Un quantitativo test per studiare proteine: DNA interazioni, Discover trascrizionali regolatori dell'espressione genica, e identificare nuovi agenti anti-tumorali

Riepilogo

Abbiamo sviluppato un DNA-binding, dosaggio quantitativo basato su ELISA per misurare le interazioni tra fattori di trascrizione con il DNA. Alta specificità per la proteina RUNX2 è stato raggiunto con un consenso DNA riconoscimento oligonucleotide e anticorpo monoclonale specifico. Rilevamento colorimetrico con una reazione substrato anticorpo enzimatico accoppiato stata monitorata in tempo reale.

Abstract

Molti legano il DNA test come test di spostamento mobilità elettroforetica (EMSA), saggi chemiluminescenti, immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) a base di saggi e saggi pozzetti-based sono utilizzati per misurare attività del fattore di trascrizione. Tuttavia, questi saggi sono nonquantitative, mancano di specificità, possono comportare l'uso di oligonucleotidi radiomarcati, e non possono essere adattabile per lo screening di inibitori di legame al DNA. D'altra parte, utilizzando un saggio quantitativo di legame al DNA immunoenzimatico (ELISA-D) Test, dimostriamo interazioni proteina nucleare con DNA utilizzando il fattore di trascrizione RUNX2 che dipendono specifica associazione con consenso DNA-binding sequenze presenti sulla biotina- oligonucleotidi etichettati. Preparazione delle cellule, estrazione di proteine ​​nucleari, e la progettazione di oligonucleotidi a doppio filamento sono descritti. Piastre a 96 pozzetti rivestite di avidina sono fissati con tampone alcalino e incubate con proteine ​​nucleari a nucleotide tampone di bloccaggio. Follgrazie lavaggio estensivo delle piastre, l'anticorpo primario specifico e incubazioni anticorpi secondari sono seguiti dall'aggiunta di substrato perossidasi di rafano e lo sviluppo della reazione colorimetrica. Modalità di reazione di arresto o il monitoraggio continuo cinetica sono stati utilizzati per misurare quantitativamente l'interazione delle proteine ​​con il DNA. Discutiamo adeguati controlli specificità, compreso il trattamento con i non-IgG specifiche o senza proteine ​​o anticorpo primario. Applicazioni del saggio sono descritte compresa la sua utilità in screening di farmaci e risultati positivi e negativi rappresentativi sono discussi.

Introduzione

DNA-binding saggi hanno utilità nel misurare la capacità dei fattori di trascrizione per interagire con il DNA. I saggi di legame al DNA includono elettroforetici saggi mobility shift (EMSA) che dipendono da oligonucleotidi radioattivi ¹ o saggi chemiluminescenza ^2. Saggi cromatina immuneprecipitation (chip) basate ³ e saggi che impiegano formati da 96 pozzetti ⁴ sono state descritte. Tuttavia, l'EMSA è un'analisi non quantitativa che richiede l'uso di oligonucleotidi radiomarcati. Quando le proteine ​​nucleari associano con le specifiche sequenze promotrici nucleotide, complessi vincolanti sono ritardati su gel di poliacrilammide e il fattore di trascrizione specifico possono essere convalidati con un anticorpo "supershift". Abbiamo sviluppato un saggio di legame al DNA quantitativa utilizzando un formato di immunoassorbimento enzimatico (ELISA-D), che è in grado di misurare l'interazione di RUNX2 con DNA-binding sequenze corrispondenti ad elementi promotori definiti igeni bersaglio n Runx2. Uso di un anticorpo anti-RUNX2 fornisce specificità per il dosaggio e la mancanza di radiotracciante distinguere questo saggio dal tradizionale saggio di spostamento gel ^5. Rilevamento di complessi di legame è possibile con l'uso di un anticorpo secondario accoppiato a perossidasi di rafano (HRP), che converte un substrato HRP, tetrametil benzidina (TMB) in un prodotto colorato per l'analisi spettrofotometrica. Il saggio qui riportato può incorporare l'uso di oligonucleotidi di DNA mutati i controlli e può essere utilizzato per il rilevamento di inibitori competitivi e non competitivi di DNA vincolanti. Lo screening di nuovi composti antitumorali è possibile anche con questo test.

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Protocollo

Diverse fasi vengono eseguite in anticipo e diversi reagenti vengono preparate e conservate prima della procedura: (1) cultura e proteine ​​cella di isolamento, (2) preparazione di oligonucleotide, (3) Preparazione di piastre a 96 pozzetti, (4) estratto nucleare notte di incubazione. Procedura prevede due giorni a causa della notte di incubazione della proteina nucleare con oligonucleotidi di DNA.

1. Preparazione del buffer

1.1 isolamento delle proteine ​​nucleari

1. Ipotonica Buffer: Per preparare 100 ml di tampone ipotonico, aggiungere 1 ml (1 M HEPES, pH 7.9), 150 ml (1 M MgCl _2), 333 ml (3 M KCl) a 98,3 ml H ₂ O. Concentrazioni finali: HEPES 10 mM, 1,5 mM MgCl _2, KCl 10 mM. Per tampone ipotonico + NP40 (per l'utilizzo in fase 2.11): Aggiungere 0,5 ml (10% NP40) per 9,5 ml di tampone ipotonico per la finale dello 0,5% NP40.
2. Salt Buffer Bassa: Per preparare 100 ml di tampone sale basso (per l'utilizzo in fase 2.15), aggiungere 1 ml (1 M HEPES, pH 7.9), 25 ml glicerolo, 150 ml (1 M MgCl _2), 666 ml (3 M KCl), 40 ml (0,5 M EDTA) a 73 ml di H ₂ O. Le concentrazioni finali: HEPES 10 mM, 25% glicerolo, 1,5 mM MgCl _2, 20 mM KCl, 0,2 mM EDTA.
3. Buffer di sale: Per preparare 100 ml di tampone sale alto (per l'utilizzo in fase 2.15), aggiungere 1 ml (1 M HEPES, pH 7.9), 25 ml di glicerina, 150 ml (1 M MgCl _2), 26,7 ml (3 M KCl), 40 microlitri (0.5M EDTA) a 47 ml di H ₂ O. Concentrazioni finali: HEPES 10 mM, 25% glicerolo, 1,5 mM MgCl _2, 800 mM KCl, 0,2 mM EDTA.
4. 10% NP40 detergente: 10 ml NP40 a 90 ml H ₂ O
5. Gli inibitori della proteasi e fosfatasi [aggiunto al buffer ipotonico + NP40 (passo 2.11), al buffer basso contenuto di sale (punto 2.15), e al buffer di sale (punto 2.15) appena prima dell'uso]: Aggiungere 2,5 microlitri (1 M DTT) e 50 microlitri di inibitori delle proteasi (100x) a 5 ml di tampone per ciascuna concentrazione finale di 0,5 mM DTT e inibitori della proteasi 1x. Il 100x magazzino miscela di inibitori della proteasi comprende:fluoruro di sodio (Ser / Thr, fosfatasi acida), orthovanadate sodio (Tyr, fosfatasi alcalina), β-glicerofosfato (fosfatasi Ser / Thr), pirofosfato di sodio (fosfatasi Ser / Thr), aprotinina (Servizi proteasi), Bestatin (amino-peptidasi ), E64 (proteasi cisteina), leupeptina (proteasi Ser / Cys), EDTA (metalloproteasi).

1.2 Preparazione delle piastre di saggio

1. Piatto soluzione di fissaggio: Per preparare 500 ml di soluzione, aggiungere 5,25 g di carbonato di sodio per 500 ml H ₂ O, mescolare bene e aggiustare il pH a 9,7 per una concentrazione finale di 0,1 M di carbonato di sodio.
2. Piatto soluzione di blocco: Per preparare magazzino poli dI / dC oligonucleotide, risospendere 1 Unit (~ 50 mg) di poli dI / DC in 1 ml di 10 mM Tris / HCl, pH 7,9 contenente 1 mM EDTA per una concentrazione di scorta di 50 mg / microlitri. Stock è diluita a 1 mg / mL prima dell'uso.

1.3 tamponi di lavaggio e diluizioni di anticorpi

NOTA: tampone di lavaggio Streptavidin è utilizzato per lavare piatti tra aggiunte e per diluire anticorpi primari e secondari.

1. Per preparare 1 L di tampone di lavaggio Streptavidin, aggiungere 2,4 g Tris / HCl, 37,5 ml (4 M NaCl), 10 ml (10% BSA), 5 ml (10% Tween-20), a 1 L di acqua filtrata Millipore sterile , pH 7.18. Conservare a 4 ° C. Le concentrazioni finali: 20 mM Tris / HCl, 150 mM NaCl, 0,1% BSA, 0,05% Tween-20.

1.4 tampone di legame al DNA

NOTA: Questo tampone è conservato a -20 ° C.

1. Per preparare 15 ml di DNA binding buffer, aggiungere 180 microlitri (1 M HEPES, pH 7.9), 300 ml (3 M KCl), 12 ml (0.5 M EDTA, pH 8.0), 7.5 ml (1 M DTT), 3,0 ml (60% glicerolo), 300 ml (50 mg / ml poly dI / dC) diluito con acqua deionizzata / distillata H ₂ O (12 ml). Concentrazioni finali: 12 mM HEPES / pH 7.9, 60 mM KCl, 0,4 mM EDTA, DTT 0,5 mm, 12% glicerolo, 1 mg / ml poly dI / DC.

2. Coltura cellulare e isolamento proteina nucleare

t "> NOTA: La preparazione richiede circa 3 ore La stimolazione di cellule dipenderà esperimento Il numero di cellule utilizzate per ciascun esperimento varierà e tutti i volumi riflette un tipico esperimento utilizzando 3 x 10 ⁷ cellule / punto Regolare volumi per accogliere... il numero di cellule effettivamente utilizzato nell'esperimento ^6.

1. Per preparare proteina nucleare di DNA saggi di legame, le cellule umane cultura che esprimono RUNX2 (endoteliali, osteosarcoma, le cellule del cancro al seno) nelle matrici appropriate ^6.
2. Trattare le cellule subconfluenti con nocodazole (0,2 mg / ml per 16 ore) per arrestare le cellule al confine ciclo cellulare G2 / M ^6. In queste condizioni, la proteina RUNX2 viene stabilizzato e vincolante DNA massimali si ottengono. In questo modo, proteina nucleare sufficiente è disponibile per analisi multiple e inibitori possono essere confrontati dalla stessa preparazione.
3. Per ogni passo, pre-raffreddare la centrifuga a 4 ° C e preparare buffer e chill 20 min a 4 ° C prima della raccolta delle cellule.
4. Cellule freddo (4 ° C) e le procedure condotta su ghiaccio.
5. Centrifugare le cellule a 1000 rpm per 5 minuti in 15 ml di polipropilene tubo tondo a fondo.
6. Lavare 1x con PBS freddo (Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +} libero).
7. Centrifuga di nuovo e scartare PBS surnatante.
8. Aggiungere 500 ml di tampone ipotonico senza inibitori della proteasi, facendo attenzione a risospendere completamente il pellet cellulare.
9. Trasferire contenuto in una provetta da 1,5 ml Eppendorf.
10. Subito centrifugare a 5.500 rpm per 5,5 min; scartare il surnatante e mantenere il pellet di cellule.
11. Risospendere il pellet di cellule in 500 microlitri di tampone ipotonico contenente 0,5% NP40. Aggiungi proteasi e gli inibitori della fosfatasi e DTT 0.5 mM (come descritto al punto 1.1.5).
12. Lasciare il campione a riposo in ghiaccio per 30 min.
13. Centrifugare a 13.000 rpm per 10 min.
14. Scartare il surnatante (contiene le proteine ​​citosoliche).
15. Risospendere il pellet nucleare in 60 ml ciascuna di bassa saltampone t (per cui gli inibitori della proteasi e DTT 0,5 mM sono stati aggiunti dal punto 1.1.5) e tampone salina (a cui gli inibitori della proteasi e DTT 0,5 mM sono stati aggiunti dal punto 1.1.5) per un totale di 120 microlitri. Aggiungere 60 ml di tampone sale basso per il pellet e risospendere prima, quindi aggiungere 60 ml di tampone di sale. Agitare il pellet per facilitare la risospensione.

NOTA: Questo passaggio aiuta a sbarazzarsi di alcune delle proteine ​​di membrana nucleare e predisposto per la fase di lisi: basso contenuto di sale per primo (risospendere pellet, vortex), poi di sale (vortex) ottimizza questo passo. Mantenere estratto in ghiaccio per 30 min, con vortex dopo i primi 10 min.

16. Centrifugare a 12.000 rpm per 15 min; conservare il surnatante contenente la proteina nucleare.
17. Misurare la concentrazione di proteine ​​(cercare di mantenere i campioni a 2-5 mg / ml), aliquota in quantità adeguate (10 ml / tubo) e conservare a -80 ° C.

NOTA: rendimento stimato: 30 x 10 ⁶ cells produrranno 5 mg / ml di proteine ​​in 120 microlitri. 5 x 10 ⁶ cellule produrranno 2,2 mg / ml di proteine ​​in 40 microlitri.

3. Preparazione di Double Stranded oligonucleotide

1. Progettare oligonucleotidi complementari con siti metà compatibili alle estremità. Per RUNX2 questi sono: 5'-CGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATAC TCG-3'-biotina (senso) e 5'CGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT T GTGGTT AATACG-3'-biotina (antisenso).

NOTA: esperimenti pilota determinato che tre siti di legame Runx2 e single-end biotina marcata hanno prodotto i risultati più riproducibili.

2. Preparare buffer di ricottura 5x: Aggiungere 300 ml (1 M Tris-HCl, pH 7.6), 30 ml (1 M MgCl _2), 10 ml (1 M DTT) a 260 ml H ₂ O (finale di 600 microlitri).
3. Per 200 pmol di ogni olig singolo filamentoonucleotide (3 ml), aggiungere 12 ml di tampone 5x ricottura e 45 ml H ₂ O per un totale di 60 microlitri (200 pmol/60 microlitri).
4. Riscaldare a 95 ° C per 5-10 minuti su una piastra riscaldante.
5. Raffreddare a 65 ° C lentamente (impostando la temperatura a 65 ° C, ci vogliono 15 min), poi raffreddare lentamente a temperatura ambiente spegnendo l'alimentazione del blocco riscaldante (o mettendo in 50 ml di acqua 65 ° C in un becher su ghiaccio; questo richiede 15-20 min).

4. Preparazione di piastre con 96 pozzetti

NOTA: non utilizzare proteine ​​del latte nei buffer di lavaggio.

1. Fissare la piastra con la soluzione di fissaggio (0.1 M carbonato di sodio): aggiungere 300 microlitri / pozzetto.
2. Incubare per 2 ore agitando a temperatura ambiente (RT), o nessuna dondolo a 4 ° C (O / N).
3. Lavare 3x piastra con tampone di lavaggio streptavidina (WB): aggiungere 300 microlitri / bene ogni volta.
4. Aggiungi a doppio filamento oligonucleotide marcato con biotina (3 consensus siti di legame per nucleotide) per 2 ore wesimo dondolo (1,25 nmol / e; 100 microlitri / pozzetto).
5. Lavare 3x con freddo WB: aggiungere 300 microlitri / bene e poi invertire immediatamente la piastra in un lavandino e macchia i bordi su un tovagliolo di carta dopo ogni aggiunta.

NOTA: non utilizzare puntali delle pipette per rimuovere il liquido dalle piastre in quanto ciò potrebbe raschiare avidina: biotina: complessi di DNA dai pozzetti. Fate questo per tutte le fasi di lavaggio successive.

5. Incubazione con estratto nucleare

NOTA: Non sostituire salmone o aringa DNA di sperma per la poli tampone di bloccaggio dI / dC. Evitare di bloccare piatti con proteine ​​del latte. Entrambi questi agenti bloccanti come risultato valori di fondo alti.

1. Incubare con fattore di trascrizione specifico elaborato da estratto nucleare (90 microlitri / pozzetto). Preparare una master mix contenente estratto nucleare (DNA binding protein; 3-9 mg / pozzetto) + poly dI / DC (1 mg / mL da un mcg / magazzino ul 50) nel DNA 1x tampone di legame. Volume è come necessario per il numero totale dipozzetti necessari (90 microlitri / pozzetto).
2. Qualsiasi inibitore potenziale, come la vitamina D3 (figura 2) o CADD composto 5.221.975 (Figura 3), o la diluizione appropriata di controllo solvente, come etanolo, viene aggiunto in questa fase.
3. Luogo piastra su piattaforma oscillante, O / N a 4 ° C.
4. Lavare 3x con WB: aggiungere 300 microlitri / pozzetto

6. L'aggiunta di anticorpo primario

NOTA: diluizioni anticorpo primario deve essere preparato fresco - lo stoccaggio non è raccomandato.

1. Diluire specifico RUNX2 anticorpo monoclonale (magazzino 1 mg / mL) 1/5, 000 in Streptavidin tampone di lavaggio. Preparare sufficiente per aggiunta a ciascun pozzetto della piastra da 96 pozzetti (90 microlitri / pozzetto) in triplicato.
2. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante.
3. Lavare 3x con WB, aggiungere 300 ml / pozzetto.

7. L'aggiunta di anticorpo secondario

NOTA: diluizioni di anticorpi secondari possono essere STOrosso a 4 ° C durante la notte se necessario il giorno successivo.

1. Diluire F _ab-specifica affinità purificato HRP-anticorpo coniugato (7,1 mg / ml di magazzino) per 1:1,400 in Streptavidin lavare buffer: buffer di 3,5 microlitri antibody/5.0 ml lavaggio. Preparare sufficiente per aggiunta a ciascun pozzetto della piastra da 96 pozzetti (90 microlitri / pozzetto) in triplicato.
2. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante.
3. Lavare 6x con WB invertendo piastra nel lavandino (300 microlitri / pozzetto).

8. HRP substrato e Sviluppo Prodotti

1. Aggiungere 50 ml di substrato TMB per pozzetto direttamente dal magazzino bottiglia.
2. Incubare 10-20 min a RT al buio (fermata metodo di reazione) o misurare l'assorbanza direttamente (monitoraggio cinetica continuo).

9. Misura di reazione

1. Fermare metodo della reazione: Per la reazione di arresto visiva, verificare la presenza di cambiamento di colore dal chiaro al blu e smettere di reazione con 50 ml di acido solforico.
2. Misurare l'assorbanza a 450 nm conil Biotrak II lettore di piastre visibile Spettrofotometro (Amersham Biosciences, GE Healthcare Biosciences Corp. Piscataway NJ, USA) o uno strumento simile.
3. Continuo metodo di monitoraggio cinetico: Aggiungere substrato dopo l'ultimo lavaggio e appena prima messa in spettrofotometro (non fermare la reazione).
4. Misurare l'assorbanza a 635 nm con il Bio-Tek Synergy HT Multi-reazione lettore di micropiastre spettrofotometro (Bio-Tek Instruments, Inc; Winooski, VT, USA) o uno strumento simile.

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Risultati

Il metodo D-ELISA è altamente specifico per la proteina legante il DNA designato finché viene utilizzato un oligonucleotide a doppio filamento sequenza-specifica, contenente tre copie del sito di legame consenso RUNX2 (ACACCA). L'anticorpo primario che riconosce la proteina che migliora anche la specificità. L'anticorpo secondario contiene covalentemente legata perossidasi di rafano (HRP) che converte un substrato trasparente (tetrametil benzidina) per un prodotto colorato per facilità di rilevamento

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Discussione

DNA-binding saggi vengono utilizzati per misurare la capacità dei fattori di trascrizione per interagire con il DNA. I saggi di legame per DNA includono spostamento elettroforetico mobilità (EMSA) ¹ e immuneprecipitation cromatina (ChIP) saggi basati ³ nonché saggi occupata formati da 96 pozzetti ⁴ come saggi chemiluminescenti ^2. L'EMSA è non-quantitativa e utilizza radioattivo ⁽³² P) oligonucleotidi. Questi sono incubati con proteine ​​nucleari e comple...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly dI/dC	GE Healthcare, Piscataway, NJ	US20539-5UN	1 U ~50mg
RUNX2 antibody	MBL International Corp., Woburn, MA	D130-3	1 mg/ml
Fab-specific peroxidase conjugated antibody	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A9917	7.1 mg/ml
TMB Substrate (tetramethyl benzidine)	EXALPHA Biologicals, Shirley, MA	X1189S	100 ml
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	57995	Plate-fixing
Sulfuric Acid	VWR, West Chester, PA	BDH-39922-1	Stop solution
Multi-well plates	Greiner Bio-One, Basel, Switzerland	655996	Avidin-coated, black sides
HALT	Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL	78440	Protease and phosphatase inhibitors
Chemicals	Various manufacturers	Laboratory grade
Table 1. Reagents
Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader	Amersham Biosciences		For use with stop reaction method
Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader	Bio-Tek Instruments, Inc.		For use with continuous kinetic monitoring
Table 2. Equipment