Un ensayo cuantitativo para estudiar proteínas: DNA Interacciones, reguladores Descubra transcripcional de la expresión génica, e identificar agentes antitumoral

Resumen

Desarrollamos una unión a ADN, ensayo basado en ELISA cuantitativo para medir las interacciones de los factores de transcripción con el ADN. Alta especificidad para la proteína RUNX2 se logró con un oligonucleótido de ADN consenso de reconocimiento y el anticuerpo monoclonal específico. Detección colorimétrica con una reacción anticuerpo-enzima-sustrato acoplado se monitorizó en tiempo real.

Resumen

Muchos ensayos de unión de ADN-tales como ensayos de cambio de movilidad electroforética (EMSA), ensayos de quimioluminiscencia, de inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) a base de ensayos, y ensayos basados ​​en pocillos múltiples se utilizan para medir la actividad del factor de transcripción. Sin embargo, estos ensayos son no cuantitativos, carecen de especificidad, pueden implicar el uso de oligonucleótidos radiomarcados, y pueden no ser adaptables para el cribado de inhibidores de la unión del ADN. Por otro lado, el uso de una unión a ADN ensayo cuantitativo inmunoabsorbente ligado a enzimas (D-ELISA), que demuestran las interacciones de proteínas nucleares con ADN utilizando el factor de transcripción RUNX2 que dependen de asociación específica con secuencias de unión al ADN consenso presentes en biotina- oligonucleótidos marcados. Preparación de las células, la extracción de proteína nuclear, y el diseño de oligonucleótidos de doble cadena se describen. Placas de 96 pocillos recubiertas con avidina se fijan con tampón alcalino y se incubaron con las proteínas nucleares en tampón de bloqueo de nucleótidos. Folldebido extenso lavado de las placas, el anticuerpo primario específico y las incubaciones de anticuerpos secundarios son seguidos por la adición de sustrato de peroxidasa de rábano picante y el desarrollo de la reacción colorimétrica. Modo de reacción de parada o un control cinético continuo se utilizaron para medir cuantitativamente la interacción de proteínas con el ADN. Se discuten controles de especificidad apropiadas, incluyendo el tratamiento con IgG no específica o sin proteína o anticuerpo primario. Aplicaciones del ensayo se describen incluyendo su utilidad en la detección de drogas y se discuten los resultados positivos y negativos representativos.

Introducción

Ensayos de unión al ADN tienen utilidad en la medición de la capacidad de los factores de transcripción para interactuar con el ADN. Los ensayos para ADN de unión incluyen ensayos de cambio de movilidad electroforética (EMSA) que dependen de oligonucleótidos radiomarcados ¹ o ensayos de quimioluminiscencia ^2. Ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) basadas ^3, así como ensayos que emplean formatos de 96 pocillos ⁴ también se han descrito. Sin embargo, la EMSA es un ensayo de no cuantitativa que requiere el uso de oligonucleótidos radiomarcados. Cuando las proteínas nucleares se asocian con las secuencias específicas de nucleótidos promotora, complejos de unión están retrasados ​​en geles de poliacrilamida y el factor de transcripción específico puede ser validado con una "supershift" anticuerpo. Hemos desarrollado un ensayo de unión de ADN-cuantitativa utilizando un formato de inmunoabsorción ligado a enzimas (D-ELISA), que es capaz de medir la interacción de RUNX2 con secuencias de unión al ADN que corresponden a elementos promotores definidos igenes objetivo n RUNX2. El uso de un anticuerpo anti-RUNX2 proporciona especificidad para el ensayo y la falta de radiomarcador distinguir este ensayo a partir del ensayo de desplazamiento en gel tradicional ^5. La detección de complejos de unión es posible con el uso de un anticuerpo secundario acoplado a peroxidasa de rábano picante (HRP), que convierte un sustrato de HRP, tetrametil bencidina (TMB) en un producto coloreado para el análisis espectrofotométrico. El ensayo informado aquí puede incorporar el uso de oligonucleótidos de ADN mutadas como controles y se puede utilizar para la detección de inhibidores competitivos o no competitivos de la unión del ADN. La selección de compuestos antitumorales novedosos también es posible con este ensayo.

