ローカスの神経活動を特徴づけるためにマルチユニット記録方法（<em&gt; Schistocercaアメリカーナ</em&gt;）嗅覚回路

要約

我々は、無脊椎動物の嗅覚経路の最初の3つの段階で臭気誘発反応を特徴づける細胞外マルチユニット記録技術のバリエーションを示しています。これらの技術は簡単にだけでなく、他の神経系において、アンサンブル活動を調べるために適合させることができます。

要約

嗅覚の検出と解釈は、多くの生物の生存のために重要である。驚くべきことに、門の両端の種は驚くほど似て嗅覚システムは、化学センシングへの生物学的ア ​​プローチは進化の時間^1の上に最適化されていることを示唆している。昆虫の嗅覚系では、匂い物質は活動電位の列車に化学的刺激に変換するアンテナの嗅覚受容ニューロン（ORN）によって導入されています。 ORNsからの感覚入力は、その後、触角葉（;脊椎動物の嗅球に類似した構造AL）に中継されます。 ^2,3、ALで、悪臭のための神経表現は、校長のニューロン集団（また、投射ニューロンと呼ばPNS）に分散時空間発火パターンの形をとる。 ALの出力は、その後、下流のキノコ体（メガバイト）、嗅覚記憶および^4,5学習に関連付けられている構造でケニヨン細胞（KCS）によって処理されます。彼女のeは、我々はこれらの嗅覚回路で臭気誘発神経反応を監視するために電気生理学的記録手法を提案する。

まず、ORNs ^6,7の集団のレベルで臭気誘発反応を研究するために、単一の感覚子の記録方法を提示します。我々は細胞外ORNの応答を監視するための電極として生理食塩水埋め研ぎガラスピペットの使用について説明します。次に、我々は細胞外に商業16チャネル電極^3を使用^したPN応答を監視する方法を提案する。カスタムメイドの8チャンネル撚線四極管を使用して同様のアプローチがケニヨン細胞録音⁸で実証されています。我々は、これらの技術のそれぞれのための私達の実験のセットアップの詳細と現在の代表的な記録トレースを提供します。

プロトコル

1。臭気の準備と配達

1. 所望の濃度レベルを達成するためにボリュームが鉱物油で臭気ソリューションを希釈します。 60mlのガラス瓶に鉱物油と臭剤20mlの混合物を保管してください。入口と出口のラインを提供するために、ゴム栓（計19）、上から下から1と他に2つの注射針を挿入します。このゴム栓とガラス瓶を密封し、入口ライン（ 図1A）にカスタム設計された活性炭フィルターを取り付けてください。
2. カーボンフィルターは2 6ミリリットルのシリンジを使用して行われます。半分に注射器をカットし、プランジャーの端を捨てる。熱収縮チューブを使用して、それらを一緒に接続する前に、綿と活性炭との残りの部分をそれぞれ記入してください。
3. アンテナの向こう側に一定のエアフローを供給プラスチックチューブ（ナルゲンFEPチューブ、ID 5.8ミリメートル）である（ 図1Bに臭気ボトル（ポリエチレンチューブ、0.86ミリメートルのIDを使用して）の出口ラインを接続）。
4. イナゴアンテナの数cm以内に配置プラスチックチューブを使用してバッタに向かって、直接炭素 - ろ過、除湿空気（流量、0.75 L / minのキャリアガス）。
5. 匂い刺激のために、ボトル内の臭気溶液上の静的ヘッドスペースの一定量（0.1リットル/ min）を変位させる。これはピコポンプ（WPIは、PV-820）を使用してボトルに除湿された空気の等しい量を注入することによって達成される。臭気ボトルから蒸気が通気管に出口ライン（ 図1B）を経由します。
6. 〜10センチメートルイナゴのアンテナの後ろに真空漏斗を配置することによって、配信臭気蒸気を除去。

