인간 답게 된 마우스 모델에서 표피 멜라닌 및 보호에 대하여 햇볕의 약물 유도

요약

표피의 멜라닌은 공정한 피부가 자외선에 민감한 인간의 쥐 모델 포스 콜린의 국소 응용 프로그램에 의해 유도된다. 최소 홍반 량 (MED) 분석에 의해 측정 된 강력한 UV-매개 성 염증 (자외선)으로부터 보호 어둡게 피부 표피에있는 캠프 수준의 약리학적인 조작.

초록

피부, UV 감도 및 피부 암 위험의 공정성 모두 멜라노 1 수용체의 생리 학적 기능, 멜라닌 세포의 표면에서 발견 _G의 결합 된 신호 전달 단백질과 연관. MC1R 차례로, 피부에 멜라닌의 멜라닌 생산을 상향 조절, 아데 닐 레이트 사이 클라 제와 캠프의 생산을 자극한다. MC1R 시그널링 UV 손상에 대하여 피부를 보호하는 메커니즘을 연구하기 위하여, 본 연구는 줄기 세포 인자 (SCF)의 표피 식에 근거 "인간화 피부"와 마우스 모델에 의존한다. K14-SCF 형질 전환 생쥐에서 멜라노 유지 따라서 표피는 표피 멜라닌을 증착 할 수있는 능력이있다. 이 동물 모델에서 검은 멜라닌 색소와 UV 보호 된 표현형의 강력한 증착 야생형 MC1R 상태의 결과. 반면, 결함 MC1R 신호 능력 전시 금발 / 레드 색소 침착, 피부에 약간의 유 멜라닌과 함께 K14-SCF 동물자외선에 민감한 표현형. 이 유 멜라닌 침착을 추론하는 것은 MC1R 신호를 모방 국소 요원에 의해 향상 될 수 있습니다, 우리는 MC1R 불량 공정한 피부 생쥐의 피부에 포르 스 콜린 추출물 직접 응용 프로그램이 강력한 멜라닌 유도 및 UV 보호 ^한 결과 나타났습니다. 여기에 우리가 준비하고 K14-SCF 공정 피부 마우스에 포르 스 콜린 함유 천연 뿌리 추출물을 적용하고 최소 홍반 량 (MED)를 결정하여 UV 감도를 측정하는 방법을보고하는 방법을 설명합니다. 이 동물 모델을 사용하면, 피부의 표피 캠프 유도 melanization은 UV 노광에 생리적 반응에 미치는 영향을 연구 할 수있다.

서문

흑색 종의 발병률은 피부암의 가장 치명적인 형태는, 특히 공정한 피부 사람들 사이에서, 미국에서 지난 몇 년 동안 극적으로 증가했다. 강한 분자 역학적 증거는 주요 원인이되는 환경 요인 ^2-5로 UV 방사선을 연루. 태양에 노출 선탠 침대 사용의 형태로 증가 UV 노출은 흑색 종 발생률 ^6-7의 증가의 대부분에 대한 책임을 져야 할 것입니다. 흑색 종의 위험이 특히 볕 ^8, 생활 ^9-10 초기 특히와 연결 보인다. 햇볕의 위험은 복용량 및 자외선 노출의 강도뿐만 아니라 자외선에 피부 반응에 영향을 미치는 유전 요인에 의해뿐만 아니라 연결되어 있습니다. 피부 착색은 UV 감도의 가장 중요한 결정 요소 중 하나, 썬탠 및 암 위험의 위험이다. 흑색 종은 어두운 피부 individua에에 비해 빛 피부 사람의 약 20 배 더 자주 발생^11-13 LS.

멜라닌, 표피 멜라닌 세포에 의해 생성 된 안료는 피부 안색의 주요 결정 인자이다. (1) 유 멜라닌, UV 방사선의 에너지를 흡수에 효과적 어두운 블랙 / 브라운 안료, (2) 페오 멜라닌, 피부에 자외선 광자의 침투를 방지하는 정도 효과 붉은 / 금발의 안료 : 멜라닌은 두 가지 종류로 제공됩니다. 피부 색깔, UV 감도와 흑색 종의 위험은 크게 표피의 멜라닌 함유량 ^{14 ~ 15에} 의해 결정됩니다. 표피에서 더 유 멜라닌은 적은 UV 광자는 피부 속으로 침투 할 수있다. 때문에 유 멜라닌의 낮은 타고난 수준의 공정 피부 개인은 더 많은 경향이 UV 방사선 ^16-18의 급성 및 만성 효과에 있습니다.

