A indução farmacológica de melanina epidérmica e proteção contra queimaduras solares em um modelo humanizado Rato

Resumo

Melanina epidérmica é induzida pela aplicação tópica de forscolina em um modelo murino da humano sensível aos raios UV de pele clara. Manipulação farmacológica de níveis de cAMP na pele e escurecimento da epiderme proteger fortemente contra a inflamação mediada por UV (queimadura solar), como medido pela dose eritematosa mínima (DEM) de ensaio.

Resumo

Equidade de pele, a sensibilidade de UV e o risco de cancro da pele em correlação com a função fisiológica do receptor de melanocortina 1, uma proteína de sinalização G _s acoplados a encontrada na superfície de melanócitos. Mc1r estimula a adenilil-ciclase e a produção de cAMP, que, por sua vez, se regula a produção melanocítico da melanina na pele. Para estudar os mecanismos pelos quais a sinalização Mc1r protege a pele contra os danos UV, este estudo se baseia em um modelo de rato com "pele humanizado", baseado na expressão epidérmico do fator de células-tronco (SCF). Camundongos transgênicos K14-SCF reter melanócitos na epiderme e, por conseguinte, ter a capacidade de depósito de melanina na epiderme. Neste modelo animal, de tipo selvagem resulta num estado Mc1r de deposição robusta de pigmento eumelanina preta e um fenótipo UV-protegido. Em contraste, os animais K14-SCF com defeito sinalização Mc1r capacidade apresentam uma pigmentação vermelha / louro, muito pouco eumelanin na pele eum fenótipo sensível aos raios UV. Raciocínio que a deposição de eumelanina pode ser reforçada por agentes tópicos que imitam sinalização Mc1r, descobrimos que a aplicação direta do extrato forskolin na pele de camundongos de pele clara Mc1r-defeituoso resultou na indução eumelanin robusto e proteção UV ^1. Aqui nós descrevemos a metodologia de elaboração e aplicação de um extrato de raiz natural, contendo forskolin para K14-SCF camundongos de pele clara e relatar um método para medir a sensibilidade UV determinando a dose eritematosa mínima (DEM). Usando este modelo animal, é possível estudar como indução epidérmica cAMP e melanização da pele afetam respostas fisiológicas à exposição UV.

Introdução

A incidência de melanoma, a forma mais letal de câncer de pele, aumentou dramaticamente ao longo das últimas décadas nos Estados Unidos, principalmente entre os indivíduos de pele clara. Evidência molecular e epidemiológica forte implica radiação UV como um grande causador fator ambiental ^2-5. O aumento da exposição aos raios UV na forma de exposição ao sol e uso de bronzeamento artificial é provável que seja responsável por grande parte do aumento na incidência de melanoma ^6-7. O risco de melanoma parece particularmente ligada com queimaduras ^8, especialmente aqueles no início da vida ^9-10. Risco de queimadura solar está ligado não só com a dose e a intensidade de exposição à radiação UV, mas também por factores que influenciam a resposta herdadas cutânea à radiação UV. A pigmentação da pele é um dos mais importantes determinantes da sensibilidade UV, risco de queimaduras e risco de câncer. Melanoma ocorre cerca de vinte vezes mais freqüentemente em pessoas de pele clara em relação a individua pele escurals ^11-13.

A melanina, um pigmento produzido por melanócitos na epiderme, é o principal determinante da tez da pele. Melanina vem em duas variedades principais: (1) eumelanina, um marrom / preta pigmento escuro eficaz em absorver a energia da radiação UV, e (2) feomelanina, um avermelhado / louro pigmento menos eficaz na prevenção da penetração de fótons ultravioleta na pele. A cor da pele, sensibilidade à UV e risco de melanoma são em grande parte determinado pelo conteúdo epidérmico eumelanin ^14-15. O mais eumelanina na epiderme, os menos fotões UV pode penetrar na pele. Por causa de baixos níveis inatas de eumelanina, indivíduos de pele clara são muito mais propensos a efeitos agudos e crônicos da radiação UV ^16-18.

