אינדוקציה תרופתי של עוריות מלנין והגנה מפני כוויות שמש בדגם מואנש מאוס

Summary

המלנין עוריות הוא מושרה על ידי יישום מקומי של forskolin במודל עכברי של אדם UV רגיש בהיר עור. מניפולציה תרופתי של רמות cAMP בעור ואפידרמיס המחשיכים מאוד להגן מפני דלקות בתיווך UV (כוויות שמש), כפי שנמדד על ידי מינון erythematous מינימום assay (MED).

Abstract

הגינות של עור, רגישות UV וסיכון לסרטן העור בכל לתאם עם הפונקציה הפיזיולוגית של הקולטן melanocortin 1, חלבון איתות _יחד-S G נמצא על פני השטח של מלנוציטים. MC1R מגרה cyclase adenylyl וייצור cAMP אשר, בתורו, מעלה מווסת את ייצור melanocytic של מלנין בעור. על מנת ללמוד את המנגנונים שבאמצעותם איתות MC1R מגנה על העור מפני פגיעת UV, מחקר זה מסתמך על מודל של עכברים עם "עור אנושי", המבוסס על ביטוי אפידרמיס של גורם בתאי גזע (SCF). עכברים הטרנסגניים K14-SCF לשמור מלנוציטים ב יש לי האפידרמיס ולכן היכולת להפקיד המלנין באפידרמיס. במודל חיה זו, תוצאות מצב MC1R סוג בר בתצהיר חזק של פיגמנט אומלנין השחור ופנוטיפ מוגן UV. לעומת זאת, בעלי החיים K14-SCF עם תערוכה פגומה MC1R איתות יכולת פיגמנטציה אדומה / בלונדינית, אומלנין מעט מאוד בעור ופנוטיפ UV-רגיש. הנמקה כי בתצהיר אומלנין עלול להיות מוגבר על ידי סוכנים מקומיים המחקים איתות MC1R, מצאנו כי יישום ישיר של תמצית forskolin לעור של עכברים בהירי עור MC1R פגומים גרם לאינדוקצית אומלנין החזקה והגנת UV ^1. כאן אנו מתארים את השיטה להכנה ויישום תמצית שורש טבעית המכיל forskolin לעכברים בהירי עור K14-SCF ומדווח על שיטה למדידת רגישות UV על ידי קביעת מינון erythematous מינימאלי (MED). שימוש במודל זה חי, זה אפשרי ללמוד איך האינדוקציה cAMP אפידרמיס וmelanization של העור משפיעים על תגובות פיזיולוגיות לחשיפה לקרינת UV.

Introduction

השכיחות של מלנומה, הצורה הקטלנית ביותר של סרטן העור, גדלה באופן דרמטי בעשורים האחרונים בארצות הברית, במיוחד בקרב אנשים בהירי עור. ראיות מולקולריות ואפידמיולוגיים חזקות מפלילות קרינת UV כגורם סביבתי עיקרי סיבתי ^2-5. חשיפת UV מוגברת בצורה של חשיפה לשמש ושימוש במיטת השיזוף עשויה להיות אחראי לחלק גדול מעלייה בשכיחות מלנומה ^6-7. הסיכון למלנומה נראית קשור במיוחד עם כוויות שמש ^8, במיוחד אלה בשלב מוקדם בחיי ^9-10. סיכון לכוויות השמש קשורה לא רק למינון ועוצמה של חשיפה לקרינת UV, אלא גם על ידי גורמים תורשתיים המשפיעים על תגובה עורית לקרינת UV. פיגמנטציה של עור היא אחד הגורמים החשובים ביותר של רגישות UV, סיכון לכוויות שמש וסיכון לסרטן. מלנומה מתרחש בערך עשרים פעמים בתדירות גבוהה יותר באנשים בהירים עור בהשוואה לindividua כהה עורls ^11-13.