피부 색소 침착, 흑색 종의 위험을 "황갈색"UV 노출 후 모두가 멜라노 1 수용체 (MC1R)의 신호 전달 능력과 상관 관계, _G의 결합 일곱 횡단의 능력멜라닌 세포 ^{19 ~ 22에} urface 수용체. MC1R는 동족의 높은 친 화성 리간드, α-멜라닌 세포 자극 호르몬 (α-MSH)를 결합하는 경우, 두 번째 메신저 캠프 ^(23)의 아데 닐 레이트 사이 클라 제와 생산의 활성화가있다. 자외선 노출 후 피부의 정상적인 생리적 반응은 각질 세포 ^24-29으로 α-MSH의 표피 생산을 포함한다. 우리와 다른 사람들은 각질 세포 유래 α-MSH는 아데 닐 레이트 사이 클라 제 ^30의 활성화를 통해 캠프 두 번째 메신저의 다운 스트림 생산을 시작, 표피의 멜라닌 세포에 MC1R에 결합 가설. 캠프 수준은 생존 경로, DNA 수리 및 색소 합성 등의 멜라닌 세포의 분화의 여러 측면을 제어 할 수 있습니다. MC1R 신호 및 캠프 명확 안료 효소 수준과 유 멜라닌 생산을 유도한다. MC1R 신호는 그대로이며, 멜라닌 캠프의 수준이 강력한 경우, 유 멜라닌이 생성되어 피부가 어둡게된다. 그러나, MC1R 신호에 결함이있는 경우세포질 캠프 수준이 낮게 유지, 페오 멜라닌 대신 ¹ 생성된다. 유 멜라닌 합성 캠프 수준에게 ^{1,14,31-35 인상} 에이전트가 약리학 적으로 자극 할 수있다.

MC1R 단백질은 인간 ^36-46에서 흑색 종 위험의 주요 조절하기 때문에, 우리는 MC1R 자외선에 의한 발암에 대한 멜라닌 세포를 보호하는 메커니즘에 관심이 있습니다. 우리의 연구를위한 기초로, 우리는 순수한 C57BL / 6 유전 적 배경 ^(1)에 유전자 변형 MC1R 변종 쥐 모델을 생성합니다. 이 모델에서, 구조적 기저 표피에서 발현되며 상피 interfollicular 멜라닌 세포가 모낭에서 진피 지역화 멜라노되는 비 - 형질 전환 마우스는 대조적으로, 생활 ^(47)에 걸쳐 피부에 유지되는 세포 인자 (SCF)를 줄기. K14-SCF의 유전자가 혼입으로, 표피는 안료의 특정 멜라닌 색소로 착색되어 특성동물 ^(1)의 변형. 야생형 MC1R 신호와 C57BL / 6 유전 적 배경에 K14-SCF 마우스는 제트 검은 피부는 멜라닌 색소의 매우 높은 수준을 특징으로했다. 아니나 다를까,이 동물은 높은 UV 저항이다. 대조적으로, 돌연변이 비활성 MC1R 항구 유 전적으로 일치 K14-SCF C57BL / 6 동물 표피에 거의 유 멜라닌이 없습니다. 대신 이러한 "확장자"동물 (MC1R의 ^{E / E)는} 페오 멜라닌 색소 (그림 1A)의 침착에 의한 고운 피부 안색을 가지고 더 많은 자외선에 민감한 ^{48 ~ 49이다.}

피부에 침투를 허용 화학적 특성을 가진 약물 화합물은 강력하게 직접적으로 피부 표피의 멜라닌 세포에서 cAMP의 수준을 조작하여 확장 (MC1R의 ^{E / E)} K14-SCF의 동물 모델에서 유 멜라닌을 유발하는 것으로 나타났다. 이 모델의 멜라닌 상향 조절은 R되었습니다아데 닐 레이트 사이 클라 제의 활성화 ¹ 등 포스 포 디에스 테라 제 4 억제 ^(35)에 의해 eported. 이 문서에서는, 우리는 확장 (MC1R의 ^{E / E)} K14-SCF 동물 모델 공정 피부 자외선에 민감한 사람의 준비와 포스 콜린의 국소 응용 프로그램을 보여줍니다. 우리는 약의 매일 두 번 응용 프로그램, 가속 melanization을 촉진하는 피부 어둡게하는 멜라닌 색소의 표피 증착에 의한 것입니다 및 그 유도 표피 멜라닌은 "최소 홍반 량"(MED) ^(48)의 측정을 통해 UV에 의한 자외선으로부터 보호 것을 보여줍니다.