2。シングル感覚子記録用ローカスアンテナの準備

1. 完全に成長した翼でどちらの性別の若い大人のイナゴを選択したが、交配前のステージに混雑したコロニーから。イナゴを抑制するには、まずその足を切断。組織接着剤（Vetbond、3M）と切断部位を密封する。セキュアトン（ 図2A）、その胸部の周りに覆われた電気テープの小片を使用して、カスタム設計されたチャンバーに彼はイナゴ。
2. 解剖顕微鏡下では、アンテナの配置のためのワックスのプラットフォーム（ 図2A）に浅い溝を作る。溝にアンテナを配置し、アンテナの両端（ 図2B; electrowaxerがワックスを溶融するために使用されている）でバティックのワックスを使用して、それを安定させる。
3. 胸部（約1cm離れて頭から）に接地電極（塩素化銀線）を挿入します。両方のシールに切開部位をバティックワックスを使用して、場所にアース線を保持した（ 図2A）。

3。嗅覚受容ニューロン（ORNs）から臭気誘発反応を監視する単一の感覚子の記録

1. 防振台（TMC）（ 図3A）の実体顕微鏡（ライカM205C）で安定化ローカストアンテナを設置する。記録感覚子のベースがはっきりしていることを確認してくださいLY見える（ 図3B）。
2. ホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブ（外径1.2ミリメートル、0.69ミリメートルのID）を用いて、ガラス電極（イナゴ生理食塩水^9、先端径1〜3μmででいっぱいMΩインピーダンス3-10）作製するマイクロピペットプラー（サターP-1000）を使用します。
3. 電動マイクロマニピュレーター（サッターMP-285）に取り付けられているマイクロピペットホルダーにガラス電極を配置します。優しく感覚子（ 図3B）のベースに電極を挿入します。各感覚子はバッタ¹⁰で3から50 ORNsを含めることができることに注意してください。
4. ACアンプ（グラスP-55）を使用した信号（10,000倍）を増幅する。 0.3の間の信号フィルタ- 10.0 kHzを、データ収集システムを使用して、15 kHzサンプリングレート（ 図3D）（は、LabVIEW、PCI-MIO-16E-4 DAQカード、ナショナルインスツルメンツ）で取得する。

4。触角葉とキノコ体のレコーディングのためにイナゴの解剖手順

1. restrainiに従ってくださいngの手順は、セクション2.1で説明された。 図4AおよびBに示すようにカスタム設計されたチャンバー内でバッタを置きます。
2. 中に生理食塩水を灌流すると解剖手順の後に、イナゴ​​の頭の周りにワックスカップを構築することができます。ワックスカップはちょうど口の部分の上に起動して、 図4Cに示すように、2つのアンテナ間の領域を網羅し複眼を超えて拡張する必要があります。
3. アンテナはワックスカップを通過することを許可するには、プラスチック（ポリエチレン）チューブ（長さ5mm、IDの0.86ミリメートル）を使用して、両側に小さなトンネルを作成します。プラスチック製のチューブがワックスカップを通してスライドできることを確認します。後者はしっかりプラスチックチューブを包み込むが、ワックスカップ（ 図4C）に取り付けられているゴム製のガスケットを使用することによって達成される。
4. エポキシ樹脂を用いて、プラスチックチューブの下端にアンテナのベースを取り付けます。このステップでは、アンテナがあっても周囲の後に所定の位置に保持されることを保証キューティクルは削除されます。
5. この時点から食塩水⁹で埋めワックスカップを保つ。アンテナ2本（前後軸と平行な四角形の長辺）の間の中央の長方形領域を最初に取り外します。その後、アンテナの基部（ 図4D）で複眼とキューティクルを乱すことなく、近隣地域でキューティクルを除去します。
6. 細かい鉗子を使用して、静かに空気嚢や脳の周囲の脂肪体を削除します。このステップの終了時に、バッタの脳ははっきりと（ 図4D）見られるべきである。嗅覚情報（淡黄色色素沈着を持つ）を処理する脳の領域は、2つのアンテナの間に位置していることに注意してください。
7. イナゴでは腸は脳と体の下の長さに沿って実行されます。潜在的に準備を不安定にするから、腸の動きを防ぐために、静かに前腸を引き出し、それが正常にハサミを使ってカットします。腹部に小さな切開を加えるだけ直腸上記と粗鉗子で後腸を引っ張って腸を削除します。生理食塩水漏れを防止するために、縫合糸による切開部位のすぐ前方の腹部を結ぶ。
8. 図4Dに示すように、電気生理学の間に脳を高め^、11それを安定させるためにワックスの薄い層でコーティングされた細いワイヤーで作られた小型のプラットフォームを使用します。
9. 昆虫の脳は前の実験に除去する必要が薄い絶縁シースで覆われている。 desheathに脳は、優しく細かい鉗子^9を用いて脳の表面上に酵素を少量（0.3から0.4 mgのプロテアーゼ、シグマアルドリッチ）に広がった。酵素アプリケーションの5〜10秒後、生理食塩水で十分に脳をすすいでください。超微細鉗子を使用すると、非常に優しくつまんでシースをプルアップし、その後、それが記録位置（ALとMB、 図4E、Fに示す）を介して開く引き裂く。

