Количественный Анализ по изучению белок: ДНК взаимодействий, Discover транскрипционных регуляторов экспрессии генов, и идентифицировать новые противоопухолевых средств

Резюме

Мы разработали количественный ДНК-связывающий, ИФА на основе анализа для измерения фактора транскрипции взаимодействия с ДНК. Высокая специфичность для белка Runx2 была достигнута с консенсусной олигонуклеотида ДНК-распознавания и специфического моноклонального антитела. Колориметрические обнаружения с реакции с субстратом антитела с ферментом в сочетании контролировали в реальном времени.

Аннотация

Многие ДНК-связывающие анализы, такие как электрофоретическая сдвига мобильность анализов (EMSA), хемилюминесцентных анализов, иммунопреципитации хроматина (чип) основе анализов и многолуночных основе анализов используются для измерения активность фактора транскрипции. Тем не менее, эти анализы неколичественные, отсутствие специфичности, может включать в себя использование меченных олигонуклеотидов, и не могут быть адаптированы для скрининга ингибиторов связывания ДНК. С другой стороны, с помощью количественного ДНК-связывающий иммуноферментного анализа (D-ELISA) анализа, мы демонстрируем ядерных белковых взаимодействий с ДНК, используя Runx2 транскрипционный фактор, что зависит от конкретной ассоциации с консенсус-ДНК-связывающих последовательностей, присутствующих на биотин- меченных олигонуклеотидов. Подготовка клеток, добыча ядерного белка, и дизайн двухцепочечных олигонуклеотидов описаны. Покрытые авидином 96-луночные планшеты с фиксированной щелочного буфера и инкубируют с ядерными белками в нуклеотидной блокирующем буфере. Фоллявследствие интенсивного промывания пластин, конкретной первичного антитела и вторичного антитела инкубации следуют добавлением субстрата пероксидазы хрена и развития колориметрической реакции. Режим реакция Стоп или непрерывный кинетическая мониторинга были использованы для количественного измерения взаимодействия белка с ДНК. Мы обсуждаем соответствующие элементы управления специфичности, в том числе лечения неспецифического IgG или без белка или первичного антитела. Применение анализа описаны в том числе его полезности в скрининге лекарственных и представительные положительные и отрицательные результаты обсуждаются.

Введение

ДНК-связывающий анализы могут быть использованы при измерения способности факторов транскрипции, чтобы взаимодействовать с ДНК. Анализы на ДНК связывающие включают анализы электрофоретических сдвига подвижности (EMSA), которые зависят от меченных олигонуклеотидов ¹ или хемилюминесценции анализов ^2. Хроматина immuneprecipitation (чип) на основе анализов ^3, а также анализы, использующие форматы 96-луночных ⁴ также были описаны. Тем не менее, EMSA не является количественный анализ, что требует использования радиоактивно меченных олигонуклеотидов. Когда ядерные белки ассоциируют с конкретными последовательностей нуклеотидов промоутер, связывающие комплексы отсталых на полиакриламидном геле и специфическим фактором транскрипции может быть подтверждено с антителом "supershift". Мы разработали количественный ДНК-анализа связывания с использованием твердофазного иммуноферментного формат (D-ELISA), который способен измерять взаимодействие RUNX2 с ДНК-связывающих последовательностей, соответствующих определенных промоторных элементов ян Runx2 генов-мишеней. Использование анти-антителом Runx2 обеспечивает специфичность анализа и отсутствие радиоактивной метки отличить этот анализ от традиционного анализа гель сдвига ^5. Обнаружение связывания комплексов можно с использованием вторичного антитела, соединенного с пероксидазой хрена (HRP), который преобразует в HRP субстрат, тетраметилбензидин (ТМВ) в окрашенный продукт для спектрофотометрического анализа. Анализ сообщалось здесь, могут включать использование мутантных ДНК-олигонуклеотидов в качестве контроля и может быть использован для обнаружения конкурентных или неконкурентные ингибиторы ДНК-связывающий. Скрининг новых соединений противоопухолевых также возможно с этим анализом.

