Multi-unidade Métodos de gravação para caracterizar a atividade neural no Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Circuitos olfatórias

Resumo

Nós demonstramos as variações da técnica de gravação extracelular de multi-unidade para caracterizar odor evocadas respostas nas três primeiras etapas da via olfactiva invertebrado. Estas técnicas podem ser facilmente adaptados para examinar a actividade conjunto de outros sistemas neurais também.

Resumo

Detecção e interpretação de sinais olfativos são críticos para a sobrevivência de muitos organismos. Notavelmente, espécies em filos têm notavelmente semelhantes sistemas olfativos sugerindo que a abordagem biológica para sensoriamento químico foi otimizado ao longo do tempo evolutivo ^1. No sistema de insecto olfactivo, odorantes são transduzidas por neurónios receptores olfactivos (ORN) na antena, que convertem a estímulos químicos em trens de potenciais de acção. Entrada sensorial dos ORNs é então enviada para o lobo antenal (AL; uma estrutura análoga ao bulbo olfativo de vertebrados). Na AL, representações neurais para odores assumir a forma de espaço-temporais padrões de disparo distribuídos em conjuntos de neurônios principais (PNs, também referido como neurônios de projeção) ^2,3. A saída AL é posteriormente processado por células de Kenyon (KCS) no corpo de cogumelo a jusante (MB), uma estrutura associada com a memória e aprendizagem olfactiva ^4,5. Suae, apresentamos as técnicas de gravação eletrofisiológicos para monitorar odor evocadas respostas neurais nesses circuitos olfativos.

Em primeiro lugar, apresenta-se um método de gravação única sensillum para estudar as respostas evocadas de odor ao nível das populações de ORNs ^6,7. Discute-se o uso de soro fisiológico cheios pipetas de vidro afiados como eletrodos para monitorar as respostas extracelularmente ORN. A seguir, apresentamos um método para monitorar as respostas extracelularmente PN usando um eletrodo de 16 canais comerciais ^3. Uma abordagem semelhante, usando uma custom-made tetrode fio de 8 canais torcida é demonstrado para Kenyon célula gravações ^8. Nós fornecemos detalhes de nossa montagem experimental e traços representativos presentes de gravação para cada uma destas técnicas.

Protocolo

1. Preparação odor e Entrega

1. Soluções diluídas de odor em óleo mineral, em volume, para atingir o nível desejado de concentração. Armazenar uma mistura de 20 ml de óleo mineral e o odorante num frasco de vidro de 60 ml. Insira duas agulhas de seringa em um tampão de borracha (calibre 19), um a partir da parte inferior e o outro a partir do topo, para proporcionar uma entrada e uma linha de saída. Selar a garrafa de vidro com rolha de borracha e deste anexar um personalizada filtro de carvão activado para a linha de entrada (Figura 1A).
2. O filtro de carbono é feito utilizando duas seringas 6 ml. Corte as seringas ao meio e descarte final êmbolo. Preencha cada um dos pedaços restantes com algodão e carvão ativado antes de conectá-los em conjunto, utilizando tubo termorretráctil.
3. Ligue a linha de saída da garrafa odor (utilizando tubagem de polietileno, ID 0,86 milímetros) para o tubo de plástico (Nalgene Tubing FEP, ID 5,8 mm), que fornece um fluxo de ar constante através da antena (Figura 1B ).
4. Directa carbono-filtrada ar desumidificado (gás portador; caudal, 0,75 L / min) na direcção do locusta, utilizando um tubo de plástico colocados dentro de poucos cm da antena gafanhoto.
5. Para a estimulação odor, deslocar um volume constante (0,1 L / min) do espaço de cabeça acima da solução estática odor na garrafa. Isto é conseguido através da injecção de uma quantidade igual de ar desumidificado dentro da garrafa utilizando uma bomba de Pico (WPI, PV-820). Os vapores do frasco odor são dirigidos através da linha de saída de fluxo de ar no tubo (Figura 1B).
6. Remover os vapores de odores emitidos pela colocação de um funil de vácuo ~ 10 cm atrás da antena gafanhoto.