המלנין, הפיגמנט המיוצר על ידי מלנוציטים באפידרמיס, הוא הקובע העיקרי של גוון עור. המלנין מגיע בשני סוגים עיקריים: (1) אומלנין, פיגמנט חום / שחור כהה יעיל בספיגת האנרגיה של קרינת UV, ו (2) pheomelanin, אדמדם / פיגמנט בלונדינית פחות יעיל במניעת חדירה של פוטונים UV אל העור. צבע עור, רגישות UV והסיכון למלנומה נקבעים בעיקר על ידי תוכן אומלנין אפידרמיס ^14-15. יותר אומלנין באפידרמיס, הפוטונים UV פחות יכול לחדור לתוך העור. בגלל הרמות נמוכות של אומלנין מולדים, אנשים בהירי עור הם הרבה יותר פגיע להשפעות אקוטיות וכרוניות של קרינת UV ^16-18.

פיגמנטציה של עור, סיכון למלנומה והיכולת "שיזוף" לאחר חשיפה לקרינת UV כל לתאם עם יכולת האיתות של הקולטן melanocortin 1 (MC1R), הטרנסממברני של _{מצמידים-S} G שבעקולט urface על המלנוציטים ^19-22. כאשר MC1R נקשר ליגנד מאותו המקור גבוהה זיקה, הורמון מגרה α-מלנוציט (α-MSH), יש הפעלה של cyclase adenylyl וייצור של cAMP השליח השני ^23. התגובה הפיזיולוגית הנורמלית של העור לאחר חשיפה לקרינת UV כוללת ייצור אפידרמיס של α-MSH ידי קרטינוציטים ^24-29. אנו ואחרים משערים כי מקורם בkeratinocyte α-MSH נקשר MC1R במלנוציטים באפידרמיס, ייזום ייצור במורד הזרם של השליח השני המחנה דרך הפעלה של cyclase adenylyl ^30. רמות cAMP לשלוט בהיבטים רבים של בידול מלנוציט, כוללים מסלולי הישרדות, תיקון DNA וסינתזת הפיגמנט. איתות MC1R וcAMP בבירור לגרום לרמות אנזים פיגמנט וייצור אומלנין. כאשר איתות MC1R היא שלמה ורמות cAMP melanocytic הם חזקות, אומלנין מופק והעור מתכהה. עם זאת, אם איתות MC1R היא פגומה ורמות cAMP cytoplasmic יישארו נמוכות, pheomelanin מיוצר במקום ^1. סינתזת eumelanin יכולה להיות מגורה פרמקולוגית על ידי סוכנים שמעלים את רמות cAMP ^1,14,31-35.

מאז חלבון MC1R הוא וסת עיקרי לסיכון למלנומה בבני אדם ^36-46, אנו מעוניינים במנגנונים שבאמצעותם MC1R מגן מלנוציטים נגד היווצרות הסרטן ע"י-UV. כבסיס למחקרים שלנו, אנחנו שנוצרנו מודל עכברי MC1R-גרסה מהונדס על רקע ¹ טהור C57BL / 6 גנטי. במודל זה, נובע גורם תא (SCF) בא לידי ביטוי constitutively באפידרמיס הבסיסי ומלנוציטים interfollicular אפידרמיס נשמרים בעור לאורך כל חיים ^47, בניגוד לעכברים שאינם מהונדסים שבו מלנוציטים בתרגום לדרמיס בזקיקי שיער. עם transgene K14-SCF משולב, האפידרמיס הופך פיגמנט עם מאפיין פיגמנטים המלנין המסוים של פיגמנטזן של בעלי החיים ^1. עכברי K14-SCF על הרקע הגנטי C57BL / 6 עם איתות MC1R סוג בר שהעור שחור משחור מתאפיינים ברמות גבוהות מאוד של הפיגמנט אומלנין. באופן לא מפתיע, בעלי החיים אלה הם מאוד UV עמיד. לעומת זאת, יש לי C57BL / 6 בעלי החיים K14-SCF התאמה גנטית כי נמל MC1R פעיל מוטציה כמעט שלא אומלנין באפידרמיס. במקום זאת, יש בעלי החיים אלה "הסיומת" ^(ה MC1R ^{/ ה)} גוון עור בהיר הנגרם על ידי בתצהיר של פיגמנט pheomelanin (איור 1 א) והם הרבה יותר רגיש לקרינה UV ^48-49.

