Uma análise quantitativa para o Estudo de Proteína: DNA interações, Discover Transcricionais Reguladores de Expressão Gênica e identificar novos agentes anti-tumorais

Resumo

Foi desenvolvido um ensaio quantitativo de ligação de ADN à base de ELISA para medir as interacções com o factor de transcrição do ADN. Alta especificidade para a proteína RUNX2 foi conseguida com um oligonucleótido de ADN de reconhecimento de consenso e de anticorpo monoclonal específico. Detecção Colorimétrico com uma reacção do substrato, o anticorpo acoplado a enzima foi monitorizada em tempo real.

Resumo

Muitos ensaios de ligação de ADN, tais como ensaios de desvio de mobilidade electroforética (EMSA), ensaios quimioluminescentes, imunoprecipitação da cromatina (ChIP) à base de ensaios e ensaios baseados em múltiplos poços são usadas para medir a actividade do factor de transcrição. No entanto, estes ensaios são não quantitativa, carecem de especificidade, pode envolver o uso de oligonucleotídeos marcados radioactivamente, e pode não ser adaptável para a triagem de inibidores de ligação de ADN. Por outro lado, utilizando uma enzima ligada ao ensaio quantitativo de ligação de ADN imunossorvente (ELISA-D) de ensaio, que demonstram as interacções de proteínas nucleares com ADN, usando o factor de transcrição RUNX2 que dependem associação específica com as sequências de consenso de ligação de ADN presentes em biotina- oligonucleótidos marcados. Preparação de células, a extracção de proteínas nucleares, e concepção de oligonucleótidos de cadeia dupla são descritos. Placas de 96 poços revestidas com avidina foram fixados com tampão alcalino e incubadas com as proteínas nucleares, em tampão de bloqueio de nucleótidos. Folldevido a uma lavagem exaustiva das placas, o anticorpo primário específico e as incubações do anticorpo secundário é seguida pela adição de substrato de peroxidase de rábano e o desenvolvimento da reacção colorimétrica. Modo de reação Parar ou monitoramento contínuo cinética foram usados ​​para medir quantitativamente a interação de proteínas com o DNA. Discute-se controlos adequados de especificidade, incluindo o tratamento com a IgG não específica ou sem proteína ou o anticorpo primário. Aplicações do ensaio encontram-se descritos, incluindo a sua utilidade na triagem de drogas e de resultados positivos e negativos representativos são discutidos.

Introdução

Os ensaios de ligação a DNA têm utilidade na medição da capacidade dos factores de transcrição que interagem com o ADN. Ensaios para DNA de ligação incluem ensaios de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA) que dependem de oligonucleotídeos radiolabeled ¹ ou ² ensaios de quimiluminescência. Ensaios de cromatina immuneprecipitation (ChIP) com base ^3, bem como ensaios que utilizem formatos de 96 poços ⁴ foram também descritas. No entanto, o EMSA é um ensaio quantitativo que não requer o uso de oligonucleotídeos marcados radioactivamente. Quando as proteínas nucleares associar com as sequências de nucleótidos de promotores específicos, complexos de ligação são retardados em géis de poliacrilamida e o factor de transcrição específico pode ser validado com um anticorpo "supershift". Nós desenvolvemos um ensaio quantitativo de ligação de ADN utilizando um formato de imunossorvente ligado a enzima (ELISA-D), o qual é capaz de medir a interacção de RUNX2 com sequências de ligação de ADN correspondentes aos elementos promotores definidos igenes alvo n Runx2. Utilização de um anticorpo anti-RUNX2 fornece especificidade para o ensaio e a ausência de marcação radioactiva distinguir este ensaio a partir do teste de deslocamento em gel tradicional ^5. Detecção de complexos de ligação é possível com a utilização de um anticorpo secundário acoplado a peroxidase de rábano (HRP), que converte um substrato de HRP, tetrametilbenzidina (TMB) a um produto de cor para a análise espectrofotométrica. O ensaio aqui relatado pode incorporar a utilização de oligonucleótidos de ADN mutados como controlo e pode ser utilizada para detecção de inibidores competitivos ou não-competitivos da ligação de DNA. O rastreio de compostos anti-tumorais novos também é possível com este ensaio.

