遺伝子発現のDNA相互作用、ディスカバー転写レギュレータ、および新規抗腫瘍剤を同定：タンパク質を研究するために、定量的アッセイ

要約

我々は、DNAと転写因子との相互作用を測定するための定量的なDNA結合性、ELISAベースのアッセイを開発した。 RUNX2タンパク質に対して高い特異性は、コンセンサスDNA認識オリゴヌクレオチドと特異的モノクローナル抗体を用いて達成された。酵素結合抗体基質反応と比色検出をリアルタイムでモニターした。

要約

このような電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）、化学発光アッセイ、クロマチン免疫沈降法（ChIP）に基づくアッセイ、およびマルチウェルベースの​​アッセイなどの多くのDNA結合アッセイは、転写因子活性を測定するために使用される。しかしながら、これらのアッセイは、非定量的である特異性を欠いている、放射性標識オリゴヌクレオチドの使用を含み得る、DNAおよび結合の阻害剤のスクリーニングに適用可能でなくてもよい。一方、定量的DNA結合酵素結合免疫吸着アッセイ（D-ELISA）アッセイを用いて、我々は、ビオチンに存在するコンセンサスDNA結合配列と特異的会合に依存RUNX2転写因子を用いてDNAを有する核タンパク質相互作用を実証する標識されたオリゴヌクレオチド。細胞は、核タンパク質の抽出、および二本鎖オリゴヌクレオチドの設計の調製が記載されている。アビジン被覆96ウェルプレートを、アルカリ性緩衝液で固定し、ブロッキング緩衝液中のヌクレオチド、核タンパク質と共にインキュベートする。 Follプレートを十分に洗浄するため、特異的一次抗体および二次抗体のインキュベーションは、比色反応の西洋ワサビペルオキシダーゼ基質及び現像を加えている。反応停止モードまたは連続的動力学的モニタリングを定量的DNAとタンパク質の相互作用を測定するために使用した。我々は、非特異的IgGとまたはタンパク質または一次抗体のない治療を含め、適切な特異性を制御し、議論する。アッセイのアプリケーションは、その薬剤スクリーニングにおける有用性​​と代表の正と負の結果が議論されているなど、記載されている。

概要

DNA結合アッセイは、DNAと相互作用する転写因子の能力を測定するのに有用である。 DNA結合のためのアッセイは、放射性標識オリゴヌクレオチドは^、1または化学発光アッセイ²に依存する電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）を含む。 96ウェルフォーマット^4を用いたクロマチンimmuneprecipitation法（ChIP）に基づくアッセイ³ならびにアッセイも記載されている。しかしながら、EMSA、放射性標識オリゴヌクレオチドの使用を必要とする非定量的アッセイである。核タンパク質は、特定のヌクレオチドプロモーター配列と会合する場合、結合複合体は、ポリアクリルアミドゲル上で遅角であり、特定の転写因子は、抗体「スーパーシフト」で検証することができる。我々は定義されたプロモーター要素iに対応するDNA結合配列とRUNX2の相互作用を測定することができる酵素結合免疫吸着フォーマット（D-ELISA）を用いて定量的DNA結合アッセイを開発したn個のRUNX2標的遺伝子。抗RUNX2抗体の使用は、アッセイに特異性を提供し、放射性標識の不足は、伝統的なゲルシフトアッセイ⁵からこのアッセイを区別する。結合複合体の検出は、分光測光分析のための着色生成物へのHRP基質テトラメチルベンジジン（TMB）を変換する西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）に結合された二次抗体を用いて可能である。ここで報告アッセイは、対照として変異したDNAオリゴヌクレオチドの使用を組み込むことができ、DNA結合の競合的又は非競合的阻害剤の検出のために使用することができる。新規な抗腫瘍化合物のスクリーニングは、このアッセイでも可能である。