תרכובות תרופתיות עם תכונות כימיות שמאפשרות חדירה לתוך העור הוכחו לגרום potently אומלנין בהארכה ^(ה MC1R ^{/ ה)} מודל החיה K14-SCF ישירות על ידי המניפולציה רמות cAMP במלנוציטים באפידרמיס בעור. גברת ביטוי מלנין במודל זה כבר reported ידי הפעלת cyclase adenylyl ^1, כמו גם phosphodiesterase 4 עיכוב ^35. במאמר זה, אנחנו מדגימים את ההכנה והיישום מקומי של forskolin בהארכה ^(ה MC1R ^{/ ה)} בעלי החיים K14-SCF איזה דגם האנושי UV רגיש בהירת עור. אנו מראים כי יישום פעמיים ביום של התרופה מקדם melanization המואץ, שמחשיך העור בשל תצהיר אפידרמיס של פיגמנט המלנין, וכי מלנין אפידרמיס המושרה מגן מפני כוויות שמש נגרם UV באמצעות מדידה של "מינון המינימלי erythematous" (MED) ^48.

Protocol

1. הכנת Forskolin למקומי מנהל מתמצית שורש גולמי של צמח Plectranthus barbatus (forskohlii Cohleus)

1. פרוטוקולים לניסויים עכבריים בעקבות ההנחיות להתנהגות אתית בטיפול ושימוש בבעלי החיים ואושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת קנטאקי (פרוטוקול # 00768M2004). תמצית השורש מורכבת ב40% במשקל / נפח בבסיס סטנדרטי דרמטולוגיים של 70% אתנול, 30% פרופילן גליקול.
2. שוקל 200 גרם של תמצית שורש forskolin הגולמי ולהעביר אותו לכוס. כדי להפוך 500 מיליליטר של 40% (w / v) פתרון, resuspend 200 גרם של תמצית שורש forskolin הגולמי על ידי הוספה ביותר, אבל לא כל הנפח של הרכב (70% אתנול, פרופילן גליקול 30%) ולהביא הפתרון ל בערך 450 מיליליטר.
3. מערבבים במשך שעה בטמפרטורת חדר. הפתרון יהיה צמיג במידה מסוימת והן עשוי לחייב תסיסה ידנית כדי "להרים" את התמצית לפתרון לפניבר והמערבב הוא מסוגל להשתלט.
4. , אחרי שעה של ערבוב יוצק את התערובת לתוך גליל סיים ולהביא את הנפח 500 מיליליטר שימוש ברכב שבו נעשה שימוש כדי "לשטוף את" הכוס ששימשה לעורר את התרחיף (על מנת למקסם את ההתאוששות של forskolin מהכוס) .
5. העבר את התרחיף ל50 צינורות צנטריפוגה מיליליטר פוליפרופילן. צנטריפוגה (1,500 XG, טמפרטורת חדר, 15 דקות) באמצעות צנטריפוגות בטבלה עליונה. בשלב זה, את החומר מסיס יהיה די דחוס, המאפשר את supernatant למזוג לכוס בקלות.
6. סנן את הפתרון דרך קרום אצטט תאית 0.22 מיקרומטר כדי להסיר כל חומר מסיס שיורי מהתמצית. אנו משתמשים במערכת בקבוק העליונה המיועדת לתרבית תאים, יחד עם השימוש בטרום מסננים שמגיעים עם היחידה למניעת סתימה מוקדמת של הקרום ממרכיבים מסיסים של תמצית השורש. בעת ביצוע כמויות גדולות של התמצית, לסנן בערך 100 מיליליטר בכל פעם, שינוי ההימור לסנן מראשWeen כל כרך הוסיף.
7. כאשר הם מאוחסנים בטמפרטורת חדר, התמצית שומרת את פעילות ביולוגית לעד שנה.

2. הכנת C57Bl / 6 העכברים K14-SCF לטיפולים מקומיים

1. הסרת פרווה גב מבעלי החיים על ידי גז חשמלי. בקצרה להרדים את החיות עם isoflurane שהאיפה להקל על מריחה של פרווה הגבי עם מזמרה חשמלית לבוש עם ראש 0.25 מ"מ כירורגית הכנה (פישר סיינטיפיק). רצוי להשתמש רק בסוג אחד של הרדמה (למשל קטמין / xylazine) כדי למזער את הסיכון של מנת יתר של חומר הרדמה. קאמרי משאיפת רוויה נושא בעיסוק סיכון בעת ​​שימוש מחוץ למכסה המנוע קטר ומספק כמויות לא ידועות של חומר הרדמה לבעלי חיים. באופן אידיאלי יש להשתמש במכשיר אדי דיוק.
2. כדי להסיר שיער זיפי שייר, טיפול בבעלי החיים עם מקריח כימי. לנהל הרדמה לבעלי החיים עם הזרקת ה-IP של קטמין 40 מ"ג / קילוגרם ו xylazine 4 מ"ג / קילוגרם
3. ברגע שחיות מורדמים כראוי (כפי שנשפט על ידי קמצוץ הבוהן), להחיל כמות אצבע בגודל של קרם מקריח לעור גב טעון באמצעות אצבע עטויה בכפפה. למרוח את הקרם לתוך העור ל30-60 שניות או עד שניתן לראות בבירור שערות בקרם בזמן שהוא עבר בסביבה. השאר את הקרם על רק לכמות המינימלית של זמן הדרוש להסרת שיער כמו חשיפה ממושכת גורמת לצריבה כימית של העור, התמוטטות אפידרמיס ומוות מאובדן השלמות באפידרמיס.
4. נגב את עור הגב עם פדה גזה ספוגה במים שוב ושוב עד שכל השמנת הוסרה. חיות יבשים באמצעות מגבות נייר רכות, ולאפשר להם להתאושש במיקום מבודד חם (למשל כלובים נקיים הונחו על כרית חימום). להשיר שער חיות אחד על אחד ולעקוב מקרוב לאורך כל ההליך.

3. מנהל אקטואלי של Forskolin או רכב בקרה

1. יש להתייחס לבעלי חיים אחד בכל פעם. בקצרה להרדים עם שאיפהisoflurane ד על ידי הצבת העכבר על החלק העליון של מסנן אוויר חדיר ניילון מצויד טופס לפיו הושם מגבת נייר רווי isoflurane בצנצנת רווי isoflurane עפעפיים ברורה זכוכית במנדף. לחשוף את העכבר כדי isoflurane למספיק זמן כדי לדכא את תנועות שרירים מרצון, אבל כדי לשמור על נשימה ספונטנית (בדרך כלל 10-20 שניות). השארת בעלי החיים בisoflurane ארוכה מדי תגרום לדיכוי ומוות בדרכי הנשימה. עדיף לטעות בצד של "הולך אור" ויש להם מחדש לחשוף את העכבר לזמן קצר ליותר isoflurane ולא אל מעל לחשוף את בעלי החיים למוות הסמים וסיכון.
2. הסר את החיה מבית הבליעה isoflurane ומניח על משטח ספסל סופג נקי.
3. באמצעות micropipette 1,000 μl לבוש עם טיפ פוליפרופילן חד פעמי, להכין 400 μl 40% תמצית forskolin הגולמי (בעלי חיים שליטה ברכב יקבלו 70% אתנול, 30% פרופילן גליקול לבד).
4. העבר את התמצית עלאחורי של בעלי החיים על ידי מטפטף אותו על העור ולאחר מכן, תוך שימוש בצד של קצה פיפטה, מורח את התמצית על עור הגב עד שכל העור כבר מכוסה. אין צורך למחוק את העור לאחר יישום.
5. להחזיר את העכבר לכלוב שלה, ולבחון בזהירות עד שהוא מתאושש מהרדמה.
6. על מנת שתופעות cAMP אינו פיגמנט לא צריכה לבלבל את ניסויי רגישות UV, להפסיק את כל הטיפולים אקטואליים 2 ימים לפני חשיפה לקרינת UV (אפקט הפיגמנט נמשך כמה ימים מעבר לטיפול מקומי שעבר).