2. Preparando Antena Locust para Gravação Sensillum Único

1. Selecione um gafanhoto jovens adultos de ambos os sexos com totalmente crescidas asas, mas antes da fase de acasalamento de uma colônia lotado. Para conter o gafanhoto, primeiro amputar suas pernas. Selar os locais de amputação com adesivo de tecido (Vetbond, 3M). T seguroele gafanhotos para uma câmara projetado utilizando um pequeno pedaço de fita isolante envolto em torno de seu tórax (Figura 2A).
2. Sob um microscópio de dissecação, fazer um sulco raso na plataforma de cera (Figura 2A), para a colocação da antena. Coloque a antena no interior da ranhura e estabilizá-lo usando cera batik nas duas extremidades da antena (Figura 2B; uma electrowaxer é utilizado para fundir a cera).
3. Inserir um eletrodo de aterramento (fio de prata clorada) no tórax (~ 1 cm de distância da cabeça). Use cera batik tanto o selo do local da incisão e segure o fio terra no lugar (Figura 2A).

3. Gravação Sensillum única para acompanhar Odor evocadas respostas dos neurônios receptores olfativos (ORNs)

1. Coloque a antena locust estabilizado sob um estereomicroscópio (Leica M205C) sobre uma mesa de isolamento de vibrações (TMC) (Figura 3A). Certifique-se de que a base do sensillum gravação é claraly visível (Figura 3B).
2. Use um extrator micropipeta (Sutter P-1000) para o fabrico de eléctrodos de vidro (impedância de 3-10 MQ quando preenchidos com a solução salina locust ^9, ponta 1-3 um de diâmetro) usando um tubo capilar de vidro de borossilicato (1,2 mm OD, ID 0,69 milímetros).
3. Coloque o eléctrodo de vidro num suporte de micropipeta que está anexado a um micromanipulador motorizado (Sutter MP-285). Insira cuidadosamente o eléctrodo na base de uma sensillum (Figura 3B). Note-se que cada sensillum pode conter 3-50 ORNs em gafanhotos ^10.
4. Amplificar o sinal (10000 vezes) usando um amplificador AC (Grass P-55). Filtrar o sinal entre 0,3-10,0 kHz e adquirir a uma taxa de amostragem de 15 kHz (Figura 3D), utilizando um sistema de aquisição de dados (LabView, cartões de PCI-MIO-16E-4 DAQ; National Instruments).

4. Procedimento Locust Dissecção para o lobo antenal e gravações corpo Cogumelo

1. Siga o restraining procedimentos como descrito na seção 2.1. Posicionar o gafanhoto em uma câmara desenhada de encomenda, como se mostra na Figura 4A e B.
2. Para perfundir salina durante e após o procedimento de dissecção, construir uma xícara de cera ao redor da cabeça de gafanhotos. O copo de cera deve começar logo acima das partes da boca, e ultrapassam os olhos compostos que abrangem a região entre a duas antenas, como mostrado na Figura 4C.
3. Para permitir que as antenas de passar através do copo de cera, criar pequenos túneis em ambos os lados utilizando plástico (polietileno) tubagem (5 mm de comprimento, 0,86 mm de diâmetro interno). Certifique-se que o tubo plástico pode deslizar através da taça de cera. Este último é conseguido através de uma junta de borracha, que envolve estreitamente o tubo de plástico, mas está ligado à taça de cera (Figura 4C).
4. Usando a resina epóxi, anexar a base das antenas para a extremidade inferior do tubo de plástico. Este passo assegura que as antenas são mantidas no lugar, mesmo depois de a envolventecutícula é removido.
5. Mantenha o copo cera preenchido com solução salina ⁹ a partir deste ponto. Começar pela remoção de uma região central rectangular entre as antenas de dois (lado mais comprido do rectângulo alinhada com o eixo ântero-posterior). Subsequentemente, remover cutícula nas regiões vizinhas, sem perturbar os olhos compostos e cutícula na base da antena (Figura 4D).
6. Usando uma pinça fina, retire sacos aéreos e corpos de gordura que envolvem o cérebro. No final desta etapa, o cérebro locust deve ser claramente visto (Figura 4D). Note-se que as regiões do cérebro que processam a informação olfactiva (com pigmentação amarela clara) estão situados entre as antenas de dois.
7. Em gafanhotos intestino corre abaixo do cérebro e ao longo do comprimento do corpo. Para impedir o movimento do intestino de potencialmente desestabilizar a preparação, puxe o estômago e cortar com uma tesoura fina. Fazer uma pequena incisão no abdómen apenasacima do recto e remover o intestino do intestino posterior, puxando com pinças grosseiras. Para evitar uma fuga de solução salina, amarrar o abdômen imediatamente anterior ao local da incisão com fios de sutura.
8. Use uma pequena plataforma feita de um arame fino revestido com uma fina camada de cera para elevar o cérebro e estabilizá-la durante ¹¹ electrofisiologia, como mostrado na Figura 4D.
9. O cérebro de insectos é coberta por uma fina bainha de isolamento que tem de ser removido antes da experimentação. Para desheath cérebro, delicadamente espalhar uma pequena quantidade de uma enzima (protease 0,3-,4 mg, Sigma Aldrich) ao longo da superfície do cérebro com uma pinça fina ^9. Depois de ~ 5-10 s de aplicação de enzima, lavar o cérebro completamente com solução salina. Usando super-finos fórceps muito aperte suavemente e puxe a bainha e, subsequentemente, rasgá-lo aberto sobre os locais de gravação (AL e MB; mostrado na Figura 4E, F).