A pigmentação da pele, risco de melanoma e a capacidade de "bronzear" após exposição UV todos correlaciona com a capacidade de sinalização do receptor de melanocortina 1 (Mc1r), um G _s acoplados a sete transmembranar sreceptor urface em melanócitos ^19-22. Quando se liga Mc1r seu cognato ligando de alta afinidade, a hormona estimulante de melanócitos α-(α-MSH), que é a activação da adenilil-ciclase e a produção do segundo mensageiro AMPc ^23. A resposta fisiológica normal da pele após a exposição aos raios UV inclui a produção epidérmica de α-MSH por queratinócitos ^24-29. Nós e outros supor que derivado de queratinócito α-MSH liga-se a Mc1r em melanócitos epidérmicos, iniciando a produção a jusante do segundo mensageiro AMPc através de activação de adenililciclase ^30. os níveis de cAMP controlar vários aspectos da diferenciação dos melanócitos, incluindo as vias de sobrevivência, reparo do DNA e síntese de pigmentos. Sinalização Mc1r e Camp induzir claramente os níveis de enzimas de pigmentos e produção eumelanin. Quando sinalização Mc1r está intacto e os níveis de cAMP melanocíticos são robustos, eumelanin é produzida ea pele escurece. No entanto, se a sinalização Mc1r está com defeito eos níveis de cAMP citoplasmáticos permanecem baixas, pheomelanin é produzido em vez ^{de 1.} Síntese Eumelanin pode ser estimulada farmacologicamente por agentes que aumentam os níveis de AMPc ^1,14,31-35.

Uma vez que a proteína Mc1r é um grande regulador do risco de melanoma em humanos ^36-46, estamos interessados ​​em mecanismos pelos quais Mc1r protege melanócitos contra carcinogênese induzida por UV. Como base para os nossos estudos, geramos um modelo murino Mc1r variante transgênica em um C57BL / 6 genética fundo puro ^1. Neste modelo, o factor de células estaminais (SCF) é constitutivamente expressa na epiderme basal e melanócitos epidérmicos interfoliculares são retidos na pele ao longo da vida ^47, em contraste com os ratinhos não transgénicos, em que os melanócitos localizar a derme nos folículos do cabelo. Com o transgene K14-SCF incorporada, a epiderme fica pigmentado com a característica particular de pigmentos de melanina do pigmentoestirpe do animal ^1. camundongos K14-SCF no fundo C57BL / 6 genética com tipo selvagem sinalização Mc1r ter pele de azeviche caracterizada por níveis muito altos de eumelanina pigmento. Não surpreendentemente, esses animais são altamente resistentes UV-. Em contraste, geneticamente compatíveis K14-SCF animais C57BL / 6 que abrigam um mutante inactivo Mc1r não têm quase nenhuma eumelanina na epiderme. Em vez disso, esses animais "extensão" (Mc1r ^{E / E)} têm uma tez da pele justo causada pela deposição de pigmento feomelanina (Figura 1A) e são muito mais sensíveis ao UV ^48-49.

Compostos farmacológicos com propriedades químicas que permitem a penetração na pele têm sido mostrados para induzir potencialmente eumelanina na extensão (Mc1r ^{E / E)} modelo animal K14-SCF por manipulação directa dos níveis de cAMP nos melanócitos epidérmicos da pele. Upregulation melanina neste modelo foi reported através da activação da adenililciclase ^1, bem como a inibição da fosfodiesterase 4 ^35. Neste artigo, vamos demonstrar a preparação e aplicação tópica de forskolin em extensão (Mc1r ^{e / e)} animais K14-SCF qual o modelo que o ser humano sensível ao UV de pele clara. Mostra-se que a aplicação duas vezes por dia do medicamento promove melanização acelerado, que o escurecimento da pele é devido à deposição de melanina epidérmica e pigmento melanina epidérmica induzida que protege contra as queimaduras solares induzidas por UV por meio de medição de "dose eritematosa mínima" (MED) ^{de 48.}

Protocolo

1. Preparação de Forskolin para administração tópica de um extrato de raiz bruto da Usina Plectranthus barbatus (Cohleus forskohlii)

