ヒト化マウスモデルにおける表皮のメラニンと保護に対する日焼け薬理学的誘導

要約

表皮のメラニンは、色白の紫外線感受性人間のマウスモデルにおいてフォルスコリンの局所適用によって誘導される。最小紅斑量（MED）アッセイによって測定されるように強く、UV媒介炎症（日焼け）から保護暗く、皮膚および表皮におけるcAMPレベルの薬理学的操作。

要約

皮膚、紫外線感度と皮膚がんリスクの公平性のすべてがメラノコルチン1受容体の生理的機能、メラニン細胞の表面に見られるG _s共役シグナル伝達タンパク質と相関する。 MC1Rは、順番に、皮膚のメラノサイトにおけるメラニン産生をアップレギュレートする、アデニリルシクラーゼおよびcAMP産生を刺激する。 MC1RシグナリングはUV損傷から皮膚を保護するメカニズムを研究するために、この研究は、幹細胞因子（SCF）の表皮の発現に基づいて「ヒト皮膚」のマウスモデルに依存している。K14-SCFトランスジェニックマウスにおけるメラノサイトを保持する表皮したがって、表皮メラニンを堆積させる能力を有する。この動物モデルにおいては、黒色メラニン顔料とUV-保護された表現型の強固な堆積野生型MC1R状態をもたらす。これとは対照的に、欠陥のMC1Rのシグナリング能力の展示ブロンド/赤色素沈着、皮膚にはほとんどユーメラニンとしたK14-SCF動物紫外線感受性表現。ユーメラニン沈着がMC1Rシグナリングを模倣する局所薬によって強化されるかもしれない推論は、MC1R良品色白のマウスの皮膚へのフォルス抽出物の直接的なアプリケーションが堅牢なユーメラニン誘導およびUVプロテクト¹をもたらしたことがわかった。ここでは、K14-SCF色白のマウスにフォルスコリン含有天然根抽出物を調製し、適用するための方法を記載し、最小紅斑量（MED）を決定することによりUV感受性を測定する方法を報告している。この動物モデルを使用して、皮膚の表皮cAMP誘導及びメラニンは、UV照射への生理学的応答にどのように影響するかを研究することが可能である。

概要

黒色腫の発生率は、皮膚癌の最も致命的な形は、特に色白の人々の間で、米国では過去数十年の間に劇的に増加している。強い分子および疫学的証拠が主要な原因環境要因^2-5として紫外線を関与。太陽への露出や日焼けベッドの使用の形で増加UV露光は、メラノーマの発生率^6-7の増加の大部分の原因であると思われる。メラノーマのリスクは、特に日焼け^8、生活^9月10日の早い特にとリンクしそうです。日焼けのリスクは投与量とUV曝露の強度だけでなく、UV放射への皮膚の応答に影響を与える要因によって継承するだけでなく、連結されている。皮膚の色素沈着は、紫外線感受性の最も重要な決定要因の1、日焼けや癌のリスクのリスクである。メラノーマは、浅黒い肌individuaに比べて色白の人ではおよそ20倍も頻繁に発生しますLS ^11月13日 。

メラニン、表皮内のメラニン細胞によって製造される顔料は、肌の血色の主な決定要因である。 （1）ユーメラニン、紫外線のエネルギーを吸収するのに効果的で濃い褐色/黒色顔料、および（2）フェオメラニン、皮膚に紫外線光子の浸透を防止するのに効果が低い赤みがかっ/ブロンド顔料：メラニンは、2つの主要な種類が付属しています。皮膚の色、UV感度および黒色腫のリスクは、主に表皮メラニン含有量^14〜15によって決定される。表皮内のより多くのユーメラニンは、少ないUV光子は、皮膚に浸透することができます。なぜならユーメラニンの低生来のレベルで、色白の人々は、はるかに受けやすい紫外線照射^16〜18の急性および慢性の影響にある。

皮膚の色素沈着、メラノーマリスクとは"日焼け" UV露光した後、すべてのメラノコルチン1受容体（MC1R）のシグナル伝達能力と相関、G _s共役7膜貫通能力メラノサイト^19〜22にurface受容体。 MC1Rがその同族高親和性リガンド、α-メラノサイト刺激ホルモン（α-MSH）を結合すると、二次メッセンジャーcAMPの²³のアデニル酸シクラーゼと生産の活性化があります。紫外線照射後の皮膚の正常な生理学的応答はケラチノサイト^24〜29によるα-MSHの表皮の生産が含まれています。我等は、ケラチノサイト由来のα-MSHはアデニル酸シクラーゼ³⁰の活性化を介したcAMPセカンドメッセンジャーの下流の生産を開始し、表皮のメラニン細胞にMC1Rと結合すると仮定した。 cAMPレベルは、生存経路、DNA修復および顔料合成を含むメラニン細胞分化の多くの局面を制御する。 MC1RおよびcAMPシグナルは、明らかに顔料酵素レベルおよびユーメラニン産生を誘導する。 MC1Rシグナリングが損なわれていないとメラニン細胞cAMPレベルが強固である場合には、ユーメラニンが生成され、肌が暗くされる。しかしながら、MC1Rシグナル伝達に欠陥がある場合と細胞質内cAMPレベルが低いままで、フェオメラニンの代わりに¹が生成される。ユーメラニン合成は、cAMPレベル^を上昇させる^1,14,31-35薬剤によって薬理学的に刺激することができる。

MC1Rタンパク質がヒト^36〜46内の黒色腫のリスクの主要な調節因子であることから、我々はMC1RがUV誘導発癌に対するメラノサイトを保護するメカニズムに興味を持っています。我々の研究の基盤として、我々は純粋なC57BL / 6の遺伝的背景¹にジェニックMC1R変異マウスモデルを生成した。このモデルでは、幹細胞因子（SCF）は、構成的に基底表皮で発現され、表皮メラニン細胞濾胞は毛包真皮内に局在メラノサイトする非トランスジェニックマウスとは対照的に、生命⁴⁷を通じて皮膚に保持される。 K14-SCF導入遺伝子が組み込まれて、表皮は顔料の特徴的な特定のメラニン色素で着色になる動物¹の株は野生型MC1Rシグナル伝達を有するC57BL / 6の遺伝的背景にK14-SCFマウスは漆黒の肌はメラニン色素の非常に高いレベルを特徴としている。当然のことながら、これらの動物は非常に紫外線抵抗力がある。これとは対照的に、変異型非アクティブMC1Rを抱い遺伝的に一致したK14-SCF C57BL / 6の動物は、表皮にはほとんどユーメラニンがありません。その代わりに、これらの「 拡張子 」動物（MC1Rの^{E / E）は}フェオメラニン色素（ 図1A）の析出による美肌顔色を持っており、多くの紫外線感受性^48-49です。

皮膚への浸透を可能にする化学的性質を有する薬理学的化合物は、強力に直接皮膚に表皮メラノサイトにおいてcAMPレベルを操作することにより伸長（MC1R ^{E / E）K14-SCF}の動物モデルにおいてユーメラニンを誘導することが示されている。このモデルのメラニンアップレギュレーションはRでしたアデニル酸シクラーゼの活性化¹だけでなく、ホスホジエステラーゼ4阻害³⁵でeported。この記事では、 拡張子（MC1Rの^{E / E）、K14-SCF}動物モデル色白の紫外線感受性ヒトにおける準備とフォルスの局所適用を実証する。我々は、薬物の一日二回アプリケーションは、加速されたメラニン化を促進すること、皮膚の黒ずみはメラニン色素の表皮堆積によるもので、その誘導された表皮のメラニンが「最小紅斑線量^{」（MED）48}を測定することにより紫外線による日焼けから保護することを示している。

プロトコル

1。 プレクトランサスbarbatus（Cohleusフォルス）植物の粗根エキスから局所投与のためのフォルスコリンの調製

1. ネズミの実験のためのプロトコルは、動物の管理と使用における倫理的な行動のためのガイドラインに従い、ケンタッキー大学の施設内動物管理使用委員会（プロトコール＃00768M2004）によって承認された。根抽出物は、70％エタノール、30％プロピレングリコールを標準皮膚科学的塩基中の40％重量/容量で構成されている。
2. 原油フォルス根エキスの200グラムを計量してビーカーに移す。 40％（w / v）の溶液500mlを作るために、車両のボリュームのすべて（70％エタノール、30％プロピレングリコール）との溶液をもたらすことはないがほとんどを添加することにより、粗フォルス根抽出物200gを再懸濁およそ450ミリリットル。
3. 室温で1時間撹拌した。解決策は、やや粘性になり、前に溶液中に「リフト」抽出物に、手動の攪拌が必要な場合があります撹拌棒を引き継ぐことができます。
4. 1時間撹拌した後、メスシリンダーに混合物を注ぎ、（ビーカーからフォルスコリンの回収を最大にする）のスラリーを攪拌するために使用したビーカーを「すすぐ」するために使用されている車両を用いて500mlに体積を。
5. 50ミリリットルのポリプロピレン遠心管にスラリーを転送します。卓上遠心分離機を用いて遠心分離（1500×gで、室温、15分）。この時点で、不溶物を上清が容易に注ぐことができるように、かなり圧縮されたであろう。
6. 抽出物から残留不溶性物質を除去するために0.22μmの酢酸セルロース膜を通して溶液を濾過する。私たちは、根抽出物の不溶性成分からの膜の早期目詰まりを防ぐために、ユニットに付属しているプレフィルタの使用に伴い、細胞培養用に設計されたボトルトップ·システムを使用しています。抽出物を大量に製造する場合には、一度におよそ100mlとフィルタリングし、プレフィルタベットを変更する追加された各ボリュームをWEEN。
7. 室温で保存した場合、抽出液には、最大1年間の生物学的活動を維持しています。

