sortie pour les bouteilles d'odeur
Huile minérale	Produits chimiques Mallinckrodt	6357-04	dilution de l'odeur
Nalgene tubes en plastique, 890 FEP	Thermo Scientific	8050-0310	pour la livraison de gaz porteur
Pneumatique picopump	WPI	sys-pv820	pour la livraison d'odeur
Tube ID polyéthylène 0,86 mm	Intramedic	427421	l'odeur bouteille sortie de connections et des tubes profusion solution saline
Échec	Lab pur	97041	pour assurer l'étanchéité des bouteilles d'odeur
La durée de bande	PDC	T-534-RP
Tubes Luer	Cole-Parmer	30600-66
Tube à vide	McMaster-Carr	5488K66
			Préparation / Dissection
100 x 15 mm boîte de Pétri	VWR International	89000-304
18 AWG toronné en cuivre	Lapp Kabel	4510013	isolation des fils est utilisé comme joints en caoutchouc
22 AWG branchement brin	Alphawire	1551	cerveauplate-forme
Batik cire	Jacquard	7946000
Cire dentaire périphérie	Henry Schein	6652151
Electrowaxer	Almore international	66000
Epoxy, 5 min	Permatex	84101
Moyeu en aluminium aiguille hypodermique	Kendall	8881-200136
Protéase de Streptomyces griseus	Sigma-Aldrich	P5147	pour dégainage cerveau criquets
Fil de suture non stérile	Pêcheur	NC9087024	pour attacher l'abdomen après l'élimination intestinale
Vetbond	3M	1469SB	pour assurer l'étanchéité amputation des sites
Dumont # 1 pince (grossier)	WPI	500335
Dumont n ° 5 de titane forceps (fin)	WPI	14096
Dumont # 5SF forceps (super fine)	WPI	500085	dégainage cerveau criquets
10 cm dissection ciseaux	WPI	14393	de suppression de pattes et les ailes
Ciseaux Vannas (fin)	WPI	500086	pour enlever les cuticules, coupe l'intestin antérieur
			Profusion Saline
Kit d'extension avec régulateur de débit	Moore Medical	69136	pour réguler l'écoulement salin
Administration IV réglé avecSite d'injection Y	Moore Medical	73190	pour réguler l'écoulement salin