プロトコル

いくつかのステップは、前もって実行され、いくつかの試薬は、処置の前に調製され、記憶される：（1）細胞培養およびタンパク質の単離、（2）オリゴヌクレオチドの調製、（3）96ウェルプレートを調製する、（4）核抽出物インキュベーション一晩。手順が原因DNAオリゴヌクレオチドとの核タンパク質の一晩のインキュベーションの2日間を必要とします。

1。バッファーの調製

1.1核タンパク質の分離

1. 低張緩衝液：98.3ミリリットルのH ₂ Oに1ミリリットル（1 M HEPES、pHは7.9）、150μL（1 M MgCl _2）中 、333μL（3 MのKCl）を追加し、低張緩衝液100mlを調製するために最終濃度：10mMのHEPES、1.5mMのMgCl _2、10mMのKCl。低張性緩​​衝液+ NP40（ステップ2.11で使用するため）の場合：9.5ミリリットルに、最終的な0.5％NP40のための低張性緩衝液を0.5ミリリットル（10％NP40）を追加します。
2. 低塩緩衝液：（ステップ2.15で使用するための）低塩緩衝液100mlを調製するには、1ミリリットル（1 M HEPES、pHは7.9）、25メートルを追加Lグリセロール、73ミリリットルのH ₂ Oに150μL（1 M MgCl _2）中、666μL（3 MのKCl）、40μL（0.5M EDTA）最終濃度：10mMのHEPES、25％グリセロール、1.5mMのMgCl _2を 、20のKCl、0.2mMのEDTA。
3. 高塩緩衝液：（ステップ2.15で使用するための）高塩緩衝液100mlを調製するには、1ミリリットル（1 M HEPES、pHは7.9）、25ミリリットルのグリセロール、150μL（1 M MgCl _2）中 、26.7ミリリットルを追加します（3男塩化カリウム）、47ミリリットルのH ₂ Oに40μL（0.5M EDTA）最終濃度：10mMのHEPES、25％グリセロール、1.5のMgCl _2、800のKCl、0.2mMのEDTA。
4. 10パーセントNP40洗剤：10ミリリットルNP40 90ミリリットルのH ₂ O
5. プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤[低張緩衝液に加え+ NP40（ステップ2.11）、低塩緩衝液（ステップ2.15）に、高塩緩衝液に（ステップ2.15）使用直前]：2.5μL（1 M DTT）を追加し、50 0.5mMのDTTおよび1×プロテアーゼ阻害剤の最終濃度は、各緩衝液5mlにプロテアーゼ阻害剤（100倍）を含有した。プロテアーゼ阻害100Xストック混合物が含まれています：フッ化ナトリウム（セリン/スレオニン、酸性ホスファターゼ）、オルトバナジウム酸ナトリウム（Tyrを、アルカリホスファターゼ）、β-グリセロリン酸（セリン/スレオニンホスファターゼ）、ピロリン酸ナトリウム（セリン/スレオニンホスファターゼ）、アプロチニン（セリンプロテアーゼ）、ベスタチン（アミノペプチダーゼ）、E64（システインプロテアーゼ）、ロイペプチン（SER /システインプロテアーゼ）、EDTA（メタロプロテアーゼ）。

1.2アッセイプレートの調製を

1. プレート定着液：500mlの溶液を調製した500mlのH ₂ Oに5.25グラムの炭酸ナトリウムを追加し、よく混合し、0.1 Mの炭酸ナトリウムを最終濃度9.7にpHを調整する。
2. ソリューション遮光板：株価ポリのdI / DCオリゴヌクレオチドを​​調製するためには、pHが7.9を50μgの/のストック濃度は1 mMのEDTAを含む、10mMトリス/ HClを1ミリリットル中のポリのdI / DCの1号機（〜50 mg）を再懸濁μL。ストックは/μlの使用前に1μgのに希釈する。

