כמותי Assay לחקר חלבון: אינטראקציות-DNA, רגולטורים גלו תעתיק של ביטוי גנים, ולזהות חומרים אנטי סרטניים רומן

Summary

פיתחנו assay כמותיים-DNA מחייבת, המבוסס על ELISA למדוד אינטראקציות עם גורם שעתוק ה-DNA. סגוליות גבוהה לחלבון Runx2 הושג עם oligonucleotide DNA לזיהוי קונסנסוס ונוגדנים חד שבטיים ספציפיים. איתור Colorimetric עם תגובת מצע נוגדנים בשילוב אנזים היה פיקוח בזמן אמת.

Abstract

מבחני ה-DNA מחייבת רבים כגון מבחני משמרת ניידות electrophoretic (EMSA), מבחני chemiluminescent, immunoprecipitation הכרומטין (שבב) המבוסס על מבחני, ומבחנים מבוססי multiwell משמשים למדידת פעילות גורם שעתוק. עם זאת, מבחני אלה הם nonquantitative, חסרי ייחוד, עשוי להיות כרוכים בשימוש בoligonucleotides רדיואקטיבי, ולא יכולים להיות ישים להקרנה של מעכבים של ה-DNA המחייבים. מצד השני, באמצעות assay כמותיים-DNA מחייבת צמוד אנזים immunosorbent (D-ELISA) assay, אנחנו מדגימים אינטראקציות חלבון גרעיניות עם ה-DNA באמצעות גורם שעתוק Runx2 שתלוי בקשר ספציפי עם רצפי ה-DNA מחייבת קונסנסוס נוכחי ביוטין oligonucleotides שכותרתו. הכנת תאים, מיצוי של חלבון גרעיני, ועיצוב של oligonucleotides גדילים הכפולה מתוארים. צלחות 96 היטב מצופה Avidin קבועות עם חיץ אלקליין וטופחו עם חלבונים גרעיניים במאגר נוקלאוטיד חסימה. Follבשל שטיפה נרחבת של הצלחות, נוגדן ראשוני ספציפי וincubations נוגדנים משני ואחריו התוספת של מצע חזרת peroxidase ופיתוח של תגובת colorimetric. מצב תגובת עצירה או ניטור רציף הקינטית שימש למדידת אינטראקציה חלבון עם DNA כמותית. אנחנו דנים בבקרות ספציפיות מתאימות, כוללים טיפול עם IgG אינו ספציפי או בלי חלבון או נוגדן ראשוני. יישומים של assay מתוארים כוללים השירות שלה בהקרנת סמים ותוצאות חיוביות ושליליות נציג הם דנו.

Introduction

יש מבחני ה-DNA מחייבת שירות במדידת היכולת של גורמי שעתוק כדי לקיים אינטראקציה עם ה-DNA. מבחני עבור ה-DNA מחייבים לכלול מבחני electrophoretic משמרת ניידות (EMSA) שתלויים בoligonucleotides radiolabeled ¹ או מבחני chemiluminescence ^2. מבחני מבוססים immuneprecipitation הכרומטין (שבב) ^3, כמו גם מבחני העסקת פורמטי 96 היטב ⁴ גם תוארו. עם זאת, EMSA הוא assay שאינו כמותיים הדורש את השימוש של oligonucleotides רדיואקטיבי. כאשר חלבונים גרעיניים לקשר עם רצפי אמרגן נוקלאוטיד הספציפיים, מתחמי מחייבים הם מפגרים בג'לים polyacrylamide וגורמים שעתוק הספציפי יכול להיות מאומת עם "supershift" נוגדן. פיתחנו assay-DNA מחייבת כמותית באמצעות פורמט צמוד אנזים immunosorbent (D-ELISA), אשר מסוגל למדוד את האינטראקציה של Runx2 עם רצפי ה-DNA מחייבת המתאימים לאלמנטי אמרגן מוגדרים iגנים מטרת Runx2 n. שימוש בנוגדן אנטי Runx2 מספק סגוליות לassay וחוסר radiolabel להבחין assay זה מassay משמרת ג'ל המסורתי ^5. איתור של מתחמים מחייבים אפשרי עם השימוש בנוגדנים משני מצמידים את חזרת peroxidase (HRP), אשר ממיר מצע HRP, tetramethyl benzidine (TMB) למוצר בצבע לניתוח spectrophotometric. Assay דיווח כאן ניתן לשלב את השימוש של oligonucleotides DNA מוטציה שולטת ויכול לשמש לזיהוי של מעכבים תחרותיים או לא תחרותיים של ה-DNA המחייב. ההקרנה של תרכובות אנטי סרטניים רומן אפשרי גם עם assay זה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כמה צעדים מבוצעים מבעוד מועד וכמה חומרים כימיים מוכנים ומאוחסנים לפני ההליך: (1) בידוד תרבית תאים וחלבונים, (2) הכנת oligonucleotide, (3) הכנת צלחות 96 היטב, (4) תמצית גרעינית לילה דגירה. הליך דורש 2 ימים בגלל הדגירה הלילה של חלבון גרעיני עם oligonucleotides ה-DNA.

1. הכנת חוצצים

1.1 בידוד חלבון גרעיני

1. Hypotonic הצפת: כדי להכין של חיץ hypotonic 100 מיליליטר, להוסיף 1 מיליליטר (1 M HEPES, pH 7.9), 150 μl (1 M MgCl _2), 333 μl (3 M KCl) ל98.3 מיליליטר H ₂ O. ריכוזים סופיים: 10 HEPES מ"מ, 1.5 מ"מ MgCl _2, 10 מ"מ KCl. לחיץ hypotonic + NP40 (לשימוש בשלב 2.11): הוסף 0.5 מיליליטר (NP40 10%) ל9.5 חיץ hypotonic מיליליטר לNP40 0.5% סופיים.
2. דלת מלח הצפת: כדי להכין של חיץ נמוך מלח (לשימוש בשלב 2.15) 100 מיליליטר, להוסיף 1 מיליליטר (1 M HEPES, pH 7.9), 25 מגליצרול ליטר, 150 μl (1 M MgCl _2), 666 μl (3 M KCl), 40 μl (0.5 M EDTA) ל73 מיליליטר H ₂ O. ריכוזים סופיים: 10 HEPES מ"מ, 25% גליצרול, 1.5 מ"מ MgCl _2, 20 מ"מ KCl, 0.2 mM EDTA.
3. מלח גבוה הצפת: כדי להכין של חיץ מלח גבוה (לשימוש בשלב 2.15) 100 מיליליטר, להוסיף 1 מיליליטר (1 M HEPES, pH 7.9), 25 מיליליטר גליצרול, 150 μl (1 M MgCl _2), 26.7 מיליליטר (3 M KCl), 40 μl (0.5M EDTA) ל47 מיליליטר H ₂ O. ריכוזים סופיים: 10 HEPES מ"מ, 25% גליצרול, 1.5 מ"מ MgCl _2, 800 מ"מ KCl, 0.2 mM EDTA.
4. 10% דטרגנט NP40: NP40 ל10 מיליליטר 90 מיליליטר H ₂ O
5. [+ NP40 (שלב 2.11), לחיץ מלח נמוך (שלב 2.15), וחיץ מלח גבוה (שלב 2.15) רק לפני השימוש מתווסף למאגר hypotonic] מעכבי פרוטאז ו phosphatase: הוסף 2.5 μl (1 M DTT) ו50 μl של מעכבי פרוטאז (100x) עד 5 מיליליטר של מאגר זה לריכוז סופי של 0.5 מ"מ DTT ומעכבי פרוטאז 1x. תערובת מניית 100x מעכבי פרוטאז כוללת:פלואוריד הנתרן (Ser / Thr, phosphatases חומצי), orthovanadate נתרן (Tyr, phosphatases אלקליין), β-glycerophosphate (phosphatases Ser / Thr), pyrophosphate נתרן (phosphatases Ser / Thr), Aprotinin (פרוטאזות Ser), Bestatin (אמינו-peptidases ), E64 (פרוטאזות ציסטאין), leupeptin (פרוטאזות Ser / Cys), EDTA (metalloproteases).

1.2 הכנת צלחות assay

1. צלחת תיקון פתרון: כדי להכין 500 מיליליטר של תמיסה, להוסיף סודיום קרבונט 5.25 גרם ל500 מיליליטר H ₂ O, ומערבב היטב ולהתאים את ה-pH ל 9.7 לריכוז סופי של M 0.1 סודיום קרבונט.
2. צלחת חסימת פתרון: כדי להכין פולי מניית די / DC oligonucleotide, יחידת resuspend 1 (~ 50 מ"ג) של פולי די / DC ב 1 מיליליטר של 10 מ"מ טריס / HCl, pH 7.9 מכיל 1 mM EDTA לריכוז מניות של 50 מיקרוגרם / μl. המניה מדוללת ל1 מיקרוגרם / μl לפני השימוש.

1.3 מאגרים לשטוף ודילולי נוגדן

הערה: לשטוף חיץ Streptavidin הוא נהג לשטוף את הצלחות בין תוספות ולדלל נוגדנים ראשוניים ומשניים.

1. כדי להכין 1 ליטר של חיץ לשטוף Streptavidin, להוסיף 2.4 גרם טריס / HCl, 37.5 מיליליטר (4 M NaCl), 10 מיליליטר (BSA 10%), 5 מיליליטר (10% Tween-20), עד 1 ליטר מים מסוננים Millipore סטרילי , PH 7.18. חנות ב 4 ° C. ריכוזים סופיים: 20 מ"מ טריס / HCl, 150 mM NaCl, BSA 0.1% Tween-20 0.05%.

1.4 חיץ-DNA מחייבת

הערה: חיץ זה מאוחסן ב -20 ° C.

1. כדי להכין 15 מיליליטר של חיץ מחייב DNA, להוסיף 180 μl (1 M HEPES, pH 7.9), 300 μl (3 M KCl), 12 μl (0.5 M EDTA, pH 8.0), 7.5 μl (1 M DTT), 3.0 מיליליטר (גליצרול 60%), 300 μl (50 מיקרוגרם / μl פולי די / DC) בדילול מלא עם H deionized / מזוקק ₂ O (12 מיליליטר). ריכוזים סופיים: 12 HEPES מ"מ / pH 7.9, 60 מ"מ KCl, 0.4 mM EDTA, 0.5 מ"מ DTT, גליצרול 12%, 1 מיקרוגרם / μl פולי די / DC.

2. תרבית תאים ובידוד חלבון גרעיני

t "> הערה: ההכנה דורשת שעות על 3 גירוי של תאים יהיה תלויה בניסוי מספר התאים המשמשים עבור כל ניסוי ישתנה וכל הכרכים משקפים ניסוי טיפוסי באמצעות 3 x 10 ⁷ תאים / נקודה התאם כרכים כדי להכיל... מספר התא למעשה השתמש בניסוי ^6.

1. כדי להכין חלבון גרעיני למבחנים מחייבים DNA, תאים אנושיים תרבות המבטאים Runx2 (אנדותל, אוסטאוסרקומה, תאי סרטן השד) בתקשורת המתאימה ^6.
2. טיפול בתאים subconfluent עם nocodazole (0.2 מיקרוגרם / מיליליטר ל16 hr) לעצור את התאים בגבול מחזור תא G2 / M ^6. בתנאים אלה, חלבון Runx2 הוא התייצב וה-DNA מחייב המקסימאלי מושגת. בדרך זו, חלבון גרעיני מספיק זמין עבור ניתן להשוות מבחני ומעכבים מרובים מאותה ההכנה.
3. לכל שלב, מראש לקרר את צנטריפוגות כדי 4 מעלות צלזיוס ולהכין מאגרים ולצנן 20 דקות ב 4 ° C לפני קציר תא.
4. תאי צ'יל (4 מעלות צלזיוס) ונהלי התנהגות על קרח.
5. תאי צנטריפוגה ב 1,000 סל"ד במשך 5 דקות בצינור מסביב לתחתית 15 פוליפרופילן מיליליטר.
6. לשטוף 1x עם PBS קר כקרח (Ca ^{2 +} ו Mg ^{2 +} חינם).
7. שוב צנטריפוגה ולהשליך supernatant PBS.
8. הוסף 500 μl של חיץ hypotonic ללא מעכבי פרוטאז, להיות זהיר, כדי resuspend התא גלולה לחלוטין.
9. העבר את התוכן לצינור 1.5 מיליליטר Eppendorf.
10. מייד צנטריפוגות ב 5,500 סל"ד 5.5 דקות, לבטל את supernatant ולשמור על התא גלולה.
11. Resuspend התא גלולה ב μl 500 של חיץ hypotonic המכיל NP40 0.5%. הוספת פרוטאז ומעכבי phosphatase ו0.5 מ"מ DTT (כמתואר בשלב 1.1.5).
12. לאפשר המדגם לנוח על קרח למשך 30 דקות.
13. צנטריפוגה ב 13,000 סל"ד 10 דקות.
14. בטל supernatant (מכיל חלבוני cytosolic).
15. Resuspend את הכדור הגרעיני ב60 μl כל אחד מסאל הנמוךחיץ לא (שלמעכבי פרוטאז ו0.5 מ"מ DTT נוספו מהצעד 1.1.5) וחיץ מלח גבוה (שלמעכבי פרוטאז ו0.5 מ"מ DTT נוספו מהצעד 1.1.5) עבור סכום כולל של 120 μl. הוסף 60 μl של חיץ מלח נמוך לגלולה ראשונה ו resuspend, לאחר מכן להוסיף 60 μl של חיץ מלח גבוה. מערבולת בגלולה כדי לסייע בresuspension.

הערה: שלב זה עוזר להיפטר מכמה מחלבוני קרום הגרעין ולהגדיר עבור שלב תמוגה: מלח נמוך הראשונה (גלולה resuspend, מערבולת), ולאחר מכן מלח גבוה (מערבולת) מייעל את הצעד הזה. שמור על תמצית על קרח למשך 30 דקות, עם vortexing אחרי הראשון 10 דקות.

16. צנטריפוגה ב 12,000 סל"ד במשך 15 דקות, לשמור את supernatant המכיל חלבון הגרעיני.
17. למדוד את ריכוז חלבון (מנסה לשמור על דגימות ב2-5 מ"ג / מיליליטר), aliquot בכמויות מתאימות (10 μl / צינור) ולאחסן ב -80 ° C.

הערה: תשואה משוערת: 30 x 10 ⁶ cells יניבו 5 מיקרוגרם / μl חלבון ב120 μl. 5 x 10 ⁶ תאים יניבו 2.2 מיקרוגרם / μl חלבון ב40 μl.

3. הכנת הגדילים הכפול Oligonucleotide

1. עיצוב oligonucleotides משלימה עם חצי אתרים תואמים בקצותיו. לRunx2 אלה הם: 5'-CGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATAC TCG-3'-ביוטין (תחושה) ו5'CGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT T GTGGTT AATACG-3'-ביוטין (antisense).

הערה: ניסויי פיילוט קבעו כי שלושה אתרי קישור Runx2 וביוטין שכותרתו חד הסוף הניבו את התוצאות לשחזור ביותר.

2. הכן את חיץ חישול 5x: הוסף 300 μl (1 M טריס-HCl, pH 7.6), 30 μl (1 M MgCl _2), 10 μl (1 M DTT) ל260 μl H ₂ O (μl 600 הסופי).
3. 200 pmol של כל olig חד גדיליםonucleotide (3 μl), להוסיף 12 μl של חיץ חישול 5x ו45 μl H ₂ O עבור סכום כולל של 60 μl (200 pmol/60 μl).
4. חום ב-C ° 95 ל5-10 דק בבלוק חימום.
5. מגניב 65 מעלות צלזיוס לאט (על ידי הגדרת הטמפרטורה ל 65 מעלות צלזיוס, זה לוקח 15 דקות), ואז להתקרר לטמפרטורת חדר באיטיות על ידי כיבוי כוחו של בלוק החימום (או על ידי הצבת ב50 מיליליטר של המים 65 מעלות צלזיוס בכוס בקרח, זה לוקח 15-20 דק ').

4. הכנת צלחות 96 היטב

הערה: אל תשתמש בחלבוני חלב במאגרים לשטוף.

1. תקן את הצלחת עם פתרון תיקון (M 0.1 סודיום קרבונט): להוסיף 300 μl / טוב.
2. דגירה עבור שעה 2 על ידי נדנדה בטמפרטורת חדר (RT), או שלא מתנדנדים על 4 מעלות צלזיוס (O / N).
3. לשטוף 3x צלחת עם חיץ לשטוף streptavidin (WB): להוסיף 300 μl / טוב בכל פעם.
4. הוספת oligonucleotide שכותרתו ביוטין פעמיים תקועים (3 קונסנסוס אתרי קישור לכל נוקלאוטיד) במשך שעה 2 wה-i נדנדה (1.25 nmol / טוב; 100 μl / טובה).
5. 3x לשטוף עם WB הקר: להוסיף 300 μl / טוב ולאחר מכן להפוך באופן מיידי את הצלחת לתוך כיור ולמחוק את הקצוות על מגבת נייר לאחר כל הוספה.

הערה: אל תשתמש בטיפי פיפטה כדי להסיר נוזל מהצלחות כמו זו עלולה לגרד avidin: ביוטין: מתחמי ה-DNA מהבארות. האם זה עבור כל הצעדים לשטוף לאחר מכן.

5. דגירה עם תמצית גרעינית

הערה: אין תחליף סלמון או DNA זרע הרינג לפולי מאגר חסימת di / DC. למנוע חסימת צלחות עם חלבוני חלב. שני סוכני חסימה אלה לגרום לערכי רקע גבוהים.

1. דגירה עם גורם שעתוק ספציפי שהוכן מתמצית גרעינית (90 μl / טוב). הכן תערובת אב המכילה תמצית גרעינית (חלבון קושר DNA; 3-9 מיקרוגרם / טוב) + פולי די / DC (מיקרוגרם / μl 1 מ מיקרוגרם / מניית ul 50) ב1x-DNA מחייב חיץ. נפח נדרש כלמספר הכולל שלבארות הנדרשות (90 μl / טוב).
2. כל מעכב פוטנציאלי, כגון ויטמין D3 (איור 2) או תרכובת CADD 5,221,975 (איור 3), או הדילול המתאים של שליטת הממס, כגון אתנול, הוא הוסיף בשלב זה.
3. צלחת מניח על הנדנדה פלטפורמה, O / N ב 4 ° C.
4. 3x לשטוף עם WB: להוסיף 300 μl / טוב

6. תוספת של נוגדן הראשוני

הערה: צריכים להיות מוכנים טריים דילולים נוגדן ראשוניים - האחסון אינו מומלץ.

1. מדולל נוגדנים חד שבטיים Runx2 הספציפי (מיקרוגרם / μl מניות 1) 1/5, 000 בStreptavidin לשטוף חיץ. הכן מספיק לתוספת היטב בכל הצלחת 96 היטב (90 μl / טוב) בשלושה עותקים.
2. דגירה עבור שעה 1 ב RT על פלטפורמת נדנדה.
3. 3x לשטוף עם WB; להוסיף 300 μl / טוב.