5. Gravações multi-unidade do lobo antenal eCorpo Cogumelo

1. Coloque a preparação locust (Figura 5A), sob um estereomicroscópio suspenso de um suporte de lança colocada sobre uma mesa de isolamento de vibrações.
2. Manter uma taxa constante de perfusão de solução salina (cerca de 0,04 L / h) durante toda a experiência. Use um fio de prata clorada imerso no copo cheio de cera salina como o eletrodo terra.
3. Para gravações PN, use um de 16 canais de silício sonda (NeuroNexus, item # A2x2-tet-3mm-150-150-121-A16, Figura 5B). Antes de cada experiência, galvaniza os eléctrodos de ouro para conseguir impedâncias na gama de 200-300 kW. Usar o circuito mostrado na Figura 7 para a galvanoplastia.
4. Posicionar o eléctrodo próximo da superfície do lobo antenal e inseri-lo suavemente para dentro do tecido utilizando um micromanipulador manual (WPI, M3301R) (Figura 5D).
5. Avançar o eletrodo em ~ 10 passos jam. Espere 2-3 minutos em cada etapa e avaliar a adquirird qualidade do sinal. Em um local ideal a gravação, sinais extracelulares será apanhada por vários canais de gravação e terá uma relação sinal-para-ruído elevado (SNR> 3-5 vezes o ruído SDs).
6. Para gravações de KC, use uma custom-made tetrode fio torcido (Figura 5C; passo-a-passo procedimento de fabricação apresentado na Seção 6). Galvaniza estes eléctrodos como discutido no passo 5.3. Coloque a tetrode sobre a superfície do MB (Figura 5E), como KC somata estão restritas à camada superficial do MB ^8.
7. Ambos PN e gravações KC podem ser feitas simultaneamente de preparação locust mesma como mostrado esquematicamente na Figura 5A.
8. Espere pelo menos 15 minutos depois de encontrar o local de gravação para permitir a estabilização dos eletrodos.
9. Adquira todos os sinais extracelulares em 15 KHz, filtro entre 0,3-6 KHz, e amplificar (10.000 vezes) usando um amplificador de 16 canais AC (Biologia Eletrônica Shop; Caltech, em Pasadena, CA) (A Figura 6A, B).

6. Procedimentos para tornar arame trançado para gravações de KC

1. Para criar uma unidade de multi-eletrodo para gravações de KC, use fio de cromo isolados níquel (RO800, 0,0005 filamento ") ^8.
2. Se oito eletrodos são desejados em seguida, enrole o fio em torno de um pedaço 10-15 cm de comprimento de papelão 4 vezes. As extremidades do cartão pode ser coberto com tubo de plástico para evitar que as arestas de corte do fio. Enquanto embalagem, certifique-se há pouco de folga, mas garantir que o fio não é tenso. Lidar com o fio com cuidado, pois quebra facilmente.
3. Bunch os fios juntos no topo da cartolina e usar um pedaço de fita (fita Tempo, T-534-RP) para mantê-los juntos. Corte os fios na outra extremidade. Retire os fios de arame e agrupar os fios no final corte bem usando outro pedaço de fita.
4. Usando um título agitador de placas (Thermo Scientific, modelo 4625Q), o vento os fios juntos (~ 72 rev / min para 3min), para formar um fio torcido. A parte inferior das costas gravadas pode ser cortada para a placa de titulação de rotor e a parte superior pode ser preso a um suporte de barra. Durante sinuoso, o fio deve ter pouco de folga, mas não devemos ser tenso.
5. Derreta o isolamento juntamente com uma pistola de calor (Weller 6966C) para furar as costas individuais juntos e formar um único fio. 3-4 passagens lentas (3-4 segundos cada) ao longo do comprimento do fio deve ser suficiente para aquecer e fundir os fios juntos. Em seguida, solte o fio a partir do fundo e permitir que ele relaxe. Apare o fio perto das extremidades para remover a fita.
6. Insira uma extremidade do fio através de um tubo de vidro de 5-6 cm de comprimento, capilar (OD 1,0 mm, 0,58 mm ID). Desmembrar o fio torcido em uma extremidade com uma pinça fina e remover o revestimento de forma muito breve torching final utilizando uma chama. Esta etapa deve ser feito com cuidado, expondo o fio à chama por muito tempo fará com que os fios derretam e emaranhado.
7. Suavemente separar os 8 fios na extremidade de um inflamadoª solda fio cada um separadamente em um soquete IC 8 pinos. Revestir a parte superior do encaixe IC com epoxi para segurar os fios de vidro capilar e no lugar. Também colocar uma pequena gota de epoxy na outra extremidade do capilar para manter o fio no lugar (Figura 5C).
8. Finalmente, corte a ponta do fio a um ângulo de 45 graus com o carboneto de tesoura de cerca de 0,5 cm da ponta capilar.

Resultados

Respostas evocadas de odor de um único ORN para dois álcoois diferentes são apresentados na Figura 3D. Dependendo do local de gravação (sensilas tipo, a colocação do eléctrodo) com várias unidades gravações podem ser alcançados.

Uma forma de onda em bruto extracelular de uma gravação AL é mostrado na Figura 6A. Os potenciais de acção ou picos de amplitudes diferentes provenientes de diferentes PNs pode ser observado neste rastreio de tensão...

