유전자 발현의 DNA 상호 작용, 디스 전사 레귤레이터, 그리고 소설 안티 종양 에이전트를 식별 : 단백질을 연구하는 정량 분석

요약

우리는 DNA 전사 인자와의 상호 작용을 측정하는 정량적 DNA-결합, ELISA 기반 분석법을 개발 하였다. RUNX2 단백질에 대한 높은 특이성은 합의 DNA 인식 올리고 뉴클레오티드 및 특정 단일 클론 항체를 달성했다. 효소 결합 항체 반응 기질과 발색 검출은 실시간으로 모니터링 하였다.

초록

이러한 전기 영동 이동성 이동 분석 (EMSA), 화학 발광 분석법, 크로 마틴 면역 침전 (칩) 기반의 분석 및 멀티 웰 기반의 분석과 같은 많은 DNA-결합 분석은 전사 인자의 활성을 측정하는 데 사용됩니다. 그러나 이러한 분석은, nonquantitative 있습니다 특이성이 부족, 방사성 동위 원소 표지 된 올리고 뉴클레오티드의 사용을 포함 할 수 있으며, 바인딩 DNA의 억제제의 검사에 대한 적응력이되지 않을 수 있습니다. 한편, 정량적 DNA 결합 효소 결합 면역 분석법 (D-ELISA) 분석을 이용하여, 우리는 바이오틴에 존재 컨센서스 DNA 결합 서열과 특정 관계에 의존 RUNX2 전사 인자를 사용하여 DNA와 핵 단백질 상호 작용을 보여 표지 올리고 뉴클레오티드. 세포의 제조, 핵 단백질, 및 이중 가닥 올리고 뉴클레오티드의 디자인의 추출 기술되어있다. 아비딘 코팅 된 96 - 웰 플레이트는 알칼리성 버퍼 고정 염기 차단 버퍼의 핵 단백질로 배양된다. FOLL플레이트의 광범위한 세정 특정 일차 항체 및 이차 항체 배양을 인해서 비색 반응 냉이 퍼 옥시 다제 기질과 발전 첨가하여된다. 정지 반응 키네틱 모드 또는 연속 모니터링 정량적 DNA와 단백질의 상호 작용을 측정하기 위해 사용되었다. 우리는 비 특이 IgG 또는 단백질 또는 일차 항체없이 치료 등의 적절한 특이성 컨트롤을 설명합니다. 분석의 응용 프로그램은 그 약물 검사에서 유틸리티 대표 긍정 및 부정적인 결과를 설명하는 등의 설명되어 있습니다.

서문

DNA-결합 분석은 DNA와 상호 작용하는 전사 인자의 능력을 측정하는데 유용성을 갖는다. 바인딩 DNA에 대한 분석은 방사성 동위 원소 표지 된 올리고 뉴클레오타이드 ¹ 또는 화학 발광 ^분석법에 달려있는 전기 이동성 이동 분석 (EMSA) 등이 있습니다. 96 - 웰 형식 ^{4를 사용} 염색질 immuneprecipitation (칩)을 기준으로 분석 ^3뿐만 아니라 분석도 기재되어있다. 그러나 EMSA는 방사성 표지 된 올리고 뉴클레오티드의 사용을 필요로 비 정량 분석​​법이다. 핵 단백질이 특정 염기 프로모터 서열에 연결할 때, 바인딩 단지는 폴리 아크릴 아마이드 젤에 지체하고 특정 전사 인자가 항체 "supershift"로 유효성을 검사 할 수 있습니다. 우리는 정의 된 프로모터 요소에 대응하는 DNA 결합 서열과 RUNX2의 상호 작용을 측정 할 수있는 효소 - 결합 면역 포맷 (D-ELISA)을 이용하여 정량적 인 DNA-결합 분석을 개발 IN 개의 RUNX2 표적 유전자. 반대로 RUNX2 항체의 사용은 분석 특이성을 제공하고, 방사선 표지의 부족은 전통적인 겔 쉬프트 분석이 분석에서 ⁵ 구별. 바인딩 착물의 검출은 분광 광도 분석을위한 착색 된 제품에 HRP 기질, 테트라 메틸 벤지딘 (TMB)을 변환 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)에 결합 된 이차 항체를 이용하여 가능하다. 여기에보고 된 분석은 컨트롤과 같은 변이 된 DNA 올리고 뉴클레오티드의 사용을 포함 할 수 있으며 DNA 결합의 경쟁적 또는 비 경쟁적 억제제의 검출을 위해 사용될 수있다. 새로운 항 종양 화합물의 심사는이 분석도 가능하다.

