Induction pharmacologique de mélanine épidermique et la protection contre les coups de soleil dans un modèle humanisé de souris

Résumé

Mélanine épidermique est induite par l'application topique de la forskoline dans un modèle murin de la sensible aux UV humain à la peau claire. Manipulation pharmacologique du taux d'AMPc dans la peau et l'épiderme assombrissant fortement protéger contre l'inflammation médiée par les UV (coups de soleil), telle que mesurée par la dose érythémateuse minimale (DEM) de dosage.

Résumé

Équité de la peau, la sensibilité aux UV et le risque de cancer de la peau tout en corrélation avec la fonction physiologique du récepteur de la mélanocortine 1, une protéine de signalisation G _s couplé trouve à la surface des mélanocytes. Mc1r stimule l'adénylyl cyclase et la production d'AMPc qui, à son tour, régule à la hausse la production de mélanine dans les mélanocytes de la peau. Afin d'étudier les mécanismes par lesquels la signalisation Mc1r protège la peau contre les dommages UV, cette étude s'appuie sur un modèle de souris avec "peau humanisé" basé sur l'expression épidermique du facteur de cellules souches (SCF). Souris transgéniques K14-SCF conservent mélanocytes dans le épiderme et ont donc la possibilité de déposer la mélanine dans l'épiderme. Dans ce modèle animal, type sauvage résultats de l'état Mc1r en dépôt solide de pigment noir de l'eumélanine et un phénotype anti-UV. En revanche, les animaux K14-SCF avec signalisation défectueux Mc1r capacité présentent une pigmentation rouge / blonde, très peu d'eumélanine dans la peau etun phénotype sensible aux UV. Raisonnement que le dépôt de l'eumélanine pourrait être renforcée par des agents topiques qui imitent signalisation Mc1r, nous avons constaté que l'application directe de l'extrait de la forskoline sur la peau de souris à la peau claire Mc1r défectueux a entraîné robuste induction de l'eumélanine et la protection UV ^1. Nous décrivons ici la méthode pour la préparation et l'application d'un extrait de racine naturelle contenant la forskoline à des souris à la peau claire K14-SCF et signaler une méthode pour mesurer la sensibilité aux UV par déterminer la dose érythémateuse minimale (DEM). En utilisant ce modèle animal, il est possible d'étudier comment épidermique AMPc induction et la mélanisation de la peau affectent les réponses physiologiques à l'exposition aux UV.

Introduction

L'incidence du mélanome, la forme la plus mortelle de cancer de la peau, a considérablement augmenté au cours des dernières décennies aux États-Unis, en particulier chez les personnes à peau claire. Preuve moléculaire et épidémiologique forte implique rayonnement UV comme un facteur causal majeur de l'environnement ^2-5. L'exposition aux UV renforcée sous forme d'exposition au soleil et l'utilisation des lits de bronzage est susceptible d'être responsable de la plupart des augmentations de mélanome incidence ^6-7. risque de mélanome semble particulièrement liée à des coups de soleil ^8, en particulier ceux au début de la vie ^9-10. Le risque de coup de soleil est liée non seulement à la dose et l'intensité de l'exposition aux UV, mais aussi par des facteurs héréditaires qui influencent la réponse cutanée à un rayonnement UV. pigmentation de la peau est l'un des déterminants les plus importants de la sensibilité aux UV, le risque de coups de soleil et le risque de cancer. Le mélanome se produit environ vingt fois plus souvent chez les personnes à peau claire par rapport à individua peau foncéels ^11-13.

La mélanine, un pigment produit par les mélanocytes de l'épiderme, est le principal déterminant de teint de la peau. La mélanine est disponible en deux variétés principales: (1) l'eumélanine, un pigment brun / noir foncé efficace pour absorber l'énergie du rayonnement UV, et (2) phéomélanine, un rouge / pigment blond moins efficace pour prévenir la pénétration de photons UV dans la peau. couleur de la peau, la sensibilité aux UV et le risque de mélanome sont en grande partie déterminées par le contenu épidermique eumélanine ^14-15. Le plus eumélanine dans l'épiderme, les photons UV moins peut pénétrer dans la peau. En raison de faibles niveaux innées de l'eumélanine, les personnes à la peau claire sont beaucoup plus sujettes à des effets aigus et chroniques du rayonnement UV ^16-18.

la pigmentation de la peau, le mélanome et le risque de la capacité de "bronzage" après l'exposition aux UV tout en corrélation avec la capacité de signalisation du récepteur de la mélanocortine 1 (Mc1r), une _s-G à sept domaines transmembranaires couplés srécepteur de urface sur les mélanocytes ^19-22. Lorsque Mc1r se lie à son ligand apparenté à haute affinité, α-mélanocyte stimulating hormone (α-MSH), il est l'activation de l'adénylcyclase et la production de la deuxième camp de messager ^23. La réponse physiologique normale de la peau après exposition aux UV comprend la production de l'épiderme de α-MSH par les kératinocytes ^24-29. Nous émettons l'hypothèse que d'autres et de kératinocytes dérivées de α-MSH se lie à Mc1r sur les mélanocytes épidermiques, s'engageant dans la production en aval du second messager AMPc par l'activation de l'adénylcyclase ^30. taux d'AMPc contrôlent de nombreux aspects de la différenciation des mélanocytes, y compris les voies de survie, réparation de l'ADN et de la synthèse du pigment. signalisation de l'AMPc Mc1r et induisent clairement les niveaux de l'enzyme de pigments et de la production de l'eumélanine. Lorsque la signalisation Mc1r est intacte et les taux d'AMPc mélanocytaires sont robustes, l'eumélanine est produite et la peau s'assombrit. Toutefois, si la signalisation Mc1r est défectueux etles taux d'AMPc cytoplasmiques restent faibles, pheomelanin est produite à la place ^1. synthèse de eumélanine peut être stimulé pharmacologiquement par des agents qui augmentent le taux d'AMPc ^1,14,31-35.

Depuis la protéine Mc1r est un régulateur majeur du risque de mélanome chez l'homme ^36-46, nous sommes intéressés aux mécanismes par lesquels Mc1r protège les mélanocytes contre la carcinogenèse induite par les UV. En tant que fondation pour nos études, nous avons généré un Mc1r-modèle murin transgénique variante sur un pur C57BL / 6 génétique ^1. Dans ce modèle, facteur des cellules souches (SCF) est constitutivement exprimé dans l'épiderme basaux et des mélanocytes épidermiques interfolliculaires sont retenus dans la peau tout au long de la vie ^47, contrairement aux souris non-transgénique, dans lequel mélanocytes localiser au derme dans les follicules pileