La inducción farmacológica de la melanina epidérmica y Protección contra las quemaduras solares en un modelo de ratón humanizado

Resumen

Melanina epidérmica es inducida por la aplicación tópica de forskolina en un modelo murino de lo humano-UV sensible de piel clara. La manipulación terapéutica de los niveles de AMPc en la piel y el oscurecimiento de la epidermis a proteger firmemente contra la inflamación mediado por UV (quemadura solar) según lo medido por la dosis eritematosa mínima (MED) de ensayo.

Resumen

La equidad de la piel, sensibilidad UV y riesgo de cáncer de piel en todo correlaciona con la función fisiológica del receptor de melanocortina 1, una proteína de señalización T _s acoplado encuentra en la superficie de los melanocitos. Mc1r estimula la adenilciclasa y la producción de cAMP que, a su vez, hasta regula la producción melanocíticos de melanina en la piel. Con el fin de estudiar los mecanismos por los que la señalización Mc1r protege la piel frente a la lesión UV, este estudio se basa en un modelo de ratón con "piel humanizado", basada en la expresión epidérmica de factor de células madre (SCF). Ratones transgénicos K14-Scf conservan melanocitos en la epidermis y por lo tanto tienen la capacidad de depositar la melanina en la epidermis. En este modelo animal, de tipo salvaje resultados del estado Mc1r en la deposición sólida de pigmento eumelanina negro y un fenotipo con protección UV. En cambio, los animales K14-SCF defectuosa señalización Mc1r capacidad presentan una pigmentación rojo / rubio, muy poca eumelanina en la piel yun fenotipo sensible a UV. Razonando que la deposición de eumelanina que se podría mejorar por agentes tópicos que imitan la señalización Mc1r, encontramos que la aplicación directa de extracto de forscolina para la piel de ratones de piel clara Mc1r defectuosa como resultado robusto inducción eumelanina y la protección UV ^1. A continuación se describe el método para la preparación y la aplicación de un extracto de la raíz natural que contiene forskolina a K14-Scf ratones de piel clara, y presentarán un método para medir la sensibilidad UV mediante la determinación de la dosis eritematosa mínima (MED). El uso de este modelo animal, es posible estudiar la forma en la inducción de AMPc epidérmica y melanización de la piel afectan a las respuestas fisiológicas a la exposición UV.

Introducción

La incidencia de melanoma, la forma más mortal de cáncer de piel, se ha incrementado dramáticamente en las últimas décadas en Estados Unidos, sobre todo entre las personas de piel clara. Evidencia molecular y epidemiológico fuerte implica la radiación UV como un importante factor ambiental causante ^2-5. Aumento de la exposición UV en forma de exposición al sol y el uso de camas de bronceado es probable que sea responsable de gran parte de los aumentos en la incidencia de melanoma ^6-7. Riesgo del melanoma parece especialmente vinculado con las quemaduras de sol ^8, sobre todo los primeros años de vida ^9-10. Riesgo de quemaduras de sol no sólo está ligada a la dosis y la intensidad de los rayos UV, sino también por factores hereditarios que influyen en la respuesta cutánea a la radiación UV. Pigmentación de la piel es uno de los determinantes más importantes de la sensibilidad UV, el riesgo de quemaduras solares y el riesgo de cáncer. El melanoma se presenta aproximadamente veinte veces más frecuente en personas de piel clara en comparación con la individualización de piel oscurals ^11-13.

La melanina, un pigmento producido por los melanocitos en la epidermis, es el principal determinante de la tez de la piel. La melanina se presenta en dos variedades principales: (1) eumelanina, un pigmento de color marrón oscuro / negro eficaz en la absorción de la energía de la radiación UV, y (2) feomelanina, un color rojizo / pigmento rubia menos eficaz en la prevención de la penetración de los fotones UV en la piel. Color de la piel, sensibilidad UV y el riesgo de melanoma están determinados en gran medida por el contenido de eumelanina epidérmica ^14-15. El más eumelanina en la epidermis, los menos fotones UV puede penetrar en la piel. Debido a los bajos niveles de la eumelanina innatas, las personas de piel clara son mucho más propensos a los efectos agudos y crónicos de la radiación UV ^16-18.

Pigmentación de la piel, el riesgo de melanoma y la capacidad de "tan" después de la exposición UV todo se correlacionan con la capacidad de señalización de la melanocortina 1 del receptor (Mc1r), un G _s acoplado y siete transmembrana sreceptor urface en melanocitos ^19-22. Cuando Mc1r se une a su ligando cognado de alta afinidad, la hormona estimulante de melanocitos α-(α-MSH), hay una activación de la adenilato ciclasa y la producción del segundo mensajero AMPc ^23. La respuesta fisiológica normal de la piel después de la exposición UV incluye la producción epidérmica de α-MSH por los queratinocitos ^24-29. Nosotros y otros la hipótesis de que los queratinocitos derivados de α-MSH se une a Mc1r en melanocitos epidérmicos, iniciando la producción aguas abajo del segundo mensajero AMPc a través de la activación de la adenilato ciclasa ^30. niveles de cAMP controlan muchos aspectos de la diferenciación de los melanocitos, incluidas las vías de supervivencia, la reparación del ADN y la síntesis del pigmento. De señalización Mc1r y AMPc inducen claramente los niveles de enzimas y la producción de pigmento eumelanina. Cuando la señalización Mc1r está intacto y los niveles de cAMP melanocíticos son robustos, la eumelanina se produce y la piel se oscurece. Sin embargo, si la señalización Mc1r es defectuoso yniveles de cAMP citoplasmáticos siguen siendo bajos, la feomelanina se produce en lugar ^{de 1.} Síntesis de eumelanina se puede estimular farmacológicamente por los agentes que elevan los niveles de cAMP ^1,14,31-35.

Dado que la proteína Mc1r es un importante regulador de riesgo de melanoma en humanos ^36-46, estamos interesados ​​en los mecanismos por los cuales Mc1r protege melanocitos contra la carcinogénesis inducida por UV. Como base para nuestros estudios, hemos generado un modelo murino Mc1r variante transgénica en una pura C57BL / 6 antecedentes genéticos ^1. En este modelo, factor de células madre (SCF) se expresa constitutivamente en la epidermis basal y epidérmicas melanocitos interfollicular se retienen en la piel durante toda la vida ^47, en contraste con los ratones no transgénicos en los que los melanocitos se localizan en la dermis en los folículos pilosos. Con el transgén K14-Scf incorporada, la epidermis se vuelve pigmenta con la característica de pigmentos de melanina en particular del pigmentocepa del animal ^1. ratones K14-Scf en el fondo genético C57BL / 6 con el tipo salvaje señalización Mc1r tiene la piel de color negro azabache que se caracteriza por niveles muy altos de pigmento eumelanina. No es sorprendente que estos animales son altamente resistente a rayos UV. En contraste, genéticamente compatibles K14-Scf C57BL / 6 animales que albergan un mutante inactivo Mc1r casi no tienen eumelanina en la epidermis. En cambio, estos animales "extensión" (Mc1r ^{e / e)} tienen una tez de piel blanca causada por el depósito de pigmento feomelanina (Figura 1A) y son mucho más sensibles a la radiación ^UV-48-49.

Compuestos farmacológicos con propiedades químicas que permiten la penetración en la piel han demostrado inducir potentemente eumelanina en la extensión (Mc1r ^{E / E)} modelo animal K14 SCF por la manipulación directa de los niveles de cAMP en los melanocitos epidérmicos en la piel. La regulación positiva de melanina en este modelo ha sido reported por la activación de la adenilato ciclasa ^1, así como la inhibición de la fosfodiesterasa 4 ^35. En este artículo, se demuestra la preparación y aplicación tópica de forskolina en extensión (Mc1r ^{e / e)} animales K14-Scf qué modelo de lo humano-UV sensible de piel clara. Se demuestra que la aplicación dos veces al día del medicamento promueve melanización acelerado, este oscurecimiento de la piel es debido a la deposición epidérmica de pigmento de melanina y que la melanina epidérmica inducida protege contra las quemaduras solares inducidas por UV a través de la medición de la "dosis mínima eritematosa" (MED) ^48.

Protocolo

1. Preparación de forskolina para la administración tópica de un extracto de la raíz cruda de la planta Plectranthus barbatus (Cohleus forskohlii)

1. Los protocolos para experimentos murinos siguen las pautas de conducta ética en el cuidado y uso de animales y fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales institucional y Uso de la Universidad de Kentucky (Protocolo # 00768M2004). El extracto de raíz se compone en peso 40% / volumen en una base dermatológica estándar de etanol al 70%, 30% de glicol de propileno.
2. Pesar 200 g de extracto de raíz de forskolina crudo y transferirla a un vaso de precipitados. Para hacer 500 ml de un 40% (w / v) de solución, volver a suspender 200 g de extracto de raíz de forskolina crudo mediante la adición de la mayoría, pero no todo el volumen del vehículo (etanol 70%, 30% de glicol de propileno) y llevar la solución a aproximadamente 450 ml.
3. Se agita durante una hora a temperatura ambiente. La solución será algo viscoso y puede requerir agitación manual para "levantar" el extracto en solución antes dela barra de agitación es capaz de tomar el relevo.
4. Después de una hora de agitación, se vierte la mezcla en un cilindro graduado y llevar el volumen a 500 ml utilizando vehículo que ha sido utilizado para "enjuagar" el vaso de precipitados que se usó para agitar la suspensión (para maximizar la recuperación de forskolina del vaso de precipitados) .
5. Transferir la suspensión a 50 ml de tubos de centrífuga de polipropileno. Se centrifuga (1.500 xg, la temperatura ambiente, 15 min), utilizando una centrífuga de mesa. En este punto, el material insoluble será bastante compactado, permitiendo que el sobrenadante sea fácilmente por vertido.
6. Filtrar la solución a través de una membrana de acetato de celulosa de 0,22 micras para eliminar cualquier material insoluble residual a partir del extracto. Nosotros utilizamos un sistema de botella de la parte superior diseñada para el cultivo celular, junto con el uso de pre-filtros que vienen con la unidad para evitar la obstrucción prematura de la membrana a partir de componentes insolubles del extracto de la raíz. Al hacer grandes volúmenes de extracto, aproximadamente 100 ml de filtrado a la vez, el cambio de la apuesta pre-filtroween cada volumen añadido.
7. Cuando se almacena a temperatura ambiente, el extracto mantiene la actividad biológica hasta para un máximo de un año.

2. Preparación de C57Bl / 6 K14-Scf Ratones para Tratamientos tópicos

1. Retire la piel dorsal de los animales por cizallamiento eléctrica. Brevemente anestesiar a los animales con isoflurano inhalado para facilitar la esquila de la piel dorsal con cizallas eléctricas equipadas con un cabezal de preparación quirúrgica de 0,25 mm (Fisher Scientific). Preferentemente utilice sólo un tipo de anestesia (por ejemplo, la ketamina / xilazina) para minimizar el riesgo de una sobredosis de anestesia. La cámara de inhalación saturada lleva riesgos laborales cuando se utiliza fuera una campana de extracción y entrega cantidades desconocidas de anestesia a los animales. Lo ideal sería que un vaporizador de precisión se debe utilizar.
2. Para quitar el rastrojo de pelo residual, tratar a los animales con un depilatorio químico. Administrar anestesia al animal con una inyección ip de ketamina 40 mg / kg de xilazina y 4 mg / kg
3. Una vez que los animales son anestesiados adecuadamente (a juzgar por la pizca dedo del pie), aplique una cantidad del tamaño de la yema del dedo de la crema depilatoria a la piel dorsal cortado usando un dedo enguantado. Frote la crema sobre la piel durante 30 a 60 segundos o hasta que los pelos se pueden ver claramente en la crema, ya que se mueve alrededor. Deje la crema en sólo por la cantidad mínima de tiempo que se requiere para la depilación como la exposición prolongada conduce a quemaduras químicas en la piel, la ruptura de la epidermis y la muerte por la pérdida de la integridad de la epidermis.
4. Limpie la piel dorsal con gasas empapadas de agua varias veces hasta que toda la crema se ha eliminado. Animales secos utilizando toallas de papel suave, y permitir que se recuperen en un lugar aislado en caliente (por ejemplo, jaulas limpias colocan en una almohadilla de calentamiento). Depilar los animales de uno en uno y vigilar de cerca durante todo el procedimiento.

