Un dosage quantitatif pour l'étude de protéines: ADN Interactions, Découverte de transcription régulateurs de l'expression des gènes, et identifier les agents anti-tumoraux

Résumé

Nous avons développé, un dosage quantitatif liaison à l'ADN à base d'ELISA pour mesurer les interactions de facteurs de transcription à l'ADN. Une spécificité élevée pour la protéine de RUNX2 a été obtenue avec un consensus de l'ADN-oligonucléotide reconnaissance et l'anticorps monoclonal spécifique. Détection colorimétrique avec un substrat de réaction de l'anticorps couplé à une enzyme a été suivie en temps réel.

Résumé

De nombreux essais de liaison à l'ADN tels que les tests électrophorétique de décalage de mobilité (EMSA), des dosages chimioluminescents, immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) à base de tests et des analyses multi-puits-base sont utilisés pour mesurer l'activité du facteur de transcription. Cependant, ces tests sont non quantitative, manquent de spécificité, peuvent impliquer l'utilisation d'oligonucléotides radiomarqués, et peuvent ne pas être adaptable pour le dépistage des inhibiteurs de liaison à l'ADN. D'autre part, en utilisant un dosage quantitatif de liaison d'ADN immuno-enzymatique (D-ELISA), nous démontrons les interactions entre protéines nucléaires avec l'ADN en utilisant le facteur de transcription de RUNX2 qui dépendent de la liaison spécifique à des séquences de liaison à l'ADN consensus présents sur biotine- oligonucléotides marqués. Préparation de cellules, extraction de protéine nucléaire, et la conception des oligonucléotides bicaténaires sont décrits. Plaques de 96 puits revêtues d'avidine sont fixées avec du tampon alcalin et incubées avec des protéines nucléaires dans un tampon de blocage nucléotidique. Follen raison lavage extensif des plaques, un anticorps primaire spécifique et les incubations d'anticorps secondaires sont suivies par l'addition du substrat de la peroxydase de raifort et le développement de la réaction colorimétrique. mode de réaction d'arrêt ou suivi cinétique continue ont été utilisés pour mesurer quantitativement l'interaction de la protéine avec l'ADN. Nous discutons des contrôles de spécificité appropriées, y compris le traitement par IgG non spécifique ou sans protéines ou anticorps primaire. Les applications de l'essai sont décrits notamment son utilité dans le criblage de médicaments et les résultats positifs et négatifs représentatifs sont discutés.

Introduction

des dosages de liaison à l'ADN sont utiles dans la mesure de la capacité des facteurs de transcription pour interagir avec l'ADN. Les dosages pour l'ADN de liaison comprennent des dosages de décalage de mobilité électrophorétique (EMSA) qui dépendent des oligonucleotides radiomarqués ¹ ou ² essais de chimioluminescence. Essais chromatine immuneprecipitation (ChIP) sur la base ^3, ainsi que des tests employant des formats de 96 et ⁴ ont également été décrites. Cependant, l'EMSA est un essai non-quantitative qui nécessite l'utilisation d'oligonucléotides radiomarqués. Lorsque les protéines nucléaires associent à des séquences spécifiques de promoteur de nucléotides, complexes de liaison sont retardés sur des gels de polyacrylamide et le facteur de transcription spécifique puissent être validées par un anticorps "supershift". Nous avons développé un dosage de liaison à l'ADN quantitative en utilisant un format d'immuno-enzymatique (ELISA-D), qui est capable de mesurer l'interaction des RUNX2 avec des séquences de liaison à l'ADN correspondant à des éléments promoteurs définis igènes cibles de n RUNX2. Utilisation d'un anticorps anti-RUNX2 fournit la spécificité de l'essai et de l'absence de ce dosage radio-marqueur de distinction à partir de l'essai de décalage de gel traditionnel ^5. La détection de complexes de liaison est possible avec l'utilisation d'un anticorps secondaire couplé à la peroxydase de raifort (HRP), qui convertit un substrat HRP, tétraméthyl benzidine (TMB) en un produit coloré pour l'analyse spectrophotométrique. L'analyse présentée ici peut intégrer l'utilisation d'oligonucléotides d'ADN mutées comme témoins et peut être utilisé pour la détection des inhibiteurs compétitifs ou non compétitifs de liaison à l'ADN. Le criblage de composés anti-tumoraux est également possible avec ce dosage.

Protocole

Plusieurs étapes sont effectuées à l'avance, et plusieurs réactifs sont préparés et stockés avant la procédure: (1) la culture de cellules et de la protéine isolée, (2) la préparation d'un oligonucléotide, (3) la préparation des plaques à 96 puits, (4) un extrait nucléaire incubation pendant une nuit. Procédure nécessite deux jours en raison de la nuit d'incubation de la protéine nucléaire avec des oligonucléotides d'ADN.

Une. Préparation de tampons

1.1 l'isolement de la protéine nucléaire

1. Hypotonique tampon: Pour préparer 100 ml de tampon hypotonique, ajouter 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 150 pi (1 M MgCl _2), 333 pi (3 M KCl) à 98,3 ml H ₂ O. Les concentrations finales: 10 mM HEPES, 1,5 mM MgCl _2, 10 mM de KCl. Pour tampon hypotonique + NP40 (pour utilisation à l'étape 2.11): Ajouter 0,5 ml (10% NP40) à 9,5 ml de tampon hypotonique pour finale de 0,5% NP40.
2. Tampon bas du sel: Pour préparer 100 ml de tampon de faible teneur en sel (pour utilisation à l'étape 2.15), ajouter 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 25 ml glycérol, 150 pi (1 M MgCl _2), 666 pi (3 M KCl), 40 pi (0,5 M EDTA) à 73 ml H ₂ O. Concentration finale: 10 mM HEPES, 25% de glycerol, 1,5 mM MgCl _2, KCl 20 mM, EDTA 0,2 mM.
3. Buffer High Salt: Pour préparer 100 ml de tampon de sel élevé (pour une utilisation à l'étape 2.15), ajouter 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 25 ml de glycérol, 150 pi (1 M MgCl _2), 26,7 ml (3 M KCl), 40 pi (0,5 M EDTA) à 47 ml _de H ₂ O. Concentration finale: 10 mM HEPES, 25% de glycerol, 1,5 mM MgCl _2, KCl 800 mM, EDTA 0,2 mM.
4. 10% de NP40 détergent: 10 ml de NP40 à 90 ml H ₂ O
5. Les inhibiteurs de protéase et la phosphatase [ajoutée à un tampon hypotonique + NP40 (étape 2.11), à faible tampon de sel (étape 2.15), et de tampon élevée en sel (étape 2.15) juste avant d'utiliser]: Ajouter 2,5 pi (1 M DTT) et 50 ul d'inhibiteurs de protéases (100x) à 5 ml de tampon pour chaque concentration finale de 0,5 mM de DTT et des inhibiteurs de protéase 1x. Le 100x actions mélange inhibiteur de la protéase comprend:le fluorure de sodium (Ser / Thr, phosphatases acides), orthovanadate de sodium (Tyr, phosphatases alcalines), β-glycérophosphate (phosphatases Ser / Thr), le pyrophosphate de sodium (les phosphatases Ser / Thr), aprotinine (Ser proteases), la bestatine (amino-peptidases ), E64 (les protéases à cystéine), leupeptine (protéases Ser / Cys), EDTA (métalloprotéases).

1.2 Préparation des plaques d'essai

1. Solution plaque de fixation: Pour préparer 500 ml de solution, ajouter du carbonate de sodium à 5,25 g pour 500 ml H ₂ O, bien mélanger et ajuster le pH à 9,7 pour une concentration finale de carbonate de sodium à 0,1 M.
2. Plaque solution de blocage: Pour préparer magasin poly dI / dC oligonucléotide, remettre en suspension 1 unité (~ 50 mg) de poly dI / dC dans 1 ml de Tris 10 mM / HCl, pH 7,9 contenant 1 mM d'EDTA pour une concentration de l'action de 50 ug / pl. Le stock est diluée à 1 pg / pl avant utilisation.

1.3 tampons de lavage et des dilutions d'anticorps

REMARQUE: tampon de lavage streptavidine est utilisée pour le lavage des plaques entre les deux additions et de diluer les anticorps primaires et secondaires.

1. Pour préparer 1 L de tampon de lavage de la streptavidine, ajouter 2,4 g de Tris / HCl, 37,5 ml (4 M de NaCl), 10 ml (10% de BSA), 5 ml (10% de Tween-20), à une eau filtrée L Millipore stérile , pH 7,18. Stocker à 4 ° C. Concentration finale: 20 mM Tris / HCl, 150 mM de NaCl, 0,1% de BSA, 0,05% de Tween-20.

1,4 tampon de liaison à l'ADN

NOTE: Ce tampon est conservé à -20 ° C.

1. Pour préparer 15 ml de tampon de liaison de l'ADN, ajouter 180 pi (1 M HEPES, pH 7,9), 300 pi (3 M KCl), 12 pi (0,5 M EDTA, pH 8,0), 7,5 pi (1 M TNT), 3,0 ml (60% de glycerol), 300 ul (50 ug / ul de poly dI / dC) dilué avec désionisée / distillée H ₂ O (12 ml). Les concentrations finales: 12 mM HEPES / pH 7,9, 60 mM de KCl, 0,4 mM EDTA, 0,5 mM de DTT, 12% glycérol, 1 ug / ul poly dI / DC.

2. Culture cellulaire et l'isolement de la protéine nucléaire

t "> NOTE: La préparation nécessite environ 3 heures de stimulation des cellules dépendra de l'expérience, le nombre de cellules utilisées pour chaque expérience sera variable et tous les volumes reflètent une expérience typique utilisant 3 x 10 ⁷ cellules / Point ajuster les volumes d'accommodement... le nombre de cellules effectivement utilisée dans l'expérience ^6.

1. Pour préparer la protéine nucléaire à des essais de liaison ADN, des cultures de cellules humaines qui expriment RUNX2 (endothélial, l'ostéosarcome, des cellules de cancer du sein) dans des milieux appropriés ^6.
2. Traiter les cellules sous-confluentes avec du nocodazole (0,2 pg / ml pendant 16 heures) pour arrêter les cellules en G2 / M du cycle cellulaire limite ^6. Dans ces conditions, la protéine de RUNX2 ADN est stabilisé et la liaison maximale est atteinte. De cette manière, assez de protéine nucléaire est disponible pour de multiples dosages et les inhibiteurs peuvent être comparées à la même préparation.
3. Pour chaque étape, de pré-refroidir la centrifugeuse à 4 ° C et préparer des tampons et refroidir 20 min à 4 ° C avant la récolte des cellules.
4. cellules Chill (4 ° C) et les procédures de conduite sur glace.
5. Centrifuger les cellules à 1000 rpm pendant 5 min dans un tube à fond rond de 15 ml en polypropylène.
6. Laver 1x avec du PBS glacé (Ca ^{2 +} et Mg ^{2 +} libre).
7. Centrifuger à nouveau et jeter PBS surnageant.
8. Ajouter 500 ul de tampon hypotonique sans inhibiteurs de protéase, en prenant soin de remettre en suspension complètement le culot cellulaire.
9. Transférer le contenu dans un tube Eppendorf de 1,5 ml.
10. Centrifuger immédiatement à 5500 tours par minute pendant 5,5 min; jeter le surnageant et garder le culot cellulaire.
11. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 500 pi de tampon hypotonique contenant 0,5% de NP40. Ajouter protéase et d'inhibiteurs de phosphatase et 0,5 mM de DTT (comme décrit dans l'étape 1.1.5).
12. Laisser l'échantillon reposer sur de la glace pendant 30 min.
13. Centrifuger à 13000 rpm pendant 10 min.
14. Jeter le surnageant (contient les protéines cytosoliques).
15. Reprendre le culot nucléaire dans 60 pi de chacun bas salt tampon (à laquelle les inhibiteurs de protéase et 0,5 mM de DTT ont été ajoutés à l'étape 1.1.5) et le tampon de sel élevé (dont les inhibiteurs de protéase et 0,5 mM de DTT ont été ajoutés à l'étape 1.1.5) pour un total de 120 pi. Ajouter 60 ul de tampon de faible teneur en sel de la pastille première et remettre en suspension, puis ajouter 60 ul de tampon élevée en sel. Vortex le culot pour aider à la remise en suspension.

REMARQUE: Cette étape permet de se débarrasser de certaines des protéines de la membrane nucléaire et mis en place pour l'étape de lyse: faible teneur en sel en premier (remettre le culot, vortex), puis élevée en sel (vortex) optimise cette étape. Gardez extrait sur la glace pendant 30 minutes, avec des vortex après les 10 premières minutes.

16. Centrifugeuse à 12000 rpm pendant 15 min; garder le surnageant contenant la protéine nucléaire.
17. Mesurer la concentration de protéine (essayer de conserver les échantillons à 2-5 mg / ml), aliquote en quantités appropriées (10 pl / tube) et conserver à -80 ° C.

NOTE: Le rendement estimé: 30 x 10 ⁶ cells donneront 5 ug / ul protéine dans 120 pl. 5 x 10 ⁶ cellules vont donner 2,2 ug / ul protéine dans 40 pi.

3. Préparation des oligonucléotides double brin

1. Concevoir des oligonucléotides complémentaires avec demi-sites compatibles sur les extrémités. Pour RUNX2 ce sont: 5'-CGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATAC TCG-3'-biotine (sens) et 5'CGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT T GTGGTT AATACG-3'-biotine (antisens).

REMARQUE: Des expériences pilotes déterminés que trois sites de liaison de RUNX2 et unique fin biotine ont donné les résultats les plus reproductibles.

2. Préparer le tampon d'hybridation 5x: ajouter 300 ul (1 M de Tris-HCl, pH 7,6), 30 ul (1 M MgCl _2), 10 ul (1 M DTT) à 260 ul de H ₂ O (finale 600 ul).
3. À 200 pmol de chaque olig simple brinonucleotide (3 pi), ajouter 12 ul de tampon d'hybridation 5x et 45 ul de H ₂ O pour un total de 60 ul (ul) 200 pmol/60.
4. On chauffe à 95 ° C pendant 5-10 min dans un bloc de chauffage.
5. Refroidir à 65 ° C lentement (en réglant la température à 65 ° C, il faut 15 min), puis refroidir à température ambiante lentement par la mise hors tension du bloc de chauffage (ou en le plaçant dans 50 ml de l'eau à 65 ° C dans un bécher sur la glace, ce qui prend 15-20 min).

4. Préparation des plaques à 96 puits

NOTE: Ne pas utiliser de protéines de lait dans les tampons de lavage.

1. Fixer la platine avec une solution de fixation (carbonate de sodium 0,1 M): ajouter 300 pl / puits.
2. Incuber pendant 2 heures par basculement à température ambiante (RT), ou pas de basculer à 4 ° C (O / N).
3. Laver la plaque 3x avec du tampon de lavage de streptavidine (BM): ajouter 300 pl / puits à chaque fois.
4. Ajouter oligonucléotide double brin marqué à la biotine (sites de liaison 3 de consensus par nucléotide) pendant 2 h wrâce à bascule (1,25 nmol / bien; 100 pl / puits).
5. Laver pendant 3x avec la BM froid: ajouter 300 pl / puits, puis inverser immédiatement la plaque dans un évier et efface les bords sur une serviette en papier après chaque addition.

NOTE: Ne pas utiliser des embouts de pipette pour éliminer le liquide des plaques car cela peut gratter avidine: biotine: complexes d'ADN provenant des puits. Pour ce faire, pour toutes les étapes de lavage ultérieures.

5. L'incubation avec l'extrait nucléaire

NOTE: Ne pas remplacer le saumon ou l'ADN de sperme de hareng pour la poly tampon de blocage dI / dC. Éviter le blocage des plaques avec des protéines de lait. Ces deux agents bloquants entraînent des valeurs de fond élevé.

1. Incuber avec le facteur de transcription spécifique préparé à partir d'extrait nucléaire (90 pl / puits). Préparer un mélange maître contenant de l'extrait nucléaire (protéine de liaison à l'ADN; 3-9 pg / puits) + poly dI / dC (1 pg / pl d'une ug / stock ul 50) 1x ADN tampon de liaison. Le volume est nécessaire pour que le nombre total d'puits nécessaires (90 pl / puits).
2. Tout inhibiteur potentiel, tel que la vitamine D3 (figure 2) ou d'un composé CADD 5221975 (figure 3), ou de la dilution appropriée de la commande solvant, tel que l'éthanol, est ajouté à cette étape.
3. Placez la plaque sur la plate-forme à bascule, O / N à 4 ° C.
4. Laver pendant 3x avec la BM: ajouter 300 pl / puits

6. L'addition d'anticorps primaire

REMARQUE: des dilutions d'anticorps primaires devraient être préparées - stockage n'est pas recommandé.

1. Diluer l'anticorps monoclonal spécifique RUNX2 (stock 1 pg / pl) 1/5, 000 en streptavidine tampon de lavage. Préparer suffisamment pour être ajoutés à chaque puits de la plaque à 96 puits (90 pl / puits) en trois exemplaires.
2. Incuber pendant 1 heure à température ambiante sur une plate-forme à bascule.
3. Laver pendant 3x avec la BM, ajouter 300 ul / puits.

7. L'addition d'un anticorps secondaire

REMARQUE: des dilutions d'anticorps secondaires peuvent être storouge à 4 ° C pendant la nuit si nécessaire le lendemain.

1. Diluer F _{ab-spécifique} purifié par affinité-HRP anticorps conjugué (7,1 mg / stock ml) à 1:1,400 dans streptavidine tampon de lavage: tampon 3,5 pi antibody/5.0 ml de lavage. Préparer suffisamment pour être ajoutés à chaque puits de la plaque à 96 puits (90 pl / puits) en trois exemplaires.
2. Incuber pendant 30 min à température ambiante sur une plate-forme à bascule.
3. Laver 6x avec la BM en retournant la plaque dans l'évier (300 pl / puits).

8. HRP Substrate et développement de produits

1. Ajouter 50 ul de substrat TMB par puits directement sur stock bouteille.
2. Incuber 10-20 min à température ambiante dans l'obscurité (arrêt procédé de réaction) ou mesurer l'absorbance directement (suivi cinétique continu).

9. Réaction de mesure

1. Arrêtez méthode de réaction: Pour la réaction d'arrêt visuel, vérifier le changement de couleur du clair au bleu et arrêter la réaction avec de l'acide sulfurique 50 pi.
2. Mesurer l'absorbance à 450 nm avecle lecteur de plaque visible spectrophotomètre Biotrak II (Amersham Biosciences, GE Healthcare Biosciences Corp Piscataway NJ, USA) ou un instrument similaire.
3. Continue méthode de suivi cinétique: Ajouter substrat après le dernier lavage et juste avant de passer dans le spectrophotomètre (ne vous arrêtez pas la réaction).
4. Mesurer l'absorbance à 635 nm avec le Bio-Tek Synergy HT Multi-réaction lecteur de microplaques Spectrophotomètre (Bio-Tek Instruments, Inc; Winooski, VT, États-Unis) ou un instrument similaire.

Résultats

Procédé D-ELISA est hautement spécifique de la protéine de liaison d'ADN désignée dans la mesure où, d'un oligonucléotide double brin spécifique de séquence qui contient trois copies du site de liaison consensus de RUNX2 (ACACCA) est utilisé. L'anticorps primaire reconnaissant le facteur protéique améliore également la spécificité. L'anticorps secondaire lié de manière covalente contient la peroxydase de raifort (HRP) qui convertit un substrat transparent (tétraméthyl benzidine) en un...

Discussion

des dosages de liaison à l'ADN sont utilisées pour mesurer la capacité des facteurs de transcription pour interagir avec l'ADN. Les dosages de liaison de l'ADN comprennent la mobilité électrophorétique (EMSA) et ^une chromatine immuneprecipitation (ChIP) essais basés ³ ainsi que des dosages utilisant des formats à 96 puits ⁴ tels que des dosages chimiluminescents ^2. L'EMSA est non quantitative et utilise radiomarqué ⁽³² P) oligonucléotides. ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly dI/dC	GE Healthcare, Piscataway, NJ	US20539-5UN	1 U ~50mg
RUNX2 antibody	MBL International Corp., Woburn, MA	D130-3	1 mg/ml
Fab-specific peroxidase conjugated antibody	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A9917	7.1 mg/ml
TMB Substrate (tetramethyl benzidine)	EXALPHA Biologicals, Shirley, MA	X1189S	100 ml
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	57995	Plate-fixing
Sulfuric Acid	VWR, West Chester, PA	BDH-39922-1	Stop solution
Multi-well plates	Greiner Bio-One, Basel, Switzerland	655996	Avidin-coated, black sides
HALT	Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL	78440	Protease and phosphatase inhibitors
Chemicals	Various manufacturers	Laboratory grade
Table 1. Reagents
Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader	Amersham Biosciences		For use with stop reaction method
Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader	Bio-Tek Instruments, Inc.		For use with continuous kinetic monitoring
Table 2. Equipment