7. תוספת של נוגדנים משני

הערה: דילולים נוגדנים משני יכולים להיות stoאדום ב 4 ° C למשך הלילה במידת צורך ביום שלמחרת.

1. מדולל נוגדנים מצומדות (7.1 מ"ג / מיליליטר מניות) F _ab ספציפי זיקה מטוהרת-HRP ל1:1,400 בStreptavidin לשטוף חיץ: לשטוף חיץ מיליליטר antibody/5.0 3.5 μl. הכן מספיק לתוספת היטב בכל הצלחת 96 היטב (90 μl / טוב) בשלושה עותקים.
2. דגירה במשך 30 דקות ב RT על פלטפורמת נדנדה.
3. לשטוף 6x עם WB על ידי היפוך צלחת לכיור (300 μl / טוב).

8. HRP תשתית ופיתוח מוצרים

1. הוסף 50 μl של מצע TMB לכל גם ישירות מבקבוק מניות.
2. דגירה 10-20 דקות ב RT בחושך (להפסיק שיטת תגובה) או למדוד את הספיגה ישירות (ניטור רציף קינטית).

9. מדידת תגובה

1. תפסיק שיטת תגובה: לתגובת ראייה תחנה, לבדוק לשינוי צבע ברור לכחולים ולהפסיק תגובה עם 50 חומצה גופרתית μl.
2. למדוד הספיגה ב ננומטר 450 עםספקטרופוטומטר Biotrak השני צלחת גלויה הקורא (Biosciences Amersham; GE Healthcare Biosciences קורפ Piscataway ניו ג'רזי, ארה"ב) או מכשיר דומה.
3. שיטה רציפה הקינטית ניטור: הוסף מצע לאחר השטיפה האחרונה ורק לפני הצבת בספקטרופוטומטר (לא לעצור את התגובה).
4. למדוד הספיגה ב ננומטר 635 עם ספקטרופוטומטר Bio-Tek Synergy HT Multi-תגובת microplate הקורא (Bio-Tek מכשירים, Inc; Winooski, VT, ארה"ב) או מכשיר דומה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

שיטת D-ELISA היא מאוד ספציפית לחלבון קושר DNA המיועד עוד, oligonucleotide פעמיים תקוע רצף ספציפי המכיל שלושה עותקים של אתר קישור Runx2 הקונצנזוס (ACACCA) משמש. הנוגדן הראשוני הכרה בגורם החלבון גם משפר את הספציפיות. הנוגדנים משני מכילים peroxidase חזרת קוולנטית צמודה (HRP) שממיר מצע ברור (tetrameth...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מבחני ה-DNA מחייב משמשים למדידת היכולת של גורמי שעתוק כדי לקיים אינטראקציה עם ה-DNA. מבחני עבור ה-DNA מחייבים כוללים משמרת electrophoretic ניידות (EMSA) ¹ וimmuneprecipitation הכרומטין (שבב) מבוסס מבחני ^3, כמו גם מבחני העסקת פורמטי 96 היטב ⁴ כגון מבחני chemiluminescent ^2. EMSA הוא שא...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly dI/dC	GE Healthcare, Piscataway, NJ	US20539-5UN	1 U ~50mg
RUNX2 antibody	MBL International Corp., Woburn, MA	D130-3	1 mg/ml
Fab-specific peroxidase conjugated antibody	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A9917	7.1 mg/ml
TMB Substrate (tetramethyl benzidine)	EXALPHA Biologicals, Shirley, MA	X1189S	100 ml
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	57995	Plate-fixing
Sulfuric Acid	VWR, West Chester, PA	BDH-39922-1	Stop solution
Multi-well plates	Greiner Bio-One, Basel, Switzerland	655996	Avidin-coated, black sides
HALT	Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL	78440	Protease and phosphatase inhibitors
Chemicals	Various manufacturers	Laboratory grade
Table 1. Reagents
Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader	Amersham Biosciences		For use with stop reaction method
Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader	Bio-Tek Instruments, Inc.		For use with continuous kinetic monitoring
Table 2. Equipment