2。局所治療のためのC57BL / 6 K14-SCFマウスの作製

1. 電気剪断によって動物から背側の毛皮を削除します。簡単に言うと0.25ミリメートルの手術の準備ヘッド（フィッシャー·サイエンティフィック）を装備した電気ばさみで背の毛皮のせん断を容易にするために、吸入イソフルランで動物を麻酔。好ましくはただの麻酔過剰摂取の危険性を最小限に抑えるために麻酔の1種類（ 例えば 、ケタミン/キシラジン）を使用します。飽和吸入チャンバーは、ヒュームフード以外に使用される職業上の危険を運び、動物に麻酔薬の未知の量を提供します。理想的には精密気化器を使用する必要があります。
2. 残留毛刈り株を削除するには、化学的な脱毛で動物を扱う。ケタミン40 mg / kgのキシラジンおよび4 mg / kgを腹腔内注射して動物に麻酔を投与し
3. （つま先のピンチによって判断されるように）動物を適切に麻酔をかけた後、手袋をはめた指を使用して剪断背部皮膚に脱毛クリームの指先サイズの額を適用します。 30〜60秒またはそれが周りに移動されているように、毛髪は、明らかにクリーム中に見ることができるまで、皮膚内にクリームをこする。長時間の暴露が、表皮の完全性の損失から皮膚の化学的燃焼、表皮破壊や死に至るように毛の除去に必要な最小限の時間だけでクリームを残す。
4. すべてのクリームが除去されるまで、繰り返し水に浸したガーゼパッドで背部皮膚を拭きます。乾いた柔らかい紙タオルを使用して動物、およびそれらを暖かい静かな場所（温暖化パッド上に置い例えばクリーンケージ）で回復することができます。 1つずつの動物を脱毛し、プロシージャ全体で密接に監視します。

3。フォルスコリンまたは車両制御の局所投与

1. 動物は、一度に1を処理する必要があります。簡単に言えば吸入で麻酔下のフォームフィットナイロン通気性フィルターの上にマウスを置くことによってDイソフルランは、ヒュームフード内イソフルラン飽和蓋付き透明なガラスジャーにイソフルラン飽和のペーパータオルを置いてきた。自主的な筋肉の動きを抑制するしか自発呼吸（通常は10から20秒）保存するように十分な時間、イソフルランにマウスを公開します。長すぎるイソフルランで動物を残すことは、呼吸抑制や死をもたらすでしょう。それは、 "光を行く」と薬物やリスク死に動物をさらすオーバーよりイソフルランではなく、を簡単にマウスを再公開することのに越した方が良い。
2. イソフルランチャンバーから動物を削除し、クリーンな吸収性ベンチパッドの上に置きます。
3. 使い捨てのポリプロピレン先端装備千μlのマイクロピペット、40％の粗フォルス抽出物400μLを策定の使用（車両制御動物は、70％エタノール、単独の30％プロピレングリコールを受信します）。
4. 上にエキスを転送すべての肌がカバーされるまで、バック動物の皮膚の上に滴下することにより、その後は、ピペットチップの側面を使用して、背側皮膚上エキスを汚す。塗布後の肌にブロットする必要はない。
5. そのケージにマウスを返し、それが麻酔から回復するまで、慎重に観察します。
6. 非顔料cAMPの効果は、UV感度実験を混乱べきではないことには、UV露光（顔料効果が最後の局所治療を超えて、数日間持続する）と2日前までに、すべての局所治療を中止してください。

4。反射型比色法の色の測定スキン

1. 簡単に言うと（上記参照）吸入イソフルランでマウスを麻酔。
2. 比色計を備えた標準化された白い表面にポータブルヘッドを配置することによって、ミノルタ比色計を校正します。
3. 確実に動物の背部皮膚を比色計フラッシュのポータブル測定ヘッドを配置することを1cm ^2のラウンドapertureは完全に皮膚に押し付けられる。背部皮膚の異なる領域に、少なくとも3つの別々の測定を行う。
4. 動物あたりと治療群ごとの平均値±SDのL *スコアを計算する。反射測色は、実験の任意の時点で行うことができる。