3. La administración tópica de forskolina o de control del vehículo

1. Los animales deben ser tratados uno a la vez. Brevemente anestesiar con inhalard isoflurano colocando el ratón encima de un nylon filtro permeable al aire en formularios provistos bajo el cual se ha colocado una toalla de papel isoflurano-saturada en un frasco de vidrio con tapa transparente isoflurano-saturada en una campana de humos. Exponer el ratón para isoflurano durante un tiempo suficiente como para suprimir los movimientos musculares voluntarios pero para preservar la respiración espontánea (típicamente 10-20 seg). Saliendo del animal en el isoflurano demasiado tiempo dará lugar a la supresión respiratoria y muerte. Es mejor errar en el lado de "ir la luz" y tener que volver a exponer el ratón brevemente para más isoflurano en lugar de a la sobre-exponer al animal a la muerte de drogas y el riesgo.
2. Retire el animal de la cámara de isoflurano y colocar en un bloc banco absorbente limpio.
3. Utilizando una micropipeta 1000 l equipado con una punta desechable de polipropileno, elaborar 400 l de extracto crudo forskolina 40% (animales de control de vehículos recibirán etanol al 70%, el 30% de propilenglicol solo).
4. Transferir el extracto sobre lalomo del animal por goteo que sobre la piel y, a continuación, usando el lado de la punta de pipeta, manchar el extracto sobre la piel dorsal hasta que toda la piel ha sido cubierto. No hay necesidad de secar la piel después de la aplicación.
5. Devuelva el ratón a su jaula, y observar con cuidado hasta que se recupere de la anestesia.
6. Con el fin de que los efectos de cAMP no pigmentos no deben confundir a experimentos de sensibilidad UV, deje todos los tratamientos tópicos 2 días antes de la exposición UV (pigmento de efecto dura varios días más allá del último tratamiento tópico).

4. Piel de medición del color por Reflective Colorimetría

1. Brevemente anestesiar al ratón con isoflurano inhalado (véase más arriba).
2. Calibrar un colorímetro Minolta colocando la cabeza portátil en la superficie blanca estandarizada proporcionada con el colorímetro.
3. Coloque el cabezal de medición portátil de la descarga colorímetro con la piel dorsal del animal asegurando que la apertur ronda 1 ^cm2e está completamente presionado sobre la piel. Tome al menos tres mediciones separadas en diferentes áreas de la piel dorsal.
4. Calcula media L * Partitura ± SD por animal y por grupo de tratamiento. Colorimetría reflectante se puede hacer en cualquier punto en el experimento.