5。触角葉からマルチユニットレコーディングとキノコ体

1. 防振台上に置かブームスタンドから吊るさ実体顕微鏡下でイナゴの準備（ 図5A）を置きます。
2. 実験を通じて一定の生理食塩水灌流速度（約0.04リットル/時間）を維持する。接地電極として生理食塩水を充填したワックスカップに浸塩素化銀線を使用しています。
3. PNの録音については、16チャネルシリコンプローブ（NeuroNexusテクノロジーズアイテム＃A2x2-TET-3ミリメートル-150-150-121-A16、 図5B）を使用します 。各実験の前に、200〜300kΩの範囲でインピーダンスを達成するために金で電極を電気めっき。電気については、 図7に示す回路を使用しています。
4. 近く触角葉の表面に電極を置き、そっと手動マニピュレーター（WPI、M3301R）（ 図5D）を使用して組織に挿入します。
5. 〜10μmステップで電極を進める。各ステップで2〜3分待ってから、獲得を検討D信号の品質。理想的なレコーディング現場では、細胞外の信号が複数の記録チャネルによってピックアップされ、高い信号対雑音比（SNR> 3-5回ノイズSDS）を持ちます。
6. KCの録画用に、カスタムメイドの撚線テトロード（; 6節に示さステップ·バイ·ステップの製作手順図5C）を使用します 。ステップ5.3で説明したように、これらの電極に電気メッキ。 KC細胞体はMB ⁸の表層に限定されるメガバイト（ 図5E）の表面に極真空管を配置します。
7. 模式的に図5Aに示すように、両方のPNとKCの録音が同時に同じイナゴの準備から行うことができます。
8. 電極の安定化を可能にするために録音の場所を見つけた後少なくとも15分間待ちます。
9. 0.3から6 kHzの間のフィルタ15のKHzで、すべての細胞外シグナルを取得し、16チャンネルACアンプ（生物学電子商店;カリフォルニア工科大学、パサデナ、カリフォルニア州）を用いて（1万倍）を増幅（図6A、B）。