5。 「最小紅斑線量」（MED）を計算することにより、UV感度の定量

1. 上述したように、車両又はフォルスコリンのいずれかで前処理された動物を使用する。ケタミンおよびキシラジン（上記参照）の標準混合物の腹腔内注射で動物を麻酔。
2. MEDテストのためのUV閉塞テープ片を準備します。テープの穴を生成するには、1cm ^2の円形の切り欠き部（ 図2AおよびB）との大型穴パンチを使用しています。テープで定義されたサイズおよび配置の対称孔を有する照射後の皮膚変化の認識を容易にする。テープ内の各穴の上、小さいながらも簡単に取り外し可能な部分を適用異なるUV線量の投与を可能にするためにUV露光中に定義された時点で除去することができるテープ。
3. 動物を適切に鎮静されると、背面にテープを配置。目の潤滑剤は常に麻酔下で利用されるべきである。
4. 2ウェスティングハウスF15T8UV-Bの313ナノメートルのピーク出力を有するランプと280から370ナノメートルの範囲からなるUV源をオンにします。 （一般的にはウォームアップランプの数分かかります）、UVBセンサー付のUV光度計によって測定されたランプが一定のUV出力に平衡することができます。
5. UV光度計によって測定されたUV透過率に基づいて、各々所望の用量のためのUV照射時間を算出する。例えば、私たちのランプのUVB出力措置2.4 MW / cm ²で^ある 。したがって、5 kJの/ m ^2で投与する、皮膚は、以下のように計算された、UVB放射線の（3分28秒）で208秒に露出される必要があるであろう。
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6. 腹さえ紫外線曝露を確実にするために面を下鎮静動物（閉塞性テープでそれぞれの場所で）を配置します。紫外線放射の選択された用量を投与するために、順次、放射線の正しい投与量に対する皮膚の1cm ^2の領域を露出するための穴をカバーする小型の閉塞性のテープを取り外します。 40 KJ / m ^2を、実験で最大用量であるしたがって、上記の例を使用して、その後、動物は無いだろう40 KJ / m ^2に状態の27分47秒の合計および皮膚のランプの下になりますテープの全体の時間の上にある。露光中に残っている208秒があった場合しかし、5 kJの/ m ^2の条件を覆うテープが除去される。各条件が同時に終了するようにテープ除去のタイミングは行われるべきである。
7. UV露光した後、突然、または過度に力強い動きで皮膚をリッピングしないように注意しながら、慎重に背部皮膚からテープをはがし。できるように、暖かい静かな場所に動物を配置麻酔からの回復。
8. UV照射の具体的な用量にさらさ解剖学的部位に対応した（腫脹）紅斑（赤み）や浮腫の目立たない領域を探すために24〜48時間のためにマウスを監視します。写真的に皮膚所見を文書化します。
9. MED値は、紅斑および/または皮膚の全露出円の浮腫によって定義されるような炎症を引き起こすUV線量の最小値に相当する。皮膚の色素沈着は、MEDの決定に挑戦することもできますが、紅斑および浮腫は、まだ一般的には正確には、部分的にはUV露光中にテープの開口の規定された形状のおかげで評価することができる。

6。統計分析

ボンフェローニポストテスト（グラフパッドPRISM）を一元配置分散分析によりマウスのコホート間でデータを分析します。p値 <0.05を統計的に有意であると考えている。

結果

C57BL / 6マウスを、記載（ 図1A）のようなK14-SCF導入遺伝子を組み込んだ、eumelanotic pheomelanotic又はメラニン欠乏背景上に生成した。色白の延長（MC1R ^{E / E、Tyr}の^{+ / +）}マウスのコホート車両（70％エタノール、30％プロピレングリコール）または40％の粗コリウスフォルス根エキスのどちらか1日2回投与で局所的に処理した（801μmあたり5日間（

ディスカッション

色白の人間の動物モデルを用いて、フォルスコリンが豊富な原油根抽出物の局所適用は堅牢に皮膚にメラニン産生を刺激することにより、表皮を暗くことがわかります。人間の皮膚ではなく、遺伝的に変更されていないマウスの皮膚で​​起こるような表皮メラニンは、基底表皮幹細胞因子の発現に依存している。遺伝的に変更されていないマウスの背部の皮膚は、皮膚に色素を付与するた?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Coleus Forskoli extract 20%	Buckton Scott USA Inc.	n/a	Princeton, NJ
Isothesia, Isoflurane , USP	Butler Schein	NCD 11695-6776-1	Dublin, OH, USA
Xylazine	Anased Injection	LA04612	Shenandoah, Iowa, USA
Ketamine HCl, USP	Putney	NDC 26637-411-01	St. Joseph, MO, USA
Ethanol	Decon Labs.	2705
Propylene glycol	Adesco	05751L	Solon, OH, USA
Depilatory cream, Nair	Church Dwight	JF-11 4381322	Priceton, NJ
EQUIPMENT
Germicidal Hg Lamp UV-B	Westinghouse	F15T8UV-B
Radiometer photometer	International light	1LT400A	Peabody, MA,USA
Chromameter	Konica Minolta	CR-400	Ramsey, NJ, USA
Data Processor for Chromameter CR-400	Konica Monilta	DR-400	Ramsey, NJ, USA