1.3洗浄バッファー、抗体希釈液

NOTE：ストレプト洗浄緩衝液である添加の間に、プレートを洗浄し、一次および二次抗体を希釈する。

1. ストレプトアビジンを洗浄緩衝液1 Lを調製し、2.4グラムトリス/ HCl、37.5ミリリットル（4 M NaCl）を10mlの（10％BSA）を5ml（10％Tween-20）で、1 Lミリポア濾過滅菌水を追加、pHは7.18。 4℃で保存する最終濃度：20mMのトリス/ HCl、150mMのNaCl、0.1％BSA、0.05％のTween-20。

1.4 DNA結合バッファー

注：このバッファは、-20℃で保存する

1. DNA結合緩衝液15ミリリットルを準備するために、180μL（1 M HEPES、pHは7.9）、300μL（3 MのKCl）、12μL（0.5M EDTA、pH8.0）を、7.5μL（1 M DTT）、3.0ミリリットルを追加蒸留/脱イオンH ₂ O（12ml）で希釈した（60％グリセロール）を300μl（50μgの/μlのポリのdI / dCを）。最終濃度：12のHEPES / PH 7.9、60のKCl、0.4mMのEDTA、0.5mMのDTT、12％グリセロール、1μgの/μLポリのdI / DC。

2。細胞培養および核タンパク質の単離

T ">注：準備は約3時間を必要とする細胞の刺激は、実験に依存し、各実験のために使用される細胞の数は変化し、すべてのボリュームが3×10 ⁷細胞/ポイントを使用して典型的な実験を反映し対応するためにボリュームを調整してください。。。実際に、実験⁶において使用される細胞数。

1. DNA結合アッセイ、適切な培地中で⁶ RUNX2（内皮、骨肉腫、乳癌細胞）を発現する培養ヒト細胞について核タンパク質を調製した。
2. G2 / M細胞周期境界⁶で細胞を停止させるためにノコダゾール（16時間0.2μg/ ml）をしてフルエント細胞を処理。これらの条件下で、RUNX2タンパク質を安定化し、最大結合DNAが達成される。このように、十分な核タンパク質は、同じ製剤から比較することができ、複数のアッセイおよび阻害剤の使用可能です。
3. 各ステップについては、4℃に遠心分離を予め冷却して緩衝液を調製し、細胞採取前に4℃で20分間冷やす。
4. チル細胞（4℃）し、氷上で行動手順。
5. 15mlのポリプロピレン丸底チューブ内で5分間1,000 rpmで遠心分離細胞。
6. 氷冷PBSで洗浄1X（Ca ^{2 +}およびMg ^{2 +}を含まない）。
7. 再び遠心分離し、PBS上清を捨てる。
8. 完全に細胞ペレットを再懸濁するように注意しながら、プロテアーゼ阻害剤なしで低張緩衝液500μlを追加します。
9. 1.5ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブにコンテンツを転送します。
10. すぐに5.5分間5,500 rpmで遠心、上清を捨て、細胞ペレットをキープ。
11. 0.5％NP40を含む低張緩衝液500μl中で細胞ペレットを再懸濁します。プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤および0.5mMのDTTを（ステップ1.1.5に記載のように）入れる。
12. サンプルは30分間氷上で休むことができます。
13. 10分間13,000 rpmで遠心分離する。
14. 上清（細胞質ゾルのタンパク質を含む）を廃棄します。
15. 60μlの低SALの各々における核ペレットを再懸濁120μLの合計（プロテアーゼ阻害剤および0.5mMのDTT、手順1.1.5から追加されたため）、Tバッファと高塩緩衝液（プロテアーゼ阻害剤および0.5mMのDTT、手順1.1.5から追加されたため）。最初にペレットを再懸濁し、低塩緩衝液60μl加え、次いで、高塩緩衝液60μlを加える。再懸濁を支援するために、ペレットをボルテックスする。

注：この手順は、核膜タンパク質のいくつかを取り除くのに役立ちますし、溶解工程のために設定：低塩一（ペレットを再懸濁し、ボルテックス）、次いで、高塩（渦）は、この手順を最適化します。最初の10分後にボルテックスしながら、30分間氷上で抽出しておいてください。