프로토콜

1. 플렉 barbatus (Cohleus의 포스 콜리) 공장의 원유 뿌리 추출물의 국소 투여를위한 포스 콜린의 제조

1. 쥐 실험 프로토콜은 동물의 관리 및 사용에 윤리적 인 행위에 대한 지침을 다음과 켄터키 대학에서 기관 동물 케어 및 사용위원회 (프로토콜 # 00768M2004)에 의해 승인되었다. 뿌리 추출물은 70 % 에탄올의 표준 피부과베이스, 30 % 프로필렌 글리콜 40 % 중량 / 부피로 이루어진다.
2. 원유 포르 스 콜린 뿌리 추출물 200 g의 무게와 비커로 전송. 40 % 500 ㎖를 (w / v) 용액을, 차량의 부피 전체 (70 % 에탄올, 30 % 프로필렌 글리콜)는 아니지만 대부분을 첨가하여 조질 포스 콜린 뿌리 추출물 200g을 재현 탁하고의 해결책을 가져다 약 450 ML.
3. 실온에서 1 시간 동안 교반 하였다. 이 솔루션은 다소 점성이 될 것이며,하기 전에 솔루션에 "리프트"추출물을 수동으로 동요가 필요할 수 있습니다교반 막대가 인수 할 수있다.
4. 교반 시간 후, 눈금 실린더에 혼합물을 부어 (커에서 포르 스 콜린의 회복을 극대화하기 위해) 슬러리를 교반하는 데 사용 된 비커를 "린스"에 사용 된 차량을 이용하여 500 ml로 볼륨을 일정하게 .
5. 50 ㎖ 폴리 프로필렌의 원심 분리기 튜브에 슬러리를 전송합니다. 테이블 탑 원심 분리기를 사용하여 원심 분리 (1,500 XG, 실내 온도, 15 분). 이 시점에서, 불용성 물질은 상등액 쉽게 떨어져 부어 질 수 있도록 상당히 압축 될 것이다.
6. 추출물로부터 잔류 불용성 물질을 제거하기 위해 0.22 ㎛의 셀룰로오스 아세테이트 용액을 막을 통해 필터. 우리는 뿌리 추출물의 불용의 멤브레인의 조기 막힘을 방지하는 장치와 함께 사전 필터의 사용과 함께 세포 배양을 위해 디자인 된 병 톱 시스템을 사용합니다. 추출물의 대량을 할 때, 프리 필터 내기를 변경시 약 100 ㎖를 고를추가 된 각 볼륨과 사이.
7. 상온에서 보관하면, 추출물은 최대 1 년 동안 생물학적 활성을 유지합니다.

2. 국소 치료에 대한 C57BL / 6 K14-SCF 마우스의 준비

1. 전기 전단에 의해 동물로부터 등의 모피를 제거합니다. 간단히 0.25 mm 수술 준비 머리 (피셔 과학)에 장착 된 전기 가위 등의 모피의 전단을 용이하게하기 위해 흡입 이소 플루 란과 동물을 마취. 바람직하게 만 마취 과다 복용의 위험을 최소화하기 위해 마취의 한 종류 (예를 들면 케타민 / 자일 라진)를 사용합니다. 포화 흡입 챔버는 흄 후드 외부에서 사용할 때 직업적 위험을 실시하고 동물 마취제를 알 수없는 금액을 제공합니다. 이상적으로 정밀 기화기가 사용되어야한다.
2. 잔여 머리 수염을 제거 화학 탈모와 동물을 치료하는. 케타민 40 ㎎ / ㎏과 자일 라진 4 ㎎ / ㎏의 IP를 주입 동물을 마취 관리
3. 동물을 적절하게 (발가락 핀치에 의해 판단으로) 마취되면, 장갑을 낀 손가락을 사용하여 전단 지느러미 피부에 제모 크림의 손가락 크기의 금액을 적용합니다. 30 ~ 60 초 또는 그 주변에 이동하는 등 머리가 명확 크림에서 볼 수있을 때까지 피부에 크림을 문질러. 장기간 노출은 표피의 무결성의 손실로 피부 표피의 고장과 죽음의 화학 물질 연소에 이르게으로 만 머리 제거에 필요한 최소한의 시간 동안 크림을 둡니다.
4. 모든 크림이 제거 될 때까지 반복적으로 물을 적신 거즈 패드 등의 피부를 닦아주십시오. 부드러운 종이 타월을 사용하고 따뜻한 한적한 위치 (예 : 깨끗한 케이지는 온난화 패드에 위치)에서 복구 할 수 드라이 동물. 하나씩 동물 털을 뽑다 및 절차 전반에 걸쳐 긴밀하게 모니터링 할 수 있습니다.

3. 포스 콜린 또는 차량 제어의 국소 투여

1. 동물은 한 번에 하나씩 처리한다. 간단히 흡입과 마취아래의 양식을 장착 나일론 공기 투과 필터의 상단에 마우스를 배치하여 D의 이소 플루 란은 흄 후드에서 이소 플루 란 포화 리드 형 투명 유리 항아리에 이소 플루 란 포화 종이 타월을 배치되었습니다. 자발적인 근육의 움직임을 억제 할 수 있지만, 자발적 호흡 (일반적으로 10 ~ 20 초)을 유지하기 충분한 시간 동안 이소 플루 란에 마우스를 노출합니다. 너무 오래 이소 플루 란에 동물을 방치하면 호흡 억제 및 사망을 초래할 것입니다. 그것은 "빛을 것"과 약물 및 위험 죽음에 동물을 노출 오버 더 이소 플루 란보다는 짧게 마우스를 다시 노출 할 필요의 측면에 잘못을하는 것이 좋습니다.
2. 이소 플루 란 챔버에서 동물을 제거하고 깨끗한 흡수 벤치 패드에 놓습니다.
3. 일회용 폴리 프로필렌 팁이 장착 1,000 μL의 마이크로 피펫, 40 % 원유 포르 스 콜린 추출물의 400 μl를 그려 사용 (차량 제어 동물은 70 % 에탄올, 단독 30 % 프로필렌 글리콜을 받게됩니다).
4. 에 추출물로 이동모든 피부가 덮여있다 때까지 피펫 팁의 측면을 사용하고 피부에 그것을 떨어지는 및하여 동물의 등쪽 피부를 통해 추출물을 얼룩. 도포 후 피부를 가릴 필요도 없다.
5. 케이지에 마우스를 반환하고 마취에서 회복 될 때까지주의 깊게 관찰한다.
6. 비 안료 캠프 효과는 UV 민감도 실험을 혼동하지 않도록하려면, 자외선 노출 (안료의 효과가 마지막으로 국소 치료를 넘어 몇 일 지속) 2 일 전에 모든 국소 치료를 중단.

4. 반사 비색법에 의해 색상 측정을 피부

1. 간단히 흡입 이소 플루 란 (위 참조)와 마우스를 마취.
2. 색채와 함께 제공되는 표준화 된 흰색 표면에 휴대용 머리를 배치하여 미놀타 색채를 보정합니다.
3. 보장 동물의 등 피부에 색채 플러시의 휴대용 측정 헤드를 배치하는 것이 1cm ² 라운드 aperturE는 완전히 피부에 가압된다. 등쪽 피부의 다른 영역에서 적어도 세 별도의 측정을 수행.
4. 동물 당과 치료 그룹별로 SD ± 평균 패 * 점수를 계산합니다. 사려 깊은 색채는 실험에서 어느 시점에서 수행 할 수 있습니다.