протокол

Несколько этапы выполняются раньше времени и несколько реактивы получают и хранят до процедуры: (1) выделение культуры и белок клетки, (2) Получение олигонуклеотида (3) Получение 96-луночных планшетах, (4) ядерный экстракт Инкубационный ночь. Процедура требует 2 дня из-за инкубации в течение ночи ядерного белка с ДНК-олигонуклеотидов.

1. Подготовка буферов

1.1 изоляции ядерных белков

1. Гипотонического буфера: Для приготовления 100 мл гипотонического буфера, добавить 1 мл (1 М HEPES, рН 7,9), 150 мкл (1 М MgCl _2), 333 мкл (3 М KCl) до 98,3 мл H ₂ O. Конечные концентрации: 10 мм HEPES, 1,5 мМ MgCl _2, 10 мМ KCl. Для Гипотоническая буфера + NP40 (для использования на стадии 2,11): Добавить 0,5 мл (10% NP40) до 9,5 мл гипотонического буфера для окончательного 0,5% NP40.
2. Низкая Соль буфера: Для приготовления 100 мл низкосолевого буфера (для использования на стадии 2.15), добавить 1 мл (1 М HEPES, рН 7,9), 25 мл Глицерин, 150 мкл (1 М MgCl _2), 666 мкл (3 М KCl), 40 мкл (0,5 М ЭДТА) до 73 мл H ₂ O. Конечные концентрации: 10 мМ HEPES, 25% глицерина, 1,5 мМ MgCl _2, 20 мМ KCl, 0,2 мМ ЭДТА.
3. Высокая Солт буфера: Для приготовления 100 мл высокой солевого буфера (для использования на стадии 2.15), добавить 1 мл (1 М HEPES, рН 7,9), 25 мл глицерина, 150 мкл (1 М MgCl _2), 26,7 мл (3 М KCl), 40 мкл (0,5 М ЭДТА) в 47 мл H ₂ O. Конечные концентрации: 10 мМ HEPES, 25% глицерина, 1,5 мМ MgCl _2, 800 мМ KCl, 0,2 мМ ЭДТА.
4. 10% NP40 Моющее средство: 10 мл NP40 до 90 мл Н ₂ О
5. Протеазы и ингибиторы фосфатазы [добавлено к гипотонического буфера + NP40 (этап 2.11), низкой солевого буфера (этап 2.15) и высокой солевого буфера (этап 2.15) непосредственно перед использованием]: Добавить 2,5 мкл (1 М DTT) и 50 мкл ингибиторов протеаз (100x) в 5 мл буфера для каждой конечной концентрации 0,5 мМ ДТТ и ингибиторы протеазы 1x. Ингибитор протеазы 100x исходную смесь включает в себя:фторид натрия (Ser / Thr, кислые фосфатазы), ортованадат натри (Tyr, щелочных фосфатаз), β-глицерофосфат (Ser / Thr фосфатазы), пирофосфат натрия (Ser / Thr фосфатазы), апротинин (Ser протеазы), бестатин (амино-пептидазы ), E64 (Цистеинпротеазы), лейпептина (Ser / Cys протеазы), ЭДТА (металлопротеазами).

1.2 Подготовка аналитических планшетов

1. Пластина фиксации Решение: для приготовления 500 мл раствора, добавляют 5,25 г карбоната натрия в 500 мл H ₂ O, хорошо перемешать и довести рН до 9,7 для конечной концентрации 0,1 М карбоната натрия.
2. Блокируя плиты решение: Для подготовки акции поли-ди / DC олигонуклеотида, ресуспендируют 1 шт (~ 50 мг) из поли-ди / DC в 1 мл 10 мМ Трис / HCl, рН 7,9, содержащего 1 мМ ЭДТА для концентрации акций 50 мкг / мкл. Со разбавляют до 1 мкг / мкл до использования.

1.3 Мойка буферы и разведения антител

ПРИМЕЧАНИЕ: Стрептавидин промывочный буфер является используется для мытья тарелок между дополнений и разбавить первичные и вторичные антитела.