Protocolo

Varios pasos se llevan a cabo antes de tiempo y varios reactivos se preparan y se almacenan antes del procedimiento: (1) cultivo de células y proteínas de aislamiento, (2) preparación de oligonucleótido, (3) la preparación de placas de 96 pocillos, (4) extracto nuclear durante la noche de incubación. Procedimiento requiere 2 días debido a la incubación durante la noche de la proteína nuclear con oligonucleótidos de ADN.

1. Preparación de Buffers

1.1 aislamiento de proteínas nucleares

1. Hipotónico Buffer: Para preparar 100 ml de tampón hipotónico, añadir 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 150 l (1 M MgCl _2), 333 l (3 M KCl) a 98,3 ml de H ₂ O. Las concentraciones finales: 10 mM HEPES, 1,5 mM de MgCl _2, 10 mM de KCl. Para tampón hipotónico + NP40 (para su uso en el paso 2.11): Añadir 0,5 ml (10% NP40) a 9,5 ml de tampón hipotónico final de 0,5% NP40.
2. Buffer Bajo en sal: Para preparar 100 ml de tampón de sal baja (para el uso en el paso 2.15), añadir 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 25 ml de glicerol, 150 l (1 M MgCl _2), 666 l (3 M KCl), 40 l (0,5 M EDTA) a 73 ml de H ₂ O. Las concentraciones finales: 10 mM de HEPES, 25% de glicerol, 1,5 mM de MgCl _2, KCl 20 mM, EDTA 0,2 mM.
3. Salinidad Buffer: Para preparar 100 ml de tampón de sal de alta (para el uso en el paso 2.15), añadir 1 ml (1 M HEPES, pH 7.9), 25 ml de glicerol, 150 l (1 M MgCl _2), 26,7 ml (3 M KCl), 40 l (0,5 M EDTA) a 47 ml de H ₂ O. Las concentraciones finales: 10 mM de HEPES, 25% de glicerol, 1,5 mM de MgCl _2, 800 mM de KCl, 0,2 mM de EDTA.
4. 10% de NP40 Detergente: 10 ml de NP40 a 90 ml de _H2O
5. Los inhibidores de proteasa y fosfatasa [añadido al tampón hipotónico + NP40 (paso 2,11), al tampón de baja sal (paso 2,15), y para tampón de alto contenido de sal (paso 2,15) justo antes de su uso]: Añadir 2,5 l (1 M DTT) y 50 l de inhibidores de la proteasa (100x) a 5 ml de cada tampón para concentración final de 0,5 mM de DTT y los inhibidores de la proteasa 1x. El inhibidor de la proteasa mezcla 100x valores incluye:fluoruro de sodio (Ser / Thr, fosfatasas ácidas), ortovanadato de sodio (Tyr, fosfatasas alcalinas), β-glicerofosfato (fosfatasas Ser / Thr), pirofosfato de sodio (fosfatasas Ser / Thr), aprotinina (Ser proteasas), bestatina (amino-peptidasas ), E64 (proteasas de cisteína), leupeptina (proteasas Ser / Cys), EDTA (metaloproteasas).

1.2 Preparación de placas de ensayo

1. Placa de fijación de solución: Para preparar 500 ml de solución, añadir 5,25 g de carbonato de sodio a 500 ml de _H2O, mezclar bien y ajustar el pH a 9,7 para una concentración final de carbonato de sodio 0,1 M.
2. Placa de solución de bloqueo: Para preparar Stock poli dI / DC oligonucleótido, resuspender 1 Unidad (~ 50 mg) de poli dI / DC en 1 ml de 10 mM de Tris / HCl, pH 7,9 que contiene EDTA 1 mM para una concentración de solución madre de 50 mg / l. El stock se diluye a 1 g / l antes de su uso.

1.3 tampones de lavado y diluciones de anticuerpos

NOTA: tampón de lavado estreptavidina es utilizado para lavar platos en entre adiciones y para diluir los anticuerpos primarios y secundarios.