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프로토콜

여러 단계가 시간 앞서 수행되는 여러 시약은 절차 이전에 제조 및 저장됩니다 : (1) 세포 배양 및 단백질 분리, (2) 올리고 뉴클레오티드의 준비, (3) 96 - 웰 플레이트의 준비, (4) 핵 추출물 부화 하룻밤. 절차 때문에 DNA 올리고 뉴클레오타이드와 핵 단백질의 하룻밤 배양 2 일이 필요합니다.

1. 버퍼의 준비

1.1 핵 단백질 분리

1. 저장성 버퍼 : 저장성 버퍼 100 ㎖를 준비하려면, 98.3 ML의 H ₂ O 1 ㎖ (1 M HEPES, 산도 7.9), 150 μL (1 M MgCl2를 _2), 333 μL (3 M의 KCl)을 추가 최종 농도 10 mM의 HEPES, 1.5 mM의 _MgCl2를, 10 mM의 KCl을. 저장성 버퍼 + NP40 (단계 2.11에 사용)의 경우 : 최종 0.5 % NP40 9.5 ml의 저장성 버퍼에 0.5 ㎖ (10 % NP40)를 추가합니다.
2. 낮은 소금 버퍼 (단계 2.15에서 사용하기에) 낮은 소금 버퍼 100 ㎖를 준비하려면, 1 ㎖ (1 M HEPES, 산도 7.9), 25m를 추가L의 글리세롤, 150 μL (1 M MgCl2를 _2), 666 μL (3 M의 KCl), 40 μL (0.5 M EDTA) 73 ML의 H ₂ O에 최종 농도 10 mM의 HEPES, 25 % 글리세롤, 1.5 mM의 _MgCl2를 20 밀리미터의 KCl, 0.2 mM의 EDTA.
3. 높은 소금 버퍼 (단계 2.15에서 사용하기에) 높은 소금 버퍼 100 ㎖를 준비하려면, 1 ㎖ (1 M HEPES, 산도 7.9), 25 ㎖의 글리세롤, 150 μL (1 M _MgCl2를), 26.7 mL를 넣고 (3 M 의 KCl), 40 μL (0.5M EDTA) 47 ML의 H ₂ O에 최종 농도 10 mM의 HEPES, 25 % 글리세롤, 1.5 mM의 MgCl2를 _2, 800 밀리미터의 KCl, 0.2 mM의 EDTA.
4. 10 % NP40 세제 : 10 ㎖ NP40 90 ML의 H ₂ O
5. 단백질 분해 효소와 인산 가수 분해 효소 억제제 [저장성 버퍼에 추가 + NP40 (단계 2.11), 저염 버퍼 (단계 2.15)로, 높은 소금 버퍼 (단계 2.15)를 사용하기 바로 전에] : 2.5 μL (1 M DTT)를 추가, 50 0.5 mM의 DTT 및 1X 프로테아제 억제제의 최종 농도에 대한 각 버퍼의 5 ML에 단백질 분해 효소 억제제 (100X)의 μL. 단백질 분해 효소 억제제 100X 주식 혼합물을 포함한다 :불화 나트륨 (SER /의 Thr, 산성 인산 가수 분해 효소), 나트륨 오르토 바나 데이트 (티르, 알칼리 포스 파타 아제), β-글리세로 포스페이트 (SER /의 Thr 포스파타제), 피로 인산 나트륨 (SER /의 Thr 포스파타제), Aprotinin의 (SER 단백질 분해 효소), Bestatin (아미노 펩 티다 ), E64 (시스테인 프로테아제), 류 펩틴 (SER / Cys를 프로테아제), EDTA (메탈로).