1. Чтобы приготовить 1 л стрептавидин промывочного буфера, добавляют 2,4 г Tris / HCl, 37,5 мл (4 М NaCl), 10 мл (10% BSA), 5 мл (10% Tween-20), до 1 л стерильной Millipore-отфильтрованной воде , рН 7,18. Хранить при 4 ° С. Конечные концентрации: 20 мМ Tris / HCl, 150 мМ NaCl, 0,1% BSA, 0,05% Tween-20.

1.4 ДНК-связывающий буфер

Примечание: Этот буфер хранили при -20 ° С.

1. Чтобы приготовить 15 мл буфера для связывания ДНК, добавьте 180 мкл (1 М HEPES, рН 7,9), 300 мкл (3 М KCl), 12 мкл (0,5 М ЭДТА, рН 8,0), 7,5 мкл (1 М ДТТ), 3,0 мл (60% глицерина), 300 мкл (50 мкг / мкл поли-ди / DC) разбавляют деионизированной / дистиллированная H ₂ O (12 мл). Конечные концентрации: 12 мм HEPES / рН 7,9, 60 мМ KCl, 0,4 мМ ЭДТА, 0,5 мМ DTT, 12% глицерина, 1 мкг / мкл поли-ди / DC.

2. Культура клеток и атомному Изоляция Белок

т "> Примечание: подготовка требует около 3 ч. стимуляции клеток будет зависеть от эксперимента количество клеток, используемых для каждого эксперимента будет меняться и все объемы отражают типичный эксперимент с использованием 3 х 10 ⁷ клеток / точку Регулировка объемов для размещения... число клеток на самом деле используется в эксперименте ^6.

1. Для подготовки ядерный белок для анализа связывания ДНК, культуры клеток человека, которые выражают Runx2 (эндотелия, остеосаркома, рак молочной железы клетки) в соответствующих средствах массовой информации ^6.
2. Лечить субконфлюентные клетки с нокодазолом (0,2 мкг / мл в течение 16 часов), чтобы арестовать клетки в клеточного цикла границе G2 / M ^6. В этих условиях белок RUNX2 стабилизируется и максимальный связывающий ДНК достигается. Таким образом, достаточно ядерный белок доступен для нескольких анализов и ингибиторы можно сравнить с того же препарата.
3. Для каждого шага, предварительно охладить центрифуги до 4 ° С и подготовить буферы и охладить 20 мин при 4 ° С до сбора клеток.
4. Холод клетки (4 ° С) и проводить процедуры по льду.
5. Центрифуга клетки при 1000 оборотов в минуту в течение 5 мин в 15 мл полипропилена с круглым дном трубки.
6. Вымойте 1x ледяным PBS (Са ^{2 +} и Mg ^{2 +} бесплатная).
7. Центрифуга снова и отбросить PBS супернатанта.
8. Добавить 500 мкл гипотонического буфера без ингибиторов протеазы, стараясь полностью ресуспендируют осадок клеток.
9. Передача содержимого в 1,5 мл пробирку Эппендорфа.
10. Сразу центрифуге при 5500 оборотов в минуту для 5,5 мин; отбросить супернатант и держать осадок клеток.
11. Ресуспендируют осадок клеток в 500 мкл гипотонического буфера, содержащего 0,5% NP40. Добавить протеазы и ингибиторы фосфатазы и 0,5 мМ ДТТ (как описано в стадии 1.1.5).
12. Разрешить образец отдыхать на льду в течение 30 мин.
13. Центрифуге при 13000 оборотах в минуту в течение 10 мин.
14. Удалите супернатант (содержащий цитозольные белки).
15. Ресуспендируют ядерной осадок в 60 мкл каждого из низкой салт буфер (к которому ингибиторы протеазы и 0,5 мМ ДТТ, которые были добавлены с шага 1.1.5) и высокой буферной соли (к которому ингибиторы протеазы и 0,5 мМ ДТТ, которые были добавлены с шага 1.1.5) в общей сложности 120 мкл. Добавить 60 мкл низкосолевого буфера к осадку первой и ресуспендируют, затем добавить 60 мкл высокой солевого буфера. Vortex гранул, чтобы помочь в ресуспендированием.

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг помогает избавиться от некоторых из ядерных мембранных белков и настроить для лизиса шаге: низким содержанием соли первый (ресуспендируют осадок, вихревой), то высокая соль (вихрь) оптимизирует этот шаг. Хранить экстракт на льду в течение 30 мин, с вортексе после первых 10 мин.