Protocolo

Vários passos são realizados antes do tempo e vários reagentes são preparados e armazenados antes do procedimento seguinte: (1) cultura de células e isolamento de proteína, (2) preparação de oligonucleótido, (3) a preparação de placas de 96 poços, (4) o extracto nuclear durante a noite de incubação. Processo requer dois dias, devido à incubação durante a noite das proteínas nucleares com os oligonucleótidos de ADN.

1. Preparação de Amortecedores

1.1 isolamento de proteínas Nuclear

1. Tampão hipotónico: Para preparar 100 ml de tampão hipotónico, adicionar 1 ml (1 M de HEPES, pH 7,9), 150 ul (1 M MgCl _2), 333 ul (3 M KCl) a 98,3 ml de H ₂ O. As concentrações finais: 10 mM de HEPES, 1,5 mM de MgCl _2, 10 mM de KCl. Para tampão hipotónico + NP40 (para utilização no passo 2.11): Adicionar 0,5 ml (10% NP40) de 9,5 ml de tampão hipotónico por último NP40 a 0,5%.
2. Baixo Sal Tampão: Para preparar 100 ml de tampão de sal baixo (para uso na etapa 2.15), adicionar 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 25 ml de glicerol, 150 mL (1 M MgCl _2), 666 ul (3 M KCl), 40 ul (0,5 M de EDTA) a 73 ml de H ₂ O. As concentrações finais: HEPES 10 mM, 25% de glicerol, 1,5 mM de MgCl _2, KCl 20 mM, EDTA 0,2 mM.
3. Tampão de sal elevado: Para preparar 100 ml de tampão de elevado teor de sal (para utilização no passo 2.15), adicionar 1 ml (1 M de HEPES, pH 7,9), 25 ml de glicerol, 150 mL (1 M MgCl _2), 26,7 ml (3 M KCl), 40 ul (0,5 M de EDTA) a 47 ml de H ₂ O. As concentrações finais: HEPES 10 mM, 25% de glicerol, 1,5 mM de MgCl _2, KCl 800 mM, EDTA 0,2 mM.
4. 10% de NP40 Detergente: 10 ml de NP40 a 90 ml de _H2O
5. Os inibidores de protease e fosfatase [adicionado ao tampão hipotônico + NP40 (passo 2.11), ao buffer de sal baixo (passo 2.15), e tampão elevado de sal (passo 2.15) pouco antes de usar]: Adicionar 2,5 mL (1 M DTT) e 50 ul de inibidores de protease (100x) de 5 ml de cada tampão para uma concentração final de DTT 0,5 mM e inibidores de protease de 1x. A mistura da pasta de 100x inibidor de protease inclui:fluoreto de sódio (Ser / Thr, fosfatases ácidas), ortovanadato de sódio (Tyr, fosfatase alcalina), β-glicerofosfato (fosfatases Ser / Thr), pirofosfato de sódio (fosfatases Ser / Thr), Aprotinina (Ser proteases), Bestatina (amino-peptidases ), E64 (proteases de cisteína), leupeptina (proteases Ser / Cys), EDTA (metaloproteases).

1.2 Preparação das placas de ensaio

1. Placa de solução de fixação: Para preparar 500 ml de solução, adiciona-se carbonato de sódio a 5,25 g para 500 ml de _H2O, misturar bem e ajustar o pH a 9,7 para uma concentração final de carbonato de sódio 0,1 M.
2. Placa de solução de bloqueio: Para preparar estoque de poli dI / dC oligonucleótido, ressuspender 1 Unidade (~ 50 mg) de poli dI / dC em 1 ml de 10 mM Tris / HCl, pH 7,9, contendo EDTA 1 mM para uma concentração de estoque de 50 mg / ul. Banco é diluída para 1 mg / mL antes da utilização.

1,3 buffers de lavagem e diluições de anticorpos

NOTA: tampão de lavagem é Streptavidin utilizada para lavar pratos, entre adições e para diluir os anticorpos primários e secundários.