분석 플레이트의 1.2 준비

1. 판 솔루션을 고정 : 용액 500 ㎖를 준비 500 ㎖ H ₂ O 5.25 g 나트륨, 탄산을 추가, 잘 ​​섞는다 0.1 M 탄산나트륨의 최종 농도 9.7로 산도를 조정합니다.
2. 판 차단 솔루션 : 스톡 폴리를 준비하려면 DI / DC 올리고,에 resuspend 1 단위 (~ 50 mg)의 폴리 디 / DC의 1 ~ 10 mM 트리스 / 염산, 50 μg의 재고 농도 1 mM의 EDTA를 포함하는 pH를 7.9 ㎖ / μL. 주식은 1 ㎍ / ㎕를 사용하기 전에 희석된다.

1.3 세척 버퍼와 항체 희석

참고 : 스트렙 타비 딘 세척 버퍼는 추가 사이에 접시를 씻어 수 있으며, 1 차 및 2 차 항체를 희석하는 데 사용됩니다.

1. 스트렙 타비 딘 세척 버퍼 1 L를 준비하려면, 2.4 g 트리스 / 염산 37.5 ㎖ (4 M의 NaCl), 10 ㎖ (10 % BSA), 5 ㎖ (10 % 트윈 20), 1 L 밀리 포아 멸균 여과 물을 추가 , 산도 7.18. 4 ℃에서 보관 최종 농도 : 20 mM 트리스 / HCl을 150 mM의 염화나트륨, 0.1 % BSA, 0.05 % 트윈 -20.

1.4 DNA 결합 버퍼

참고 :이 버퍼는 -20 ° C.에 저장된다

1. DNA 결합 완충액 15 ㎖를 준비하려면, 180 μL (1 M HEPES, 산도 7.9), 300 μL (3 M의 KCl), 12 μL (0.5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8.0), 7.5 μL (1 M DTT), 3.0 mL를 넣고 (60 % 글리세롤), 300 μL (50 ㎍ / ㎕의 폴리 디 / DC) 증류 / 탈 H ₂ O (12 ㎖)으로 희석. 최종 농도 : 12 mM의 HEPES / pH가 7.9, 60 밀리미터의 KCl, 0.4 mM의 EDTA, 0.5 mM의 DTT, 12 % 글리세롤, 1 ㎍ / ㎕의 폴리 디 / DC.

2. 세포 배양 및 핵 단백질 분리

t "> 참고 :.. 준비는 각 실험에 사용되는 세포의 수는 달라질 세포의 자극이 실험에 따라 달라집니다 약 3 시간을 필요로하고 모든 볼륨은 3 × 10 ⁷ 세포 / 포인트를 사용하여 일반적인 실험을 반영 수용하기 위해 볼륨을 조정합니다. 실제로 실험 ^6에서 사용한 셀 번호.