1. Para preparar 1 l de tampón de lavado estreptavidina, añadir 2,4 g de Tris / HCl, 37,5 ml (4 M de NaCl), 10 ml (10% de BSA), 5 ml (10% de Tween-20), a 1 L de agua filtrada Millipore estéril , pH 7,18. Almacenar a 4 ° C. Las concentraciones finales: 20 mM de Tris / HCl, NaCl 150 mM, 0,1% de BSA, 0,05% de Tween-20.

Tampón de unión a ADN 1,4

NOTA: Este tampón se almacenó a -20 ° C.

1. Para preparar 15 ml de tampón de unión de ADN, añadir 180 l (1 M HEPES, pH 7,9), 300 l (3 M de KCl), 12 l (0,5 M EDTA, pH 8,0), 7,5 l (1 M DTT), 3,0 ml (60% de glicerol), 300 l (50 g / l de poli dI / DC) diluido con agua desionizada / destilada H ₂ O (12 ml). Las concentraciones finales: 12 mM HEPES / pH 7,9, 60 mM KCl, EDTA 0,4 mM, DTT 0,5 mM, 12% de glicerol, 1 g / l de poli dI / DC.

2. Cultivo de células y aislamiento de proteínas nucleares

t "> NOTA: La preparación requiere alrededor de 3 horas de estimulación de las células dependerá de experimento El número de células utilizadas para cada experimento puede variar y todos los volúmenes refleja un experimento típico utilizando 3 x 10 ⁷ células / punto de ajustar los volúmenes de acomodar... el número de células realmente utilizada en el experimento ^6.

1. Para preparar la proteína nuclear para los ensayos de unión de ADN, células humanas de cultivo que expresan RUNX2 (endotelial, osteosarcoma, células de cáncer de mama) en los medios de comunicación adecuados ^6.
2. Tratar las células subconfluentes con nocodazole (0,2 mg / ml durante 16 horas) para detener las células en el ciclo celular límite G2 / M ^6. En estas condiciones, la proteína RUNX2 se estabiliza y se consigue la unión de ADN máxima. De esta manera, suficiente proteína nuclear está disponible para múltiples ensayos y los inhibidores se pueden comparar a partir de la misma preparación.
3. Para cada paso, pre-enfriar la centrífuga a 4 ° C y preparar tampones y enfriar 20 min a 4 ° C antes de la cosecha de células.
4. Células Chill (4 ° C) y procedimientos de conducta en el hielo.
5. Centrifugar las células a 1000 rpm durante 5 min en un tubo de fondo redondo de 15 ml de polipropileno.
6. Lavar 1x con helado de PBS (Ca ^{2 +} y Mg ^{2 +} libre).
7. Se centrifuga de nuevo y desechar PBS sobrenadante.
8. Añadir 500 l de tampón hipotónico y sin inhibidores de la proteasa, teniendo cuidado para resuspender completamente el sedimento celular.
9. Transferir contenido a un tubo Eppendorf de 1,5 ml.
10. Inmediatamente centrifugar a 5.500 rpm durante 5,5 min; descartar el sobrenadante y mantener el sedimento celular.
11. Resuspender el sedimento de células en 500 l de tampón hipotónico que contienen 0,5% de NP40. Añadir la proteasa y los inhibidores de la fosfatasa y DTT 0,5 mM (tal como se describe en el paso 1.1.5).
12. Permitir que la muestra para descansar en hielo durante 30 min.
13. Centrifugar a 13000 rpm durante 10 min.
14. Descartar el sobrenadante (que contiene las proteínas citosólicas).
15. Resuspender el botón nuclear en 60 l cada uno de baja salt tampón (a la que los inhibidores de la proteasa y DTT 0,5 mM, se han añadido de la etapa 1.1.5) y el tampón de sal alta (a la que los inhibidores de la proteasa y DTT 0,5 mM, se han añadido de la etapa 1.1.5) para un total de 120 l. Añadir 60 l de tampón de baja salinidad al sedimento primero y volver a suspender, a continuación, añadir 60 l de tampón de alta salinidad. Agite el pellet para ayudar en la resuspensión.

NOTA: Este paso ayuda a deshacerse de algunas de las proteínas de la membrana nuclear y prepara para el paso de lisis: baja en sal primero (pellet se resuspende, vórtice), a continuación, alto contenido de sal (vortex) optimiza este paso. Mantener extracto en hielo durante 30 min, con agitación con vórtex después de la primera 10 min.