6。 KCの録音のためにツイストワイヤ電極を確認するための手順

1. KCの録音のためのマルチユニットの電極を設計するには、絶縁されたニッケルクロム線（RO800、0.0005 "フィラメント^）8を使用^{しています} 。
2. 8電極が望まれているならば、段ボールの4倍の10〜15センチメートル長い部分にワイヤーを巻きつけます。段ボールの端部は、ワイヤを切断からエッジを防ぐためにプラスチックチューブで覆うことができる。ラッピングしながら、少したるみがあることを確認しますが、ワイヤーがピンと張っていないことを確認してください。それが簡単に壊れるように慎重にワイヤを扱う。
3. バンチ段ボールの上部に一緒に配線し、それらを一緒に保持するためにテープの一部（タイムテープは、T-534-RP）を使用しています。もう一方の端のストランドをカット。よくテープの別の部分を使用して、カット終了時にワイヤストランドとグループのワイヤを外します。
4. タイタープレートシェーカー（サーモサイエンティフィック、モデル4625Q）を使用して、（3用〜72回転/分一緒に鎖を巻いて1撚線を形成する分）。録音されたストランドの底はタイタープレートローターにクリッピングすることができ、上部はブームスタンドにクリップすることができます。巻き取り時、ワイヤがピンと張ったことではない、まだ少し余裕が必要です。
5. 一緒に個々のストランドを堅持し、単線を形成するためにヒートガン（ウェラー6966C）と一緒に断熱材を溶かす。ワイヤの長さに亘って3月4日遅いパスは（3-4秒毎に）一緒にストランドを加熱して溶融するのに十分でなければならない。その後、下からワイヤーを解放し、それがリラックスすることができます。テープを除去するために両端付近線をトリムします。
6. 5〜6センチメートル長い、ガラスキャピラリーチューブ（外径1.0ミリメートル、0.58ミリメートルのID）を介してワイヤの一方の端を差し込みます。細かいピンセットを使用して1つの端に撚線を離れていじめると、非常に簡単に炎を使用してエンドを放火によってコーティングを除去してください。この手順は慎重に行わなければなりません。長すぎるために炎にワイヤーを公開することはストランドが溶融し、もつれてしまいます。
7. 優しく燃え上がる端に8鎖を分離8ピンICソケットに別々にNDはんだが各鎖。コー​​ト代わりにストランドとガラスキャピラリーを保持するためにエポキシとICソケットの上部を。また、場所（ 図5C）にワイヤーを保持するために毛細血管のもう一方の端にエポキシの小滴を配置します。
8. 最後に、キャピラリー先端から約0.5cmカーバイドハサミで45度の角度で線の先端をカットします。

結果

二つの異なるアルコールへの単一のORNの臭気誘発反応は 、 図3（d）に示すようにしています。記録位置に応じて（感覚子の種類、電極の配置）​​マルチユニットレコーディングを実現することができる。

ALの録音から生細胞外波形を図6（a）に示されています。活動電位または別のPNに由来する様々な振幅のスパイクは、この電圧...