1. DNA 결합 분석, 적절한 용지 ⁶ RUNX2 (내피, 골육종, 유방암 세포)를 표현하는 문화를 인간의 세포 핵 단백질을 준비합니다.
2. G2 / M 세포주기의 경계 ^6시에 세포를 체포하기 위해 노 코다 졸 (16 시간 0.2 ㎍ / ㎖)으로 subconfluent 세포를 치료. 이러한 조건 하에서, RUNX2 단백질 안정화와 최대 결합 DNA가 달성된다. 여러 분석 및 억제제는 같은 준비에서 비교 될 수있다이 방식으로, 충분한 핵 단백질을 사용할 수 있습니다.
3. 각 단계, 4 ° C에 원심 분리기를 사전 냉각 및 버퍼를 준비하고 세포 수확하기 전에 4 ° C에서 20 분을 진정.
4. 칠 세포 (4 ℃)와 얼음에 실시 절차.
5. 15 ㎖의 폴리 프로필렌 둥근 바닥 관에서 5 분간 1,000 rpm으로 원심 분리기 세포.
6. 얼음처럼 차가운 PBS로 세척 1X (칼슘 ^{2 +} 및 Mg를 ^{2 +} 무료).
7. 다시 원심 분리기와 PBS의 상층 액을 버린다.
8. 완전 세포 펠렛을 재현 탁주의하면서, 단백질 분해 효소 억제제없이 저장성 버퍼 500 μl를 추가합니다.
9. 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 내용을 전송합니다.
10. 즉시 5.5 분 동안 5,500 rpm에서 원심 분리, 상층 액을 버리고 세포 펠렛을 유지합니다.
11. 0.5 % NP40을 함유 저장성 완충액 500 μL에서 세포 펠렛을 재현 탁. 단백질 분해 효소와 인산 가수 분해 효소 억제제와 0.5 mM의 DTT을 (단계 1.1.5에 설명 된대로)를 추가합니다.
12. 샘플이 30 분 동안 얼음에 휴식 할 수 있습니다.
13. 10 분 동안 13,000 rpm으로 원심 분리기.
14. 상층 액 (세포질 단백질을 포함)을 폐기하십시오.
15. 60 ㎕의 낮은 샐 각 핵 펠렛을 재현 탁T 버퍼 (되는 단백질 분해 효소 억제제와 0.5 mM의 DTT 단계 1.1.5에서 추가되었습니다), 120 μL의 총에 대한 높은 소금 버퍼 (되는 단백질 분해 효소 억제제와 0.5 mM의 DTT 단계 1.1.5에서 추가되었습니다.) 첫 번째 펠릿을 Resuspend 낮은 소금 버퍼의 60 μl를 추가하고 높은 소금 버퍼의 60 μl를 추가합니다. 재 부상에 도움이 펠렛을 소용돌이.

참고 :이 단계는 핵 막 단백질의 일부​​를 제거하는 데 도움이 용해 단계 설정 : 저 염분 처음 (에 resuspend 펠렛, 소용돌이), 다음 높은 소금 (소용돌이)이 단계를 최적화합니다. 처음 10 분 후 소용돌이로 교반과 함께 30 분 동안 얼음 추출 보관하십시오.

16. 15 분 동안 12,000 rpm으로 원심 분리기, 핵 단백질을 포함하는 상층 액을 유지합니다.
17. C. ° -80 단백질 농도 (2-5 ㎎ / ㎖에서 샘플을 유지하려고), 적절한 양 (10 μL / 관)에서 나누어지는 및 저장을 측정

참고 : 예상 수익률 : 30 X 10 ⁶ CELLS는 120 μL의 5 ㎍ / ㎕의 단백질을 얻을 것입니다. 5 × 10 ⁶ 세포는 40 μL에서 2.2 ㎍ / ㎕의 단백질을 얻을 것입니다.

3. 이중 가닥 올리고 뉴클레오티드의 제조

1. 끝 호환 절반 사이트와 보완 올리고 뉴클레오티드를 디자인합니다. RUNX2 이러한 위치 : 5'-CGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATAC TCG-3'-비오틴 (감각)과 5'CGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT T GTGGTT AATACG-3'-비오틴 (안티센스).

참고 : 세 RUNX2 결합 부위와 단일 엔드라는 비오틴이 가장 재현성 결과를 굴복 것으로 판단 파일럿 실험.