16. Centrifugar a 12000 rpm durante 15 min; mantener el sobrenadante que contiene la proteína nuclear.
17. Medir la concentración de proteínas (trate de mantener las muestras a 2-5 mg / ml), la alícuota, en cantidades adecuadas (10 l / tubo) y se almacena a -80 ° C.

NOTA: El rendimiento estimado: 30 x 10 ⁶ celLS producirán 5 g / l de proteína en 120 l. 5 x 10 ⁶ células producirán 2,2 g / l de proteínas en 40 l.

3. Preparación de la doble cadena de oligonucleótidos

1. Diseñar oligonucleótidos complementarios con los sitios de media compatibles en los extremos. Para RUNX2 estos son: 5'-CGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATAC TCG-3'-biotina (sentido) y 5'CGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT T GTGGTT AATACG-3'-biotina (antisentido).

NOTA: Los experimentos piloto determinó que tres sitios de unión RUNX2 y single-end marcado con biotina produjeron los resultados más reproducibles.

2. Prepare el tampón de hibridación 5x: Añadir 300 l (1 M Tris-HCl, pH 7,6), 30 l (1 M MgCl _2), 10 l (1 M DTT) a 260 l H ₂ O (finales de 600 l).
3. Para 200 pmol de cada olig monocatenarioonucleotide (3 l), añadir 12 l de tampón de recocido 5x y 45 l H ₂ O para un total de 60 l (200 pmol/60 mu l).
4. Se calienta a 95 ° C durante 5-10 min en un bloque de calentamiento.
5. Enfriar a 65 ° C lentamente (ajustando la temperatura a 65 ° C, se tarda 15 min), luego se enfría a temperatura ambiente lentamente de desconectar la alimentación del bloque de calentamiento (o colocando en 50 ml de agua a 65 ° C en un vaso de hielo, lo que tarda 15-20 minutos).

4. Preparación de placas de 96 pocillos

NOTA: No utilizar proteínas de la leche en los tampones de lavado.

1. Fijar la placa con solución de fijación (0,1 M de carbonato de sodio): añadir 300 l / pocillo.
2. Incubar durante 2 horas, meciendo a temperatura ambiente (RT), o ninguna mecedora a 4 ° C (O / N).
3. Lave la placa 3x con tampón de lavado estreptavidina (BM): añadir 300 l / pocillo cada vez.
4. Añadir oligonucleótido de doble cadena marcado con biotina (3 sitios de unión de consenso por nucleótido) durante 2 horas wi-ésimo de balanceo (1,25 nmol / pocillo; 100 l / pocillo).
5. Lave 3 veces con frío WB: añadir 300 l / pocillo y luego invertir inmediatamente la placa en un fregadero y borra los bordes en una toalla de papel después de cada adición.

NOTA: No utilice las puntas de pipeta para extraer líquido de las placas ya que esto puede raspar avidina: biotina: ADN de los pozos. Haga esto para todas las etapas de lavado posteriores.

5. La incubación con extracto nuclear

NOTA: No sustituya el salmón o el ADN de esperma de arenque para el poli tampón de bloqueo dI / DC. Evite bloquear las placas con proteínas de la leche. Ambos de estos agentes de bloqueo resultan en altos valores de fondo.

1. Incubar con factor de transcripción específico preparado a partir de extracto nuclear (90 l / pocillo). Preparar una mezcla maestra que contiene extracto nuclear (proteína de unión a ADN, 3-9 mg / pocillo) + poli dI / DC (1 g / l de un mg / Stock ul 50) en el ADN de 1x tampón de unión. El volumen se como sea necesario para el número total depozos requeridos (90 l / pocillo).
2. Cualquier inhibidor potencial, tales como la vitamina D3 (Figura 2) o compuesto CADD 5221975 (Figura 3), o la dilución apropiada del control de disolvente, tal como etanol, se añade en este paso.
3. Colocar la placa en la plataforma oscilante, O / N a 4 ° C.
4. Lave 3x con WB: añadir 300 l / pocillo

6. La adición de Anticuerpo Primario

NOTA: diluciones de anticuerpos primarios deben estar preparados frescos - No se recomienda el almacenamiento.