1. Protocolos para experimentos murino seguiu as diretrizes para a conduta ética no cuidado e uso de animais e foram aprovados pelo Comitê Institucional Animal Care e Use na Universidade de Kentucky (Protocolo n 00768M2004). O extracto de raiz é composta de 40% peso / volume, em uma base dermatológica padrão de 70% de etanol, 30% de propileno glicol.
2. Pesar 200 g de extrato de raiz de forskolin bruto e transferi-lo para um copo. Para fazer 500 ml de uma solução a 40% (w / v), ressuspender 200 g de extracto de raiz de forscolina em bruto por adição de mais, mas não todo o volume do veículo (etanol a 70%, 30% de propileno glicol) e levar a solução a cerca de 450 ml.
3. Agita-se durante uma hora à temperatura ambiente. A solução será um pouco viscosa e pode necessitar de agitação manual para "levantar" o extracto em solução antesa barra de agitação é capaz de assumir.
4. Após uma hora de agitação, verter a mistura em um cilindro graduado e levar o volume a 500 ml usando veículo que tem sido usada para "enxaguar" a proveta que foi usada para agitar a suspensão (para maximizar a recuperação de forscolina a partir da proveta) .
5. Transferência da suspensão de 50 ml de tubos de centrífuga de polipropileno. Centrífuga (1.500 x g, a temperatura ambiente, 15 min), usando uma centrífuga de mesa. Neste ponto, o material insolúvel vai ser bastante compacta, permitindo-se o sobrenadante para ser facilmente vertido.
6. Filtrar a solução através de uma membrana de acetato de celulose de 0,22 um para remover qualquer material insolúvel residual a partir do extracto. Usamos um sistema para frascos concebido para a cultura de células, juntamente com a utilização de pré-filtros, que vêm com o aparelho, para evitar coagulação prematura da membrana a partir de componentes insolúveis do extracto de raiz. Ao fazer grandes volumes de extracto, filtrar a cerca de 100 ml de cada vez, a alteração da aposta pré-filtroween cada volume adicionado.
7. Quando armazenada à temperatura ambiente, o extracto mantém actividade biológica durante até um ano.

2. Preparação de C57Bl / 6 K14-Scf Ratos para tratamentos tópicos

1. Retire a pele dorsal dos animais por corte elétrico. Resumidamente anestesiar os animais com isoflurano inalatório para facilitar corte de pele dorsal com tesouras elétricas equipadas com uma 0,25 milímetros cabeça de preparação cirúrgica (Fisher Scientific). De preferência, usar apenas um tipo de anestesia (por exemplo, cetamina / xilazina) para minimizar o risco de overdose de anestésico. A câmara de inalação saturado traz risco ocupacional quando usado fora de uma coifa e fornece quantidades desconhecidas de anestésico para animais. Idealmente, um vaporizador de precisão deve ser usado.
2. Para remover a palha residual cabelo, tratar os animais com um depilatório químico. Administrar anestesia para o animal com uma injecção ip de cetamina 40 mg / kg de xilazina e 4 mg / kg
3. Uma vez que os animais são devidamente anestesiados (a julgar pelo toe pitada), aplique uma quantidade dedo-sized de creme depilatório para a pele dorsal cortado usando um dedo de luva. Esfregue o creme na pele por 30-60 seg ou até que os cabelos podem ser claramente visto no creme como está sendo movimentados. Deixar o creme apenas para a quantidade de tempo mínima necessária para a remoção do cabelo como a exposição prolongada conduz a queima química da pele, desagregação epidérmica e morte causados ​​pela perda de integridade da epiderme.
4. Limpe a pele dorsal com compressas de gaze embebida em água repetidamente até que todos creme foi removido. Animais seque com toalhas de papel macio, e permitir-lhes recuperar em um local quente isolada (por exemplo, limpar gaiolas colocadas em uma almofada de aquecimento). Depilar os animais um a um e acompanhar de perto todo o procedimento.