5. "최소 홍반 선량"(MED)의 계산에 의해 UV 감도의 결정

1. 차량이나 상술 한 바와 같이 포르 스 콜린 하나가 미리 처리 된 동물을 사용합니다. 케타민과 자일 라진 (위 참조)의 표준 혼합물의 복강 내 주사로 동물을 마취.
2. MED 테스트를위한 UV-폐색 테이프의 조각을 준비한다. 테이프에 구멍을 생성하는 1 ^㎠의 원형 컷 아웃이있는 대형 홀 펀치 (그림 2A와 B)를 사용하십시오. 테이프에 정의 된 크기와 대칭 배열의 구멍을 갖는 방사선 조사 후 피부 변화의 인식을 용이하게한다. 테이프의 각 구멍을 통해, 작지만 쉽게 분리 할 수​​있는 부분을 적용 다른 UV 선량의 관리를 허용하도록 UV 노광 중에 정의 된 시간에 제거 될 수있는 테이프.
3. 동물이 충분히 진정되면, 등의 표면에 테이프를 넣습니다. 눈 윤활제는 항상 마취하에 사용되어야한다.
4. 두 웨스팅 F15T8UV-B로 구성된 UV 소스를 켜고는 313 nm의 피크 출력과 280-370 nm의 범위 램프. (일반적으로 따뜻하게 램프 몇 분 소요) UVB 센서 UV 광도계로 측정 한 램프가 일정한 UV 출력에 평형을 허용합니다.
5. UV 광도계에 의해 측정 한 UV 투과도에 기초하여, 원하는 각 투여 량에 대한 UV 노출 시간을 계산한다. 예를 들어, 우리의 램프의 UVB 출력 측정 2.4 mW의 / ^㎠. 따라서, 5 kJ의 / m ^2를 관리하는, 피부 아래 계산 한 UVB 방사선 (3 분 28 초 위치) 208 초에 노출 될 필요가있다 :
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6. 심지어 UV 노출을 보장하기 위해 복부 아래 표면 마취 동물 (장소에 폐쇄 테이프로 각각) 놓습니다. UV 방사선의 선택 복용을 관리하려면, 순차적으로 방사선의 올바른 복용에 1cm에게 피부의 ² 영역을 노출하는 구멍을 덮고있는 작은 폐색 테이프를 제거합니다. 40 kJ의 / m ² 실험에서 최대 투여 량 인 경우, 따라서, 위의 예를 사용하여, 다음 동물 제공된 것 40 kJ의 / ^m이 상태에서 27 분 및 47 초 다운로드 및 피부 램프 하에서 것 테이프에게 전체 시간을 덮는. 노광에 남아 208 초있을 때 그러나 kJ의 5 / m ² 조건을 덮는 테이프가 제거 될 것이다. 각각의 조건이 동시에 종료되도록 테이프 제거의 타이밍 수행해야합니다.
7. UV 노출 후, 갑작 스럽거나 지나치게 강력한 움직임으로 피부를 벗겨 않도록주의하면서 조심스럽게 등의 피부에서 테이프를 벗겨. 수 있도록 따뜻한 조용한 장소에서 동물을 배치마취에서 회복.
8. 홍반 (적색) 또는 부종의 은밀한 부분을 찾기 위해 48 시간 동안 마우스를 모니터 (붓기) UV 조사의 특정 용량에 노출 된 해부학 적 위치에 해당. 사진으로 피부 결과를 문서화합니다.
9. MED 값 홍반 및 / 또는 피부의 전체 노광 원의 부종에 의해 정의 된 염증을 일으키는 UV의 최소량에 대응한다. 피부의 색소 침착하지만, 홍반 및 부종이 여전히 일반적으로 정확하게, 부분 UV 노출시 테이프에 구멍의 정의 모양 덕분에 평가 될 수있다, MED의 결정에 도전 할 수 있습니다.

6. 통계 분석

Bonferroni 사후 테스트 (그래프 패드 PRISM). P 값 <0.05를 통계적으로 유의 한 것으로 간주됩니다으로 한 일원 분산 분석에 의해 생쥐의 동료 사이에서 데이터를 분석 할 수 있습니다.

결과

C57BL / 6 마우스 설명 (그림 1A)으로 K14-SCF의 유전자를 도입, eumelanotic pheomelanotic 또는 무색소 배경에 생성 된. 공정한 피부 확장 코호트 (MC1R의 ^{E / E는} 티르 ^{+ / +)} 마우스는 자동차 (70 % 에탄올, 30 % 프로필렌 글리콜) 또는 40 % 원유 콜레 우스 포스 콜리 뿌리 추출물 (80 μM 당 하나의 하루에 두 번 복용으로 국소 치료를 받았다 오일 (그림 2B)를위한)

토론

공정 피부 인간의 동물 모델을 사용하여, 우리는 포르 스 콜린이 풍부한 원유 뿌리 추출물의 국소 응용 프로그램이 견고하게 피부에있는 멜라닌 생성을 자극하여 표피를 어둡게 것을 찾을 수 있습니다. 표피 melanization는 사람의 피부에서 발생로, 기초의 표피 줄기 세포 인자의 발현에 의존하지만 유전자 변형되지 않은 마우스의 피부에. 유전자 변형되지 않은 마우스의 등쪽 피부는 피부에 색소를 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Coleus Forskoli extract 20%	Buckton Scott USA Inc.	n/a	Princeton, NJ
Isothesia, Isoflurane , USP	Butler Schein	NCD 11695-6776-1	Dublin, OH, USA
Xylazine	Anased Injection	LA04612	Shenandoah, Iowa, USA
Ketamine HCl, USP	Putney	NDC 26637-411-01	St. Joseph, MO, USA
Ethanol	Decon Labs.	2705
Propylene glycol	Adesco	05751L	Solon, OH, USA
Depilatory cream, Nair	Church Dwight	JF-11 4381322	Priceton, NJ
EQUIPMENT
Germicidal Hg Lamp UV-B	Westinghouse	F15T8UV-B
Radiometer photometer	International light	1LT400A	Peabody, MA,USA
Chromameter	Konica Minolta	CR-400	Ramsey, NJ, USA
Data Processor for Chromameter CR-400	Konica Monilta	DR-400	Ramsey, NJ, USA