5. Determinación de la sensibilidad UV mediante el cálculo de "Mínimo eritematosa Dose" (MED)

1. Utilice los animales que han sido pre-tratadas con vehículo o forskolina como se describió anteriormente. Anestesie animales con inyección intraperitoneal de una mezcla estándar de ketamina y xilazina (véase más arriba).
2. Prepare un trozo de cinta-UV oclusiva para las pruebas de MED. Para generar agujeros en la cinta, utilice una perforadora de alta resistencia con un recorte circular de 1 cm ² (Figuras 2A y B). Tener orificios de un tamaño definido y la disposición simétrica de la cinta facilita el reconocimiento de los cambios en la piel después de la irradiación. Sobre cada agujero en la cinta, aplique una pequeña pero fácilmente desmontable pieza de cinta que se puede quitar en momentos definidos durante la exposición UV para permitir la administración de diferentes dosis de UV.
3. Una vez que el animal está sedado adecuadamente, coloque la cinta en la superficie dorsal. Lubricante de ojos siempre se debe utilizar bajo anestesia.
4. Encienda la fuente de UV consiste en dos Westinghouse F15T8UV-B lámparas con una potencia máxima de 313 nm y un rango de 280-370 nm. Deje que la lámpara se equilibre a una salida de UV constante, medida por un fotómetro UV con un sensor de UVB (generalmente toma unos pocos minutos para las lámparas para calentar).
5. Sobre la base de la tasa de transmisión de luz UV tal como se mide por el fotómetro UV, calcular el tiempo de exposición UV para cada dosis deseada. Por ejemplo, las medidas de producción de UVB de nuestra lámpara de 2,4 mW / cm ^2. Por lo tanto, para administrar 5 kJ / m ^2, tendría que ser expuesto a 208 seg (que es 3 min y 28 seg) de la radiación UVB, tal como se calcula por debajo de la piel:
   upload/50670/50670eq1.jpg "/>
6. Coloca los animales sedados (cada uno con cinta oclusiva en su lugar) ventral superficie hacia abajo para asegurar una visibilidad aún UV. Para administrar las dosis escogidas de la radiación UV, eliminar secuencialmente las pequeñas cintas oclusivos que cubren los agujeros para exponer 1 cm ² zonas de la piel a las dosis correctas de la radiación. Por lo tanto, usando el ejemplo anterior, si 40 kJ / m ² es la dosis más grande en el experimento, entonces el animal estaría bajo la lámpara durante 27 min y 47 seg total y la piel en la condición de 40 kJ / m ² no tendría ningún cinta que recubre todo el tiempo. Sin embargo, la cinta que recubre la condición 5 kJ / m ² sería eliminado cuando hay 208 seg restante en la exposición. Momento de la eliminación de la cinta se debe hacer de manera que cada condición termina simultáneamente.
7. Después de la exposición UV, despegue la cinta adhesiva de la piel dorsal con cuidado, con cuidado de no rasgar la piel con movimientos bruscos o excesivamente contundentes. Coloque los animales en un lugar cálido tranquilo para permitirrecuperación de la anestesia.
8. Monitorear ratones durante 24-48 h para buscar áreas discretas de eritema (enrojecimiento) o edema (hinchazón) que corresponde a los sitios anatómicos expuestos a la dosis específica de radiación UV. Documentar los hallazgos cutáneos fotográficamente.
9. Valor MED corresponde a la dosis mínima de rayos UV que causa la inflamación tal como se define por eritema y / o edema de todo el círculo de la piel expuesta. Tenga en cuenta que la pigmentación de la piel puede impugnar la determinación del MED, sin embargo, eritema y edema todavía pueden generalmente ser evaluados con precisión, gracias en parte a la forma definida de las aberturas en la cinta durante la exposición UV.

6. Análisis estadístico

Analizar los datos entre las cohortes de ratones mediante ANOVA de una vía con post test de Bonferroni (Graph Pad PRISM). Valores de p <0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

Resultados

C57BL / 6 ratones fueron generados sobre fondos eumelanotic, pheomelanotic o amelanóticos que incorporan el transgén K14 SCF tal como se describe (Figura 1A). Cohortes de extensión de piel clara (Mc1r ^{E / E, + / +} Tyr) los ratones se trataron tópicamente con dosis dos veces al día de vehículo (etanol 70%, 30% de glicol de propileno) o 40% de extracto de raíz de Coleus forskohlii crudo (80 micras por dosis) durante 5 días (Figura 2 B). Efectos de los ...

Discusión

Usando un modelo animal de la humana de piel clara, nos encontramos con que la aplicación tópica de un extracto de la raíz cruda forskolina ricos oscurece robustamente la epidermis estimulando la producción de melanina en la piel. Melanización epidérmico es dependiente de la expresión de factor de células madre en la epidermis basal, como ocurre en la piel humana pero no en la piel sin modificar genéticamente-ratón. La piel dorsal de los ratones genéticamente-no modificada carece de un número suficiente de m...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Coleus Forskoli extract 20%	Buckton Scott USA Inc.	n/a	Princeton, NJ
Isothesia, Isoflurane , USP	Butler Schein	NCD 11695-6776-1	Dublin, OH, USA
Xylazine	Anased Injection	LA04612	Shenandoah, Iowa, USA
Ketamine HCl, USP	Putney	NDC 26637-411-01	St. Joseph, MO, USA
Ethanol	Decon Labs.	2705
Propylene glycol	Adesco	05751L	Solon, OH, USA
Depilatory cream, Nair	Church Dwight	JF-11 4381322	Priceton, NJ
EQUIPMENT
Germicidal Hg Lamp UV-B	Westinghouse	F15T8UV-B
Radiometer photometer	International light	1LT400A	Peabody, MA,USA
Chromameter	Konica Minolta	CR-400	Ramsey, NJ, USA
Data Processor for Chromameter CR-400	Konica Monilta	DR-400	Ramsey, NJ, USA