1. Diluir el anticuerpo monoclonal-RUNX2 específica (acción 1 mg / l) 1/5, 000 en estreptavidina Tampón de lavado. Preparar suficiente para la adición a cada pocillo de la placa de 96 pocillos (90 l / pocillo) por triplicado.
2. Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente en una plataforma oscilante.
3. Lave 3x con WB, añadir 300 l / pocillo.

7. La adición de anticuerpo secundario

NOTA: diluciones de anticuerpos secundarios pueden ser storojo a 4 ° C durante la noche si es necesario el día siguiente.

1. Diluir F purificado por afinidad-HRP anticuerpo conjugado (7,1 mg / ml) _{ab-específica} a 1:1,400 en estreptavidina Tampón de lavado: tampón de lavado ml 3,5 l antibody/5.0. Preparar suficiente para la adición a cada pocillo de la placa de 96 pocillos (90 l / pocillo) por triplicado.
2. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente en una plataforma oscilante.
3. Lave 6x con WB invirtiendo la placa en el fregadero (300 l / pocillo).

8. HRP Sustrato y Desarrollo de Productos

1. Añadir 50 l de sustrato TMB por pocillo directamente desde el almacén botella.
2. Incubar 10-20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad (parada método de reacción) o medir la absorción directa (monitoreo cinética continua).

9. Reacción Medición

1. Deje de método de reacción: Para la reacción de parada visual, compruebe el cambio de color de claro a azul y detener la reacción con ácido sulfúrico 50 l.
2. Medir la absorbancia a 450 nm conel espectrofotómetro Biotrak II lector de placa visible (Amersham Biosciences; GE Healthcare Biosciences Corp. Piscataway NJ, EE.UU.) o un instrumento similar.
3. Continuo método de monitoreo cinética: Añadir sustrato después del último lavado y justo antes de colocar en el espectrofotómetro (no detener la reacción).
4. Medir la absorbancia a 635 nm con el Bio-Tek Sinergia HT multi-reacción lector de microplacas Espectrofotómetro (Bio-Tek Instruments, Inc; Winooski, VT, EE.UU.) o un instrumento similar.

Resultados

El método D-ELISA es altamente específico para la proteína de unión a ADN designado, siempre y cuando se utiliza un oligonucleótido de doble cadena específica de la secuencia que contiene tres copias del sitio de unión consenso RUNX2 (ACACCA). El anticuerpo primario que reconoce el factor de proteína también aumenta la especificidad. El anticuerpo secundario contiene covalentemente unido a la peroxidasa de rábano picante (HRP) que convierte un sustrato transparente (tetrametil bencidina) en un producto colorea...

Discusión

Ensayos de unión al ADN se utilizan para medir la capacidad de los factores de transcripción para interactuar con el ADN. Los ensayos para la unión del ADN incluyen cambio de la movilidad electroforética (EMSA) y ¹ inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) ensayos basados ^​​3, así como ensayos que emplean formatos de 96 pocillos ⁴ tales como ensayos quimioluminiscentes ^2. La EMSA es no cuantitativa y utiliza radiomarcado ⁽³² P) oligonucleótidos. Estos se...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly dI/dC	GE Healthcare, Piscataway, NJ	US20539-5UN	1 U ~50mg
RUNX2 antibody	MBL International Corp., Woburn, MA	D130-3	1 mg/ml
Fab-specific peroxidase conjugated antibody	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A9917	7.1 mg/ml
TMB Substrate (tetramethyl benzidine)	EXALPHA Biologicals, Shirley, MA	X1189S	100 ml
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	57995	Plate-fixing
Sulfuric Acid	VWR, West Chester, PA	BDH-39922-1	Stop solution
Multi-well plates	Greiner Bio-One, Basel, Switzerland	655996	Avidin-coated, black sides
HALT	Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL	78440	Protease and phosphatase inhibitors
Chemicals	Various manufacturers	Laboratory grade
Table 1. Reagents
Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader	Amersham Biosciences		For use with stop reaction method
Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader	Bio-Tek Instruments, Inc.		For use with continuous kinetic monitoring
Table 2. Equipment