3. A administração tópica de Forskolin ou controle do veículo

1. Os animais devem ser tratados um de cada vez. Resumidamente anestesiar com inspiraçãod isoflurano, colocando o mouse em cima de um filtro permeável ao ar nylon equipados de forma sob a qual foi colocada uma toalha de papel saturado de isoflurano em uma jarra de vidro com tampa clara saturado de isoflurano em uma coifa. Exponha o mouse para isoflurano durante o tempo suficiente como para suprimir movimentos musculares voluntários, mas para preservar a respiração espontânea (tipicamente 10-20 seg.) Deixar o animal em isoflurano muito tempo irá resultar em supressão respiratória e morte. É melhor errar do lado da "luz vai" e ter de voltar a expor o mouse rapidamente para mais isoflurano, em vez de sobre-expor o animal à morte de drogas e risco.
2. Retire o animal da câmara de isoflurano e coloque em uma almofada banco absorvente limpo.
3. Usando uma micropipeta de 1000 ul equipado com uma ponta descartável de polipropileno, chamar-se 400 ul de 40% de extracto de forscolina em bruto (animais de controlo de veículo irá receber 70% de etanol, 30% de propileno glicol por si só).
4. Transferir o extracto sobre odorso do animal por gotejamento que sobre a pele e, em seguida, utilizando-se o lado da ponta da pipeta, manchar o extracto sobre a pele dorsal até que toda a pele tenha sido coberta. Não há necessidade de apagar a pele após a aplicação.
5. Retorne o mouse para sua jaula, e observar cuidadosamente até que ele se recupera da anestesia.
6. A fim de que os efeitos não-cAMP pigmento não deve confundir experimentos de sensibilidade de UV, interromper todos os tratamentos tópicos 2 dias anteriores à exposição à radiação UV (pigmento de efeito dura vários dias além último tratamento tópico).

4. Pele de medição de cor por Reflective Colorimetria

1. Resumidamente anestesiar o mouse com isoflurano inalado (veja acima).
2. Calibrar um colorímetro Minolta, colocando a cabeça móvel sobre a superfície branca normalizadas fornecidas com o colorímetro.
3. Coloque a cabeça de medição portátil do colorímetro nivelada com a pele dorsal do animal garantindo que a rodada Apertur um centímetro ²e está completamente pressionado sobre a pele. Tome pelo menos três medidas distintas em diferentes áreas da pele dorsal.
4. Calcular média L pontuação * ± SD por animal e por grupo de tratamento. Colorimetria reflexiva pode ser feito em qualquer ponto do experimento.