4. צבע עור מדידה על ידי רפלקטיבית colorimetry

1. בקצרה להרדים את העכבר עם isoflurane בשאיפה (ראה לעיל).
2. לכייל קולורימטר Minolta ידי הנחת הראש הנייד על המשטח הלבן האחידים מסופק עם קולורימטר.
3. הנח את ראש המדידה הנייד של סומק קולורימטר עם עור הגב של בעלי החיים על מנת להבטיח כי apertur העגול 1 סנטימטר ²דואר נלחץ לחלוטין על גבי העור. קח לפחות שלוש מדידות נפרדות באזורים שונים של עור גב.
4. חישוב ציון * L ממוצע ± SD לכל בעלי חיים וכל קבוצת טיפול. colorimetry רפלקטיבית יכולה להיעשות בכל נקודה בניסוי.

5. קביעת UV הרגישות על ידי חישוב של "מינימל erythematous המנה" (MED)

1. להשתמש בבעלי חיים, כי כבר מראש שטופלו גם עם רכב או forskolin כפי שתואר לעיל. הרדימי חיות עם זריקת intraperitoneal של תערובת סטנדרטית של קטמין ו xylazine (ראה לעיל).
2. הכן את נייר דבק UV-אוטם לבדיקת MED. כדי ליצור חורים בקלטת, להשתמש בניקוב חורים כבד עם 1 סנטימטר ² מעגלי מגזרת (2A דמויות ו-B). יש חורים בגודל מוגדר וסידור סימטרי בקלטת מאפשר זיהוי של שינויים בעור לאחר הקרנה. על כל חור בקלטת, להחיל חתיכה קטנה אבל בקלות להסרה מקלטת שניתן להסיר בזמנים מוגדרים במהלך חשיפה לקרינת UV כדי לאפשר לממשל של מינוני UV שונים.
3. ברגע שבעלי חיים הם מסוממים כראוי, הניחו את הקלטת על פני השטח הגבי. חומר הסיכה העין תמיד צריכה להיות מנוצל בהרדמה.
4. הפעל את מקור UV המורכב משני Westinghouse F15T8UV-B מנורות עם תפוקת שיא של 313 ננומטר ומגוון של 280-370 ננומטר. לאפשר את המנורה לאזן לפלט UV קבוע כפי שהיא נמדדת על ידי פוטומטר UV עם חיישן UVB (בדרך כלל לוקח כמה דקות למנורות להתחמם).
5. בהתבסס על קצב שידור UV כפי שהיא נמדדת על ידי פוטומטר UV, לחשב UV זמן חשיפה לכל מינון רצוי. לדוגמא, אמצעי פלט UVB של מנורתנו 2.4 mW / ² סנטימטר. לכן, כדי לנהל 5 kJ / מ ^2, העור היה צריך להיות חשוף ל208 שניות (שהוא 3 דקות ושניות 28) של קרינת UVB, כפי שמחושב שלהלן:
   upload/50670/50670eq1.jpg "/>
6. הנח חיות המסוממות (כל אחד עם קלטת אוטמת במקום) הגחון פני השטח למטה כדי להבטיח חשיפה אפילו UV. כדי לנהל את המנות הנבחרות של קרינת UV, ברצף להסיר את הקלטות אוטמות קטנות המכסות את החורים לחשוף סנטימטר 1 ² אזורים של עור למינונים הנכונים של קרינה. לכן, שימוש בדוגמא לעיל, אם 40 kJ / m ² הוא המנה הגדולה ביותר בניסוי, ולאחר מכן בעלי החיים יהיו תחת המנורה ל27 דקות ו47 כולל שניות והעור במצב 40 kJ / m ² לא יהיו כל שמעליה קלטת כל הזמן. עם זאת, סרט שכיסה את מצב 5 kJ / m ² יוסר כאשר יש 208 שניות שנותרו בחשיפה. תזמון של הסרת קלטת צריך להיעשות כך שכל מצב מסתיים בו זמנית.
7. לאחר חשיפה לקרינת UV, לקלף את הסרט מעור הגב בזהירות, נזהר שלא לקרוע את העור בתנועות פתאומיות או יתר על המידה, בכוח. הנח בעלי חיים במקום שקט חם כדי לאפשרהתאוששות מן ההרדמה.
8. לפקח על עכברים ל24-48 שעה לחפש אזורים דיסקרטיים של אריתמה (אדמומיות) או בצקת (נפיחות) מתאים לאתרים אנטומיים נחשפו למינון המסוים של קרינת UV. לתעד את ממצאי עור photographically.
9. ערך MED תואם את המינון המינימאלי של UV שגורם לדלקת כפי שהוגדר על ידי אודם ו / או בצקת של המעגל נחשף כולו של עור. שימו לב כי פיגמנטציה של העור יכולה לאתגר את הנחישות של MED, לעומת זאת, אודם ובצקת עדיין יכולים בדרך כלל להעריך במדויק, בין שאר הודות לצורה מוגדרת של הפתחים בקלטת במהלך חשיפה לקרינת UV.