ディスカッション

ほとんどの感覚刺激は、ニューロンのアンサンブルに分散されたコンビナトリアル反応を引き起こす。したがって、マルチニューロン活動の同時モニタリングが刺激固有の情報が脳内の神経回路で表されており、どのように処理されるかを理解する必要があります。ここでは、昆虫の嗅覚経路に沿って第3処理センターにおける臭気誘発反応を特徴づけるために、細胞外マルチユニット記録技...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
名前	会社	カタログ番号	注釈
			電気機器
ACアンプ	GRASS	モデルP55	単一の感覚子のレコーディングのために
オーディオモニター（モデル3300）	AMシステム	94万
カスタムメイド16チャンネルプリアンプとアンプ	カル。テック。バイオエレクトロニクスショップ		ALとメガバイトレコーディングに
データ収集部	ナショナルインスツルメンツ	BNC-2090
光ファイバーの光	WPI	SI-72から8
光源115 V	WPI	NOVA
手動マニピュレーター	WPI	M3301R	イナゴ脳録音用
ブームスタンドにStereomicroscope1	ライカ	M80	イナゴ脳録音用
Stereomicroscope2	ライカ	M205C	単一の感覚子のレコーディングのために
振動アイソレーションテーブル	TMC	63から500シリーズ
電動マイクロマニピュレーター	サターインスツルメンツ	MP285 / T
オシロスコープ	テクトロニクス	TD2014B
			電極/建設ツール
16チャネル電極	NeuroNexus	A2x2-TET-3mmの150から121	触角葉のレコーディングのために
フィラメントは、ID 0.69ミリメートルとホウケイ酸毛細管	サターインスツルメンツ	BF120-69から10	ガラス電極を作るための
マイクロピペットプラー	サターインスツルメンツ	P-1000
関数発生器	マルチメータの倉庫	SG1639A	金メッキ電極用
金めっき液（シアン化物非）	SIFCOインダストリーズ	ノースカロライナ州のSPS 5355
インピーダンステスター	BAKエレクトロニクス株式会社	IMP-2	金メッキ電極用
ロータリースイッチ	品番	C7D0123N	金-plに関するating電極
パルスアイソレータ	WPI	A365	金メッキ電極用
Qシリーズ電極ホルダー	ワーナー·インスツルメンツ	64から1091
銀線0.010 "直径	AMシステム	782500	接地電極
8ピンDIP ICソケット	Digikeyを	ED90032-ND
フィラメントは、ID 0.58ミリメートルとホウケイ酸毛細管	ワーナー·インスツルメンツ	64から0787	撚線テトロード建設
ヒートガン	ウェラー	6966C
Rediohm-800ワイヤー	カンタルプレシジョンテクノロジー	PF002005
タイタープレートシェーカー	サーモ科学的	4625Q	ねじれワイヤー
炭化物はさみ、4.5 "	バイオメディカル研究InStr関数	25から1000	ツイストテトロードワイヤを切断するための
ファインポイントピンセット	HECO	91-EF5-SA	別にいじめテトロードワイヤ用
			臭気デリバリー
6ミリリットルのシリンジ	ケンドール	1180600777	カスタム設計された活性炭フィルター用
ブラウン臭気ボトル	フィッシャー	08-912-165
木炭	BuyActivatedCharcoal.com	GAC-48C
乾燥剤	DRIERITE	23005
DRIERITEガス乾燥ジャー	フィッシャー·サイエンティフィック	09から204
熱収縮チューブ	スリーエム	EPS-200	臭気フィルタ準備
皮下注射針アルミハブ、計19	ケンドール	8881-200136	臭気ボトルの入口と出口のラインを提供するための
鉱油	マリンクロットケミカルズ	6357から04	臭気の希釈用
ナルゲンプラスチックチューブ、890 FEP	サーモサイエンティフィック	8050-0310	キャリアガス供給の
空気圧picopump	WPI	SYS-pv820	臭気配信のため
ポリエチレンチューブIDの0.86ミリメートル	Intramedic	427421	臭気瓶コンセントconnecti用アドオンや生理食塩水灌流チューブ
ストッパー	ラボピュア	97041	臭気瓶を密封するための
時間テープ	PDC	T-534-RP
チューブルアー	コー​​ル - パーマー	30600から66
真空管	マクマスター - カー	5488K66
			準備/解剖
100×15ミリメートルペトリ皿	VWRインターナショナル	89000-304
18 AWGの銅より線	LAPP KABEL	4510013	電線絶縁はゴムのガスケットとして使用されている
22 AWGの回路用電線	AlphaWire	1551	脳プラットフォーム
バティックワックス	ジャカール	7946000
歯の周囲のワックス	ヘンリー·シャインデンタル	6652151
Electrowaxer	Almore国際	66000
エポキシ、5分	Permatex	84101
皮下注射針アルミハブ	ケンドール	8881-200136
ストレプトgriseus由来のプロテアーゼ	シグマアルドリッチ	P5147	イナゴの脳をdesheathing用
縫合糸非滅菌	フィッシャー	NC9087024	腸内細菌を除去した後に腹部を結ぶための
Vetbond	スリーエム	1469SB	午前密封するためのputationサイト
デュモン第1鉗子（粗）	WPI	500335
デュモン第5チタンピンセット（細かい）	WPI	14096
デュモン＃5SF鉗子（超微細）	WPI	500085	desheathingイナゴ脳
10センチメートルはハサミを解剖	WPI	14393	足と羽を除去するための
Vannasはさみ（ファイン）	WPI	500086	キューティクルを除去するために、前腸を切断
			生理食塩水豊富さ
レートフローレギュレータを使用して設定延長	ムーアメディカル	69136	生理食塩水の流れを調整するための
静脈内投与は、使用して設定Yの注射部位	ムーアメディカル	73190	生理食塩水の流れを調整するための