1. Para preparar 1 litro de tampão de lavagem de estreptavidina, adicionar 2,4 g de Tris / HCl, 37,5 ml (4 M de NaCl), 10 ml (10% de BSA), 5 ml (10% de Tween-20), a 1 L de água filtrada Millipore estéril , pH 7,18. Armazenar a 4 ° C. As concentrações finais: 20 mM Tris / HCl, NaCl 150 mM, 0,1% BSA, 0,05% Tween-20.

1.4 tampão de ligação ao DNA

NOTA: Este tampão é armazenado a -20 ° C.

1. Para preparar 15 ml de tampão de ligação de ADN, adicionar 180 ul (1 M de HEPES, pH 7,9), 300 ul (3 M KCl), 12 ul (0,5 M EDTA, pH 8,0), 7,5 mL (1 M DTT), 3,0 ml (60% de glicerol), 300 uL (50 ug / mL de poli dI / dC) diluída com água desionizada / destilada H ₂ O (12 ml). As concentrações finais: 12 mM HEPES / pH 7,9, KCl 60 mM, EDTA 0,4 mM, DTT 0,5 mM, 12% de glicerol, 1 ug / mL de poli dI / dC.

2. Cultura de Células e Isolamento Proteína Nuclear

t "> NOTA: A preparação requer cerca de 3 horas de estimulação de células dependerá de experiência O número de células utilizadas para cada experiência irá variar e todos os volumes de reflectir uma experiência típica usando 3 x 10 ⁷ células / ponto Ajustar para acomodar volumes... o número de células realmente usado na experiência ^6.

1. Para preparar proteína nuclear para ensaios de ligação de DNA, células humanas de cultura que expressam RUNX2 (endotelial, osteossarcoma, células de câncer de mama) nos meios de comunicação apropriados ^6.
2. Tratamento de células confluentes com nocodazole (0,2 ug / ml para 16 horas), para reter as células na fase G2 / M do ciclo celular ⁶ fronteira. Sob estas condições, a proteína é estabilizada RUNX2 e ADN ligação máxima é alcançada. Desta forma, a proteína nuclear suficiente disponível para ensaios múltiplos e inibidores podem ser comparados a partir da mesma preparação.
3. Para cada passo, pré-arrefecer a centrífuga a 4 ° C e preparar tampões e relaxar 20 min a 4 ° C antes da colheita de células.
4. Células Frio (4 ° C) e procedimentos de conduta no gelo.
5. Células centrifugar a 1.000 rpm por 5 min em 15 ml de polipropileno tubo de fundo redondo.
6. Wash 1x com PBS gelado (Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +} livre).
7. Centrifugar novamente e descartar PBS sobrenadante.
8. Adicionar 500 ul de tampão hipotónico, sem inibidores de protease, tendo o cuidado para ressuspender completamente o sedimento celular.
9. Transferir o conteúdo para um tubo de Eppendorf de 1,5 ml.
10. Centrifugar imediatamente a 5.500 rpm para 5,5 min; desprezar o sobrenadante e manter o pellet celular.
11. Ressuspender o sedimento celular em 500 ul de tampão hipotónico contendo 0,5% de NP40. Adicionar protease e inibidores de fosfatase e DTT 0,5 mM (conforme descrito no passo 1.1.5).
12. Deixar a amostra repousar em gelo durante 30 min.
13. Centrifugar a 13.000 rpm durante 10 min.
14. Descartar o sobrenadante (contém as proteínas citosólicas).
15. Ressuspender o sedimento em 60 mL nuclear cada um baixo saltampão T (para os quais os inibidores da protease e DTT 0,5 mM, foram adicionados a partir do passo 1.1.5) e tampão de elevado teor de sal (para os quais os inibidores da protease e DTT 0,5 mM, foram adicionados a partir do passo 1.1.5) para um total de 120 ul. Adicionar 60 ul de tampão de baixa salinidade para o sedimento primeiro e ressuspender, em seguida, adicionar 60 ul de tampão de alto teor salino. Vortex a pelota para ajudar na re-suspensão.

NOTA: Este passo ajuda a se livrar de algumas das proteínas da membrana nuclear e configurar para a etapa de lise: baixo teor de sal primeiro (ressuspender pellet, vortex), depois de alta de sal (vórtice) otimiza este passo. Manter extracto em gelo durante 30 min, com agitação em vórtex após os primeiros 10 min.