6. ניתוח סטטיסטי

לנתח נתונים בין קבוצות של עכברים בדרך ANOVA אחד עם מבחן Bonferroni הודעה (גרף Pad PRISM). ערכי p <0.05 נחשבים משמעותיים מבחינה סטטיסטית.

תוצאות

C57BL / 6 עכברים שנוצרו על רקע eumelanotic, pheomelanotic או amelanotic שילוב transgene K14-SCF כ( איור 1 א) תאר. קבוצות של הארכה בהירת עור ^(ה MC1R ^{/ e, + / +} Tyr) טופלו עכברים למריחה עם מינונים של פעמיים ביום או ברכב (70% אתנול, 30% פרופילן גליקול) או 40% תמצית שורש forskohlii Coleus הגולמי (...

Discussion

שימוש במודל חיה של האדם בהיר עור, אנו מוצאים כי יישום מקומי של תמצית שורש הגולמי forskolin עשיר וחסונה מכהה את העור על ידי המרצת ייצור המלנין בעור. melanization עוריות תלוי בביטוי של גורם בתאי גזע בעור הבסיסי, כפי שקורה בעור אדם, אך לא בעור עכבר גנטי ללא שינוי. עור הגב של עכברים גנ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Coleus Forskoli extract 20%	Buckton Scott USA Inc.	n/a	Princeton, NJ
Isothesia, Isoflurane , USP	Butler Schein	NCD 11695-6776-1	Dublin, OH, USA
Xylazine	Anased Injection	LA04612	Shenandoah, Iowa, USA
Ketamine HCl, USP	Putney	NDC 26637-411-01	St. Joseph, MO, USA
Ethanol	Decon Labs.	2705
Propylene glycol	Adesco	05751L	Solon, OH, USA
Depilatory cream, Nair	Church Dwight	JF-11 4381322	Priceton, NJ
EQUIPMENT
Germicidal Hg Lamp UV-B	Westinghouse	F15T8UV-B
Radiometer photometer	International light	1LT400A	Peabody, MA,USA
Chromameter	Konica Minolta	CR-400	Ramsey, NJ, USA
Data Processor for Chromameter CR-400	Konica Monilta	DR-400	Ramsey, NJ, USA