16. Центрифуга при 12000 оборотах в минуту в течение 15 мин; сохранить супернатант, содержащий ядерный белок.
17. Измерение концентрации белка (попытаться сохранить образцы в 2-5 мг / мл), аликвоты в соответствующих количествах (10 мкл / пробирка) и хранят при -80 ° С.

ПРИМЕЧАНИЕ: Расчетный выход: 30 х 10 ⁶ челLs даст 5 мкг / мкл белка в 120 мкл. 5 х 10 ⁶ клеток даст 2,2 мкг / мкл белка в 40 мкл.

3. Подготовка двухцепочечный олигонуклеотид

1. Дизайн комплементарных олигонуклеотидов с совместимыми половиной сайтов на концах. Для RUNX2 них являются: 5'-CGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATAC TCG-3'-биотин (смысл) и 5'CGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT Т GTGGTT AATACG-3'-биотин (антисмысловой).

ПРИМЕЧАНИЕ: эксперименты Пилотные определено, что три Runx2 сайты связывания и одного конца помечены биотин дали наиболее воспроизводимые результаты.

2. Подготовка 5x буфер отжига: Добавить 300 мкл (1 М Трис-HCl, рН 7,6), 30 мкл (1 М MgCl ₂₎ добавляли 10 мкл (1 М DTT) в 260 мкл H ₂ O (конечная 600 мкл).
3. К 200 пмоль каждого одноцепочечной Oligonucleotide (3 мкл), добавить 12 мкл 5x отжига буфера и 45 мкл H ₂ O в общей сложности 60 мкл (200 pmol/60 мкл).
4. Нагревают при 95 ° С в течение 5-10 мин в нагревательном блоке.
5. Остудить до 65 ° C медленно (установив температуру до 65 ° С, она занимает 15 мин), затем охлаждают до комнатной температуры медленно, выключив питание нагревательного блока (или путем размещения в 50 мл воды 65 ° C в стакане на льду, это занимает 15-20 мин).

4. Подготовка 96-луночных

ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте белки молока в промывных буферов.

1. Fix тарелку с фиксирующим раствором (0,1 М карбоната натрия): добавить 300 мкл / лунку.
2. Инкубировать в течение 2 часов при не-качалка при комнатной температуре (RT) или нет качалки при 4 ° С (O / N).
3. Вымойте пластины 3 раза с стрептавидин промывочного буфера (ВБ): добавить 300 мкл / лунку каждый раз.
4. Добавить биотин-меченого двухцепочечной олигонуклеотида (3 консенсус связывающих сайтов на нуклеотида) в течение 2 часов шIth качалки (1,25 нмоль / лунку; 100 мкл / лунку).
5. Вымойте 3x холодной ВБ: добавить 300 мкл / лунку и сразу же пластину перевернули в раковину и промокните края на бумажное полотенце после каждого добавления.

ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте наконечники для удаления жидкости из пластин, поскольку это может скрести авидин: биотин: ДНК комплексы из скважин. Делайте это в течение всех последующих стадий промывки.

5. Инкубация с ядерной Extract

ПРИМЕЧАНИЕ: Не заменяйте лосося или ДНК спермы сельди для поли DI / DC Обратный буфера. Избегайте блокировки пластины с молочными протеинами. Оба этих блокирующих агентов привести к высоким фоновым значениям.

1. Инкубировать с конкретной фактора транскрипции, полученного из ядерного экстракта (90 мкл / лунку). Подготовьте основной смеси, содержащее ядерное экстракт (ДНК-связывающий белок; 3-9 мкг / лунку) буфер + поли-ди / DC (1 мкг / мкл от 50 мкг / ул складе) в 1x связывания ДНК. Громкость по мере необходимости для общего количестваскважины, необходимые (90 мкл / лунку).
2. Любой потенциальный ингибитор, такой как витамин D3 (рис. 2) или соединение CADD 5221975 (рис. 3), или соответствующего разведения контроля растворителе, таком как этанол, добавляют при этом шаге.
3. Место пластины на качалки платформу, O / N при 4 ° С.
4. Вымойте 3x с ВБ: добавить 300 мкл / лунку

6. Добавление первичного антитела

ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные разведения антител следует приготовить свежую - хранение не рекомендуется.

1. Развести Runx2-специфическое моноклональное антитело (запас 1 мкг / мкл) 1/5, 000 в стрептавидином промывочный буфер. Подготовка достаточно для дополнение к каждой лунке 96-луночного планшета (90 мкл / лунку) в трех экземплярах.
2. Инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре на ротационном платформы.
3. Вымойте 3x с ВБ, добавить 300 мкл / лунку.

7. Добавление вторичного антитела

ПРИМЕЧАНИЕ: Вторичное разведения антител может быть СТОкрасный при 4 ° С в течение ночи при необходимости на следующий день.

1. Развести F _{AB-специфическим} сродством очищен-HRP с сопряженными антитела (7,1 мг / мл акции), чтобы 1:1,400 в стрептавидином моющий буфер: 3,5 мкл antibody/5.0 мытья мл буфера. Подготовка достаточно для дополнение к каждой лунке 96-луночного планшета (90 мкл / лунку) в трех экземплярах.
2. Инкубировать 30 мин при комнатной температуре на ротационном платформы.
3. Вымойте 6x с ВБ путем обращения тарелку в раковину (300 мкл / лунку).

8. HRP субстрат и разработка новых продуктов

1. Добавить 50 мкл ТМВ субстрата на лунку непосредственно на складе бутылки.
2. Выдержите 10-20 минут при комнатной температуре в темноте (остановка метод реакции) или измерить абсорбцию непосредственно (непрерывное кинетическую мониторинг).

9. Реакция измерения

1. Стоп метод реакции: Для реакции визуальной остановки, проверки для изменения цвета на голубое и остановить реакцию с 50 мкл серной кислоты.
2. Измерить поглощение при 450 нмBiotrak II Видимый ридер спектрофотометр (Amersham Biosciences; GE Healthcare Biosciences Корпорация Пискатауэй Нью-Джерси, США) или аналогичный прибор.
3. Непрерывная кинетический метод мониторинга: Добавить субстрат после последней промывки и просто до размещения в спектрофотометра (не остановить реакцию).
4. Измерьте оптическую плотность при 635 нм с Био-Тек Синергия HT Multi-реакции микропланшет-ридере спектрофотометра (Bio-Tek Instruments, Inc; Winooski, Вермонт, США) или аналогичный прибор.

Результаты

Метод D-ИФА весьма специфичен для назначенного ДНК-связывающего белка, пока используется последовательность конкретных, двухцепочечной олигонуклеотид, содержащий три копии консенсус Runx2 сайта связывания (ACACCA). Первичный антитело, распознающее белковый фактор также повышает специфич?...

Обсуждение

ДНК-связывающий анализы используются для измерения способности факторов транскрипции, чтобы взаимодействовать с ДНК. Анализы на ДНК связывающие включают электрофоретическую сдвиг мобильности (EMSA) ¹ и хроматина immuneprecipitation (чип) анализы, основанные ^3, а также анализов с испол...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly dI/dC	GE Healthcare, Piscataway, NJ	US20539-5UN	1 U ~50mg
RUNX2 antibody	MBL International Corp., Woburn, MA	D130-3	1 mg/ml
Fab-specific peroxidase conjugated antibody	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A9917	7.1 mg/ml
TMB Substrate (tetramethyl benzidine)	EXALPHA Biologicals, Shirley, MA	X1189S	100 ml
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	57995	Plate-fixing
Sulfuric Acid	VWR, West Chester, PA	BDH-39922-1	Stop solution
Multi-well plates	Greiner Bio-One, Basel, Switzerland	655996	Avidin-coated, black sides
HALT	Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL	78440	Protease and phosphatase inhibitors
Chemicals	Various manufacturers	Laboratory grade
Table 1. Reagents
Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader	Amersham Biosciences		For use with stop reaction method
Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader	Bio-Tek Instruments, Inc.		For use with continuous kinetic monitoring
Table 2. Equipment