16. 15分間12,000 rpmで遠心する。核タンパク質を含む上清を保つ。
17. タンパク質濃度を測定します（2-5 mg / mlのでサンプルを維持しようとする）、-80℃で適切な量（10μL/管）や店舗での分量

注：推定収量：30×10 ⁶セル画LSは、120μlの5μgの/μLタンパク質が得られます。 5×10 ^6個の細胞を40μlに2.2μgの/μLタンパク質が得られます。

3。二本鎖オリゴヌクレオチドの調製

1. 両端の互換性のハーフサイトに相補的なオリゴヌクレオチドを​​設計します。 RUNX2のために、これらは、以下のとおりです。5'-CGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATAC TCG-3'-ビオチン（センス）および5'CGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT T GTGGTT AATACG-3'-ビオチン（アンチセンス）。

注：3 RUNX2結合部位およびシングルエンドビオチン標識は、最も再現性のある結果が得られたと判断したパイロット実験。

2. 5Xアニーリング緩衝液を準備します。260μlのH ₂ O（最終600μL）に300μL（1 Mトリス塩酸、pH 7.6）、30μL（1 M MgCl _2）中 、10μL（1 M DTT）を追加します。
3. 各一本鎖oligの200ピコモルへonucleotide（3μL）、60μL（200 pmol/60μL）、合計5倍アニーリング緩衝液12μlの45μlのH ₂ Oを加える。
4. 加熱ブロック内の5〜10分間95℃で加熱する。
5. 加熱ブロックの電源をオフに（または65℃の水50ml中に配置することにより、徐々に室温に冷却し、ゆっくりと65°C（65°Cまで温度を設定することによって、それが15分を要する）、その後に冷却氷上のビーカー中の、これは15〜20分かかります）。

4。 96ウェルプレートの調製

注：洗浄バッファに乳タンパク質を使用しないでください。

1. 定着液（0.1M炭酸ナトリウム）でプレートを修正：300μL/ウェルを追加。
2. 室温（RT）で揺れていない場合、または4°C（O / N）で揺動させ、2時間インキュベートする。
3. ストレプトアビジン洗浄バッファー（WB）でプレート3回洗浄：300μL/ウェルのたびに追加します。
4. W 2時間、ビオチン標識二本鎖オリゴヌクレオチド（ヌクレオチドあたり3コンセンサス結合部位）を追加ITH（1.25ナノモル/ウェル;100μl/ウェル）ロッキング。
5. 冷たいWBで洗浄3Xは：300μL/ウェルを追加してから、すぐに流しにプレートを反転し、各添加後にペーパータオルの上縁を吸い取る。

注：井戸からDNA複合体：ビオチン：これはアビジンをこすり可能性があるプレートから流体を除去するためにピペットチップを使用しないでください。それ以降のすべての洗浄ステップのためにこれを行う。

5。核抽出物とのインキュベーション

注：ポリのdI / DCブロッキングバッファ用のサケやニシン精子DNAを代用しないでください。乳タンパク質でプレートをブロックしないようにしてください。これらのブロッキング剤は、いずれも高いバックグラウンド値になる。

1. 核抽出物（90μL/ウェル）から調製された特異的な転写因子でインキュベートする。結合緩衝液1X DNA中（50μgの/ ULストックから/μL1μg）を+ポリのdI / DC;核抽出物を含有するマスターミックスを調製（3-9μgの/ウェルのDNA結合タンパク質）。ボリュームは総数のために必要とされる必要なウェル（90μL/ウェル）。
2. 例えばビタミンD3（ 図2）又はCADD化合物5221975（ 図3）、又はエタノールなどの溶媒対照、適切に希釈として任意の潜在的な阻害剤は、この工程で添加される。
3. 4℃でO / N、プラットフォームをロッキングの上に置いてプレート
4. WBで洗浄3Xは：300μL/ウェルを追加