5. Determinação da Sensibilidade UV por Cálculo de "Minimal eritematosa Dose" (MED)

1. Use animais que tenham sido pré-tratados com veículo ou forscolina como descrito acima. Anestesiar os animais com injecção intraperitoneal de uma mistura padrão de cetamina e xilazina (ver acima).
2. Prepare um pedaço de fita UV-oclusiva para o teste MED. Para gerar furos na fita, use um furador pesados ​​com um 1 cm ² recorte circular (Figuras 2A e B). Ter furos de um tamanho definido e disposição simétrica na fita facilita o reconhecimento de alterações na pele após a irradiação. Sobre cada buraco na fita, aplique um pedaço pequeno, mas facilmente destacável da fita que podem ser removidos em períodos definidos durante a exposição aos raios ultravioleta para permitir a administração de doses de UV diferentes.
3. Uma vez que os animais são adequadamente sedado, coloque a fita na superfície dorsal. Lubrificante ocular devem ser sempre utilizados sob anestesia.
4. Ligue a fonte de UV consistindo de dois Westinghouse F15T8UV-B lâmpadas com uma potência máxima de 313 nm e uma gama de 280-370 nm. Permita que a lâmpada atingir a uma saída de UV constante medida por um fotômetro UV com um sensor de UVB (geralmente leva alguns minutos para que as lâmpadas para aquecer).
5. Com base na taxa de transmissão de UV tal como medido pelo fotómetro UV, calcular o tempo de exposição à radiação UV, para cada dose desejada. Por exemplo, medidas de UVB saída do nosso lâmpada de 2,4 mW / cm ^2. Portanto, para administrar 5 kJ / m ^2, a pele que necessita de ser exposta a 208 segundos (o que é de 3 min e 28 seg) da radiação UVB, como calculado abaixo:
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6. Coloque os animais sedados (cada um com fita oclusivo no local) ventral superfície para baixo para garantir a exposição ainda UV. Para administrar as doses escolhidas de radiação UV, remover sequencialmente as pequenas fitas oclusivas que cobrem os orifícios para expor áreas ^de 1 cm2 de pele para as doses correctas de radiação. Assim, utilizando o exemplo acima, se 40 kJ / m ² é a maior dose na experiência, então o animal estaria sob a lâmpada de 27 min e 47 seg total e a pele no estado de 40 kJ / m ² não teria sobrepondo-se a fita o tempo todo. Entretanto, a fita se sobrepõe à condição 5 kJ / m ² seria removido quando não é de 208 seg restante da exposição. O tempo de remoção de fita deve ser feito para que cada condição termina simultaneamente.
7. Após a exposição UV, descolar a fita da pele dorsal com cuidado, tomando cuidado para não rasgar a pele com movimentos bruscos ou excessivamente fortes. Coloque os animais em um lugar calmo quente para permitirrecuperação da anestesia.
8. Monitorar ratinhos durante 24-48 horas a olhar para zonas discretas de eritema (vermelhidão) ou edema (inchaço) correspondente para os locais anatómicos expostos a uma dose específica de irradiação UV. Documente achados cutâneos fotograficamente.
9. MED valor corresponde à dose mínima de UV, que provoca a inflamação, tal como definido por eritema e / ou edema de todo o círculo de pele exposta. Note-se que a pigmentação da pele pode desafiar a determinação do MED, no entanto, eritema e edema ainda pode geralmente ser avaliada com precisão, graças em parte à forma definida das aberturas na fita durante a exposição UV.

6. Análise Estatística

Analisar dados entre grupos de ratos por um way ANOVA com pós-teste de Bonferroni (Graph Pad PRISM). Valores de p <0,05 são considerados estatisticamente significativos.

Resultados

C57BL / 6 machos foram gerados em fundos eumelanotic, pheomelanotic ou amelanóticos incorporando o transgene K14-SCF como descrito (Figura 1A). Coortes de extensão de pele clara (Mc1r ^{E / E,} Tyr ^{+ / +)} os ratos foram tratados topicamente com duas doses diárias de veículo (etanol a 70%, 30% de propileno glicol) ou 40% de extracto de raiz de Coleus forskohlii bruto (80 uM por a dose), durante 5 dias (Figura 2B). Efeitos dos tratamentos tópicos ...

Discussão

Usando um modelo animal do ser humano de pele clara, nós achamos que a aplicação tópica de um extrato bruto da raiz rica em forskolin robustamente escurece a epiderme, estimulando a produção de melanina na pele. Epidermal melanização é dependente da expressão do factor de células estaminais na epiderme basal, como ocorre na pele humana, mas não na pele de rato não modificado geneticamente. A pele dorsal de ratinhos geneticamente não modificada não tem um número suficiente de melanócitos interfoliculares...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Coleus Forskoli extract 20%	Buckton Scott USA Inc.	n/a	Princeton, NJ
Isothesia, Isoflurane , USP	Butler Schein	NCD 11695-6776-1	Dublin, OH, USA
Xylazine	Anased Injection	LA04612	Shenandoah, Iowa, USA
Ketamine HCl, USP	Putney	NDC 26637-411-01	St. Joseph, MO, USA
Ethanol	Decon Labs.	2705
Propylene glycol	Adesco	05751L	Solon, OH, USA
Depilatory cream, Nair	Church Dwight	JF-11 4381322	Priceton, NJ
EQUIPMENT
Germicidal Hg Lamp UV-B	Westinghouse	F15T8UV-B
Radiometer photometer	International light	1LT400A	Peabody, MA,USA
Chromameter	Konica Minolta	CR-400	Ramsey, NJ, USA
Data Processor for Chromameter CR-400	Konica Monilta	DR-400	Ramsey, NJ, USA