Discussão

Estímulos sensoriais mais evocar respostas combinatórias que são distribuídos em conjuntos de neurônios. Por isso, a monitorização simultânea de múltiplos neurónios actividade é necessário compreender como estímulo específico informação é representada e processado por circuitos neuronais no cérebro. Aqui, nós demonstramos extracelulares técnicas de multi-unidade de gravação para caracterizar odor evocadas respostas para os três primeiros centros de processamento ao longo da via inseto olfativo. No...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome	Companhia	Número de catálogo	Comentários
			Eletrofisiologia Equipamento
AC amplificador	GRAMA	Modelo P55	para gravações sensillum individuais
Áudio monitor (modelo 3300)	Sistemas AM	940000
Feito por encomenda de 16 canais pré-amplificador e amplificador	Cal. Tech. Biologia Eletrônica Loja		para gravações de AL e MB
Unidade de aquisição de dados	National Instruments	BNC-2090
Luz de fibra óptica	WPI	SI-72-8
Fonte de luz 115 V	WPI	NOVA
Micromanipulador manual	WPI	M3301R	para as gravações do cérebro de gafanhotos
Stereomicroscope1 em stand boom de	Leica	M80	para as gravações do cérebro de gafanhotos
Stereomicroscope2	Leica	M205C	para gravações sensillum individuais
Vibração isolamento tabela	TMC	63-500 série
Micromanipulador motorizada	Sutter Instruments	MP285 / T
Osciloscópio	Tektronix	TD2014B
			Eletrodos / Ferramentas de construção
16 canais eletrodo	NeuroNexus	A2x2-tet-3mm-150-121	para as gravações do lobo antenal
Borosilicato tubos capilares com filamento, ID 0,69 milímetros	Sutter Instruments	BF120-69-10	para fazer eléctrodos de vidro
Micropipeta extrator	Sutter Instruments	P-1000
Gerador de função	Multímetro Armazém	SG1639A	por excesso de regulamentação eletrodos
Solução cosmética (não cianeto)	SIFCO Industries	NC SPS 5355
Testador de impedância	BAK Electronics Inc.	IMP-2	por excesso de regulamentação eletrodos
Comutador rotativo	Electroswitch	C7D0123N	para o ouro-plcionamento eletrodos
Pulso isolador	WPI	A365	por excesso de regulamentação eletrodos
Q porta eletrodo série	Warner Instruments	64-1091
Fio de prata 0,010 "de diâmetro	Sistemas AM	782500	eletrodo terra
8 pinos DIP tomada IC	Digikey	ED90032-ND
Borosilicato tubos capilares com filamento, ID 0,58 milímetros	Warner Instruments	64-0787	construção tetrode trançado
Pistola de calor	Weller	6966C
Rediohm-800 arame	Kanthal Precision Technologies	PF002005
Título placa do vibrador	ThermoCientífico	4625Q	fios de torção
Carbide tesoura, 4,5 "	Pesquisa Biomédica Instr	25-1000	para o corte de fios torcidos tetrode
Finas pinças de ponto	HECO	91-EF5-SA	para fios tetrode provocando além
			Entrega odor
6 seringa ml	Kendall	1180600777	projetado para filtro de carvão ativado
Brown garrafas odor	Pescador	08-912-165
Carvão vegetal	BuyActivatedCharcoal.com	GAC-48C
Dessecante	Drierite	23005
Gás Drierite secagem jar	Fischer Scientific	09-204
Dissipadores de calor tubulação	3M	EPS-200	preparação odor filtro
Hipodérmica hub de alumínio agulha, calibre 19	Kendall	8881-200136	para fornecer linhas de entrada e de saída para as garrafas de odor
Óleo mineral	Mallinckrodt Chemicals	6357-04	por diluição odor
Tubos de plástico Nalgene, 890 FEP	Thermo Scientific	8050-0310	para fornecimento de gás portador
Pneumático picopump	WPI	sys-pv820	para entrega odor
Polietileno tubagem ID 0,86 milímetros	Intramedic	427421	para o odor garrafa tomada connections e tubos profusão salina
Rolhas	Laboratório Pure	97041	para vedar garrafas de odor
Fita de tempo	PDC	T-534-RP
Luer tubulação	Cole-Parmer	30600-66
Tubo de vácuo	McMaster-Carr	5488K66
			Preparação / Dissection
100 x 15 mm placa de Petri	VWR International	89000-304
18 fio de cobre AWG	Lapp Kabel	4510013	isolamento do fio é utilizado como juntas de borracha
22 AWG conexão encalhado	AlphaWire	1551	cérebroplataforma
Batik cera	Jacquard	7946000
Cera periferia Dental	Henry Schein-dental	6652151
Electrowaxer	Almore Internacional	66000
Epóxi, 5 min	Permatex	84101
Hipodérmica hub de alumínio agulha	Kendall	8881-200136
Protease de Streptomyces griseus	Sigma-Aldrich	P5147	para desheathing cérebro de gafanhotos
Fio de sutura não estéril	Pescador	NC9087024	para amarrar o abdômen após a remoção do intestino
Vetbond	3M	1469SB	para vedar amlocais putation
Dumont # 1 pinça (grossa)	WPI	500335
Dumont n º 5 de titânio fórceps (multa)	WPI	14096
Dumont # 5SF pinça (super fino)	WPI	500085	desheathing cérebro de gafanhotos
10 centímetros dissecando tesoura	WPI	14393	para a remoção de pernas e asas
Vannas tesoura (fino)	WPI	500086	para a remoção de cutícula, cortar o foregut
			Profusão salina
Conjunto de extensão com regulador de vazão	Moore Médica	69136	para regular o fluxo de solução salina
IV administração definido comY local de injecção	Moore Médica	73190	para regular o fluxo de solução salina