6。一次抗体を加え

注：一次抗体希釈液を新たに調製する必要がある - ストレージはお勧めしません。

1. RUNX2特異的モノクローナル抗体（株式1μgの/μL）1/5に希釈する、ストレプトアビジンでの000は、バッファを洗う。三重に（90μlの/ウェル）を96ウェルプレートの各ウェルに添加するために十分に準備する。
2. ロッキングプラットフォーム上で室温で1時間インキュベートする。
3. WBで洗浄3Xは、300μL/ウェルを追加。

7。二次抗体の添加

注：二次抗体希釈はSTO可能4℃で一晩、赤であれば、次の日必要としていました。

1. ストレプト洗浄緩衝液中で1:1,400に希釈F _AB-特異的親和性精製し、HRP結合抗体（7.1 mg / mlのストック）：3.5μLantibody/5.0 mlの洗浄バッファー。三重に（90μlの/ウェル）を96ウェルプレートの各ウェルに添加するために十分に準備する。
2. ロッキングプラットフォーム上で室温で30分間インキュベートする。
3. シンク（300μL/ウェル）にプレートを反転させてWBで洗浄6X。

8。 HRP基質および製品開発

1. ストックボトルから直接ウェルあたりTMB基質50μlのを追加します。
2. 暗闇の中で、室温で10〜20分インキュベートする（反応法を停止）または直接（連続運動モニタリング）の吸光度を測定します。

9。反応測定

1. 反応方法を停止します。視覚的な停止反応のために、透明から青に色の変化を確認し、50μlの硫酸で反応を停止。
2. 450 nmの吸光度を測定してバイオトラックII可視プレートリーダー分光光度計（Amersham Biosciences社、GEヘルスケアバイオサイエンス社ピスカタウェイNJ、USA）または類似の器具。
3. 連続運動監視方法：最後の洗浄後に基板を追加して、直前に、分光光度計に配置する（反応を停止しないでください）​​。
4. バイオテックシナジーHTマルチ反応マイクロプレートリーダー分光光度計を用いて635 nmの吸光度を測定（バイオテック·インスツルメンツ社、ウィヌースキ、バーモント州、米国）、または類似の楽器。

結果

D-ELISA法であれば、コンセンサス結合部位RUNX2（ACACCA）の3つのコピーを含有する配列特異的二本鎖オリゴヌクレオチドが使用されているとして指定DNA結合タンパク質に高度に特異的である。タンパク質因子を認識し、一次抗体は、特異性を向上させます。二次抗体は、検出を容易にします（ 図1）の着色生成物に明確な基質（テトラメチルベンジジン）に変換共有結合した西洋ワ?...

ディスカッション

DNA結合アッセイは、DNAと相互作用する転写因子の能力を測定するために使用される。 DNA結合のためのアッセイは、電気泳動移動度シフト^（EMSA）1およびクロマチンimmuneprecipitation（チップ）に基づくアッセイ³だけでなく、このような化学発光アッセイ²として96ウェルフォーマット^4を採用^したアッセイが含まれる。 EMSAは、非定量的であり、放射性標識...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly dI/dC	GE Healthcare, Piscataway, NJ	US20539-5UN	1 U ~50mg
RUNX2 antibody	MBL International Corp., Woburn, MA	D130-3	1 mg/ml
Fab-specific peroxidase conjugated antibody	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A9917	7.1 mg/ml
TMB Substrate (tetramethyl benzidine)	EXALPHA Biologicals, Shirley, MA	X1189S	100 ml
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	57995	Plate-fixing
Sulfuric Acid	VWR, West Chester, PA	BDH-39922-1	Stop solution
Multi-well plates	Greiner Bio-One, Basel, Switzerland	655996	Avidin-coated, black sides
HALT	Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL	78440	Protease and phosphatase inhibitors
Chemicals	Various manufacturers	Laboratory grade
Table 1. Reagents
Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader	Amersham Biosciences		For use with stop reaction method
Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader	Bio-Tek Instruments, Inc.		For use with continuous kinetic monitoring
Table 2. Equipment