2. 배 어닐링 버퍼를 준비 260 μL의 H ₂ O (최종 600 μL)에 300 μL (1 M 트리스 - 염산, 산도 7.6), 30 μL (1 M MgCl2를 _2), 10 μL (1 M DTT)를 추가합니다.
3. 각각의 단일 가닥 olig 200 pmol의에onucleotide (3 μL), 배 어닐링 버퍼의 12 μL, 60 μL (200 pmol/60 μL)의 총 45 μL의 H ₂ O를 추가합니다.
4. 가열 블록에 5 ~ 10 분 동안 95 ° C에서 가열한다.
5. 65 ° 쿨 천천히 가열 블록 (또는 65 ° C의 물 50 ㎖에 배치하여의 전원을 끄기 천천히 실온으로 냉각 한 후, (65 ° C로 온도를 설정함으로써, 15 분 소요) C 얼음에 비커에,이) 15 ~ 20 분입니다.

4. 준비 96 - 웰 플레이트

참고 : 세척 버퍼에 우유 단백질을 사용하지 마십시오.

1. 수정 플레이트 고정 용액 (0.1 M 탄산나트륨) : 추가 300 μL / 잘.
2. 실온 (RT)에서 락, 또는 더 4 ° C (O / N)에 락을 2 시간 동안 품어.
3. 스트렙 타비 딘 세척 버퍼 (WB)와 함께 접시에 배를 세척 : 300 μL / 잘 때마다 추가 할 수 있습니다.
4. 추가 비오틴 표지 이중 가닥 올리고 뉴클레오타이드 (3 합의 결합 부위 당 뉴클레오티드)에 대한 2 시간 wi 번째 (1.25 nmol의 /도, 100 μL / 잘) 락.
5. 차가운 WB 씻을 배는 300 μL / 잘 추가 한 다음 바로 싱크대에 접시를 반전하고 각 첨가 한 후 종이 타월에 가장자리를 얼룩.

참고 :이 아비딘을 긁어 수 있으므로 판에서 유체를 제거하기 위해 피펫 팁을 사용하지 마십시오 비오틴 : 우물에서 DNA 복합체. 이후의 모든 세척 단계에 대해이 작업을 수행합니다.

5. 핵 추출물과 함께 배양

참고 : 폴리 디 / DC 차단 버퍼에 연어 나 청어 정자 DNA를 대체하지 않습니다. 우유 단백질과 번호판을 차단하지 마십시오. 이러한 블로킹 제는 모두 높은 배경 값을 초래한다.

1. 핵 추출물 (90 μL / 웰)에서 제조 된 특정 전사 인자에 품어. 핵 추출물을 포함하는 마스터 믹스를 준비 (DNA 결합 단백질을, 3-9 ㎍ / 웰) + 폴리 디 / DC 1X DNA에 (50 ㎍ / UL 재고 1 ㎍ / μL)의 버퍼를 바인딩. 볼륨 등의 총 수에 필요한필요한 우물 (90 μL / 웰).
2. 비타민 D3 (그림 2) 또는 CADD 화합물 5,221,975 (그림 3), 또는 에탄올과 같은 용매 컨트롤의 적절한 희석 등의 잠재적 억제제,이 단계에서 추가됩니다.
3. 4 ° C에서 O / N, 플랫폼 락에 장소 접시
4. WB와 세척 배는 300 μL / 잘 추가

6. 차 항체의 추가

참고 : 1 차 항체 희석 신선한 준비를해야합니다 - 저장하지 않는 것이 좋습니다.

1. RUNX2 특정 단일 클론 항체 (주 1 ㎍ / μL) 2 / 10, 스트렙 타비 딘에 000 버퍼를 씻어 희석. 96 - 웰 플레이트 (90 μL / 웰) 세중의 각 웰에 추가를 위해 충분히 준비합니다.
2. 락을 플랫폼에서 실온에서 1 시간 동안 배양한다.
3. WB 씻을 배는, 300 μL / 잘을 추가합니다.

7. 이차 항체의 추가

참고 : 2 차 항체 희석 STO이 될 수 있습니다다음날 필요 하룻밤 경우 4 ° C에서 빨간색.

1. 스트렙 타비 딘에 1:1,400에 F _AB-특이 적 친 화성 정제-HRP 결합 된 항체 (7.1 ㎎ / ㎖ 주식) 희석 버퍼를 씻어 : 3.5 μL의 antibody/5.0 ml의 세척 버퍼. 96 - 웰 플레이트 (90 μL / 웰) 세중의 각 웰에 추가를 위해 충분히 준비합니다.
2. 락을 플랫폼에서 RT에서 30 분 동안 품어.
3. 싱크 (300 μL / 웰)로 반전 판에 의해 WB 씻을 6 배.

8. HRP 기질 및 제품 개발

1. 주식 병에서 잘 직접 당 TMB 기판의 50 μl를 추가합니다.
2. 어둠 속에서 실온에서 20 분 알을 품다 (반응 법을 중지) 또는 직접 (연속 운동 모니터링)의 흡광도를 측정한다.

9. 반응 측정

1. 반응 법을 중지 시각 정지 반응, 푸른 분명에서 색상 변화를 확인하고 50 ㎕의 황산과 반응을 중지합니다.
2. 450 nm에서 흡광도를 측정한다Biotrak II 보이는 플레이트 리더의 분광 광도계 (아머 샴 바이오 사이언스, GE 헬스 케어 생명 과학 주식 피츠 카타 웨이 NJ, USA) 또는 유사한 악기.
3. 지속적인 운동 모니터링 방법 : 마지막 세척 후 기판을 추가하고 직전 분광 광도계에 배치하는 (반응을 정지하지 않는다).
4. 바이오 테크 시너지 HT 멀티 반응 마이크로 플레이트 리더 분광 광도계로 635 nm에서 흡광도를 측정한다 (바이오 테크 악기, Inc의,보기 Winooski, VT, USA) 또는 유사한 악기.

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결과

D-ELISA 방법은 한 합의 RUNX2 결합 부위 (ACACCA) 3 부작을 포함하는 일련의 별, 이중 가닥 올리고 뉴클레오티드를 사용으로 지정된 DNA 결합 단백질에 대한 매우 구체적인입니다. 단백질 인자를 인식 차 항체는 특이성을 향상시킨다. 차 항체 검출의 용이성 (그림 1)에 대한 착색 된 제품에 명확한 기판 (테트라 메틸 벤지딘)를 변환 공유 결합 된 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)가 포함되어 있습?...

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토론

DNA-결합 분석은 DNA와 상호 작용하는 전사 인자의 능력을 측정하기 위해 사용된다. 바인딩 DNA에 대한 분석은 전기 이동성의 변화 (EMSA) ¹ 염색질 immuneprecipitation (칩)을 기준으로 분석 ^3뿐만 아니라 96 - 웰 형식에게 이러한 화학 발광 분석법 ^{2와 4를 사용} 분석을 포함한다. EMSA가 아닌 정량적이고 방사성 동위 원소 ⁽³² P) 올리고 뉴클레오티드를 사용합니다. 이러한 핵 단...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly dI/dC	GE Healthcare, Piscataway, NJ	US20539-5UN	1 U ~50mg
RUNX2 antibody	MBL International Corp., Woburn, MA	D130-3	1 mg/ml
Fab-specific peroxidase conjugated antibody	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A9917	7.1 mg/ml
TMB Substrate (tetramethyl benzidine)	EXALPHA Biologicals, Shirley, MA	X1189S	100 ml
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	57995	Plate-fixing
Sulfuric Acid	VWR, West Chester, PA	BDH-39922-1	Stop solution
Multi-well plates	Greiner Bio-One, Basel, Switzerland	655996	Avidin-coated, black sides
HALT	Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL	78440	Protease and phosphatase inhibitors
Chemicals	Various manufacturers	Laboratory grade
Table 1. Reagents
Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader	Amersham Biosciences		For use with stop reaction method
Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader	Bio-Tek Instruments, Inc.		For use with continuous kinetic monitoring
Table 2. Equipment