16. Centrifugar a 12.000 rpm durante 15 min, manter-se o sobrenadante contendo a proteína nuclear.
17. Medir a concentração de proteína (tentar manter amostras de 2-5 mg / ml), da alíquota em quantidades adequadas (10 mL / tubo) e armazenar a -80 ° C.

NOTA: rendimento estimado: 30 x 10 ⁶ cells irá dar origem a 5 ug / mL de proteína em 120 pi. 5 x 10 ⁶ células irá originar 2,2 ug / mL de proteína em 40 ul.

3. Preparação de Duplo Stranded Oligonucleotídeo

1. Projete oligonucleotídeos complementares com sites meia compatíveis nas extremidades. Para RUNX2 estes são: 5'-CGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATAC TCG-3'-biotina (sentido) e 5'CGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT T GTGGTT AATACG-3'-biotina (antisense).

NOTA: As experiências-piloto determinou que três sítios de ligação Runx2 e single-end biotina marcada produziu os resultados mais reprodutíveis.

2. Preparar tampão de emparelhamento 5x: Adicionar 300 ul (1 M Tris-HCl, pH 7,6), 30 ul (1 M MgCl _2), 10 ul (1 M DTT) a 260 mL _de H ₂ O (600 mL final).
3. Para 200 pmol de cada oligo de cadeia simplesonucleotide (3 mL), adicionar 12 ul de tampão de emparelhamento 5x e 45 mL _de H ₂ O para um total de 60 uL (200 pmol/60 ul).
4. Aquece-se a 95 ° C durante 5-10 min num bloco de aquecimento.
5. Arrefecer até 65 ° C lentamente (ajustando a temperatura para 65 ° C, leva-se 15 minutos), depois arrefece-se até à temperatura ambiente lentamente ao desligar a energia do bloco de aquecimento (ou colocando em 50 ml de água a 65 ° C num copo com gelo, o que demora cerca de 15-20 minutos).

4. Preparação de placas de 96 poços

NOTA: Não use proteínas do leite nos buffers de lavagem.

1. Fix placa com solução de fixação (carbonato de sódio 0,1 M): adicionam-se 300 ul / poço.
2. Incubar durante 2 horas por balançar à temperatura ambiente (RT), ou sem balançar a 4 ° C (S / N).
3. Lavar 3x com tampão de lavagem de placa de estreptavidina (WB): adicionam-se 300 ul / poço de cada vez.
4. Adicionar oligonucleótido de cadeia dupla marcado com biotina (sítios de ligação de consenso por três nucleótidos) durante 2 h wom de balanço (1,25 nmol / poço, 100 uL / ​​poço).
5. Lavar 3x com frio WB: adicionar 300 mL / poço e depois inverta imediatamente a placa em uma pia e secar as bordas sobre uma toalha de papel após cada adição.

NOTA: Não utilize pontas de pipeta para remover o líquido das placas, pois isso pode raspar avidina: biotina: complexos de DNA de poços. Faça isso para todos os passos de lavagem subsequentes.

5. Incubação com Extrato Nuclear

NOTA: Não substituir salmão ou arenque DNA do esperma para o poli tampão de bloqueio dI / DC. Evite bloquear placas com proteínas do leite. Ambos estes agentes bloqueadores resultar em elevados valores de fundo.

1. Incubar com fator de transcrição específico à base de extrato nuclear (90 mL / poço). Prepare uma mistura de mestre contendo extrato nuclear (proteína de ligação de DNA; 3-9 mg / poço) tampão + poli dI / DC (1 mg / mL a partir de um estoque de 50 mg / ul) em DNA 1x vinculativo. O volume é tão necessária para o número total depoços necessários (90 ul / poço).
2. Qualquer inibidor potencial, tais como a vitamina D3 (Figura 2) ou composto CADD 5.221.975 (Figura 3), ou a diluição apropriada do controlo de solvente, tal como etanol, é adicionado neste passo.
3. Coloque placa de balanço plataforma, O / N a 4 ° C.
4. Lavar 3x com WB: adicionar 300 uL / ​​poço

6. A adição de primário Anticorpo

NOTA: diluições anticorpo primário deve ser preparado - armazenamento não é recomendado.

1. Dilui-se o anticorpo monoclonal específico para RUNX2 (estoque 1 mg / mL) 1/5, 000, em tampão de lavagem de estreptavidina. Prepare o suficiente para a adição de cada poço da placa de 96 poços (90 ul / poço) em triplicado.
2. Incubar durante 1 hora à temperatura ambiente numa plataforma oscilante.
3. Lavar 3x com WB; adicionar 300 l / poço.

7. A adição de um anticorpo secundário

NOTA: diluições de anticorpos secundários podem ser stovermelho, a 4 ° C durante a noite, se necessário, no dia seguinte.

1. Diluir F purificada por afinidade, anticorpo conjugado com HRP (7,1 mg / ml) _{de ab-específica} para 1:1,400 em estreptavidina Tampão de lavagem: tampão de 3,5 ul antibody/5.0 ml de lavagem. Prepare o suficiente para a adição de cada poço da placa de 96 poços (90 ul / poço) em triplicado.
2. Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente numa plataforma oscilante.
3. Wash 6x com WB invertendo a placa em pia (300 mL / poço).

8. HRP Substrato e Desenvolvimento de Produto

1. Adicionar 50 mL de substrato TMB por poço diretamente do frasco estoque.
2. Incubar 10-20 minutos à temperatura ambiente no escuro (parar método de reação) ou medir absorção direta (monitoramento cinética contínua).

9. Medição Reaction

1. Pare método de reação: Para reação parada visual, verificar se há mudança de cor de claro a azul e parar de reação com ácido sulfúrico 50 mL.
2. Medir a absorvância a 450 nm como Biotrak II espectrofotômetro leitor de placa visível (Amersham Biosciences, GE Healthcare Biosciences Corp Piscataway NJ, EUA) ou um instrumento similar.
3. Método cinético contínuo monitoramento: Adicionar substrato após a última lavagem e apenas antes de colocar no espectrofotômetro (não pare a reacção).
4. Medir a absorvância a 635 nm com o Bio-Tek Synergy HT Multi-reação leitor de microplacas espectrofotômetro (Bio-Tek Instruments, Inc; Winooski, VT, EUA) ou um instrumento similar.

Resultados

O método D-ELISA é altamente específico para a proteína de ligação de ADN designado enquanto, um oligonucleótido específico da sequência de cadeia dupla contendo três cópias do local de ligação de consenso RUNX2 (ACACCA) é usado. O anticorpo primário que reconhece o factor de proteína, também aumenta a especificidade. O anticorpo secundário contém covalentemente ligado a peroxidase de rábano (HRP), que converte um substrato transparente (tetrametil benzidina) para um produto corado para facilidade de...

Discussão

Os ensaios de ligação de ADN são usadas para medir a capacidade de factores de transcrição que interagem com o ADN. Os ensaios para a ligação de ADN incluem deslocamento da mobilidade electroforética (EMSA) e ¹ immuneprecipitation cromatina (ChIP) Ensaios baseados em ^3, bem como ensaios que utilizem formatos de 96 cavidades ⁴ tais como ensaios quimioluminescentes ^2. A EMSA não é quantitativa e usa radioativo ⁽³² P) oligonucleotídeos. Estas são incubadas ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly dI/dC	GE Healthcare, Piscataway, NJ	US20539-5UN	1 U ~50mg
RUNX2 antibody	MBL International Corp., Woburn, MA	D130-3	1 mg/ml
Fab-specific peroxidase conjugated antibody	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A9917	7.1 mg/ml
TMB Substrate (tetramethyl benzidine)	EXALPHA Biologicals, Shirley, MA	X1189S	100 ml
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	57995	Plate-fixing
Sulfuric Acid	VWR, West Chester, PA	BDH-39922-1	Stop solution
Multi-well plates	Greiner Bio-One, Basel, Switzerland	655996	Avidin-coated, black sides
HALT	Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL	78440	Protease and phosphatase inhibitors
Chemicals	Various manufacturers	Laboratory grade
Table 1. Reagents
Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader	Amersham Biosciences		For use with stop reaction method
Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader	Bio-Tek Instruments, Inc.		For use with continuous kinetic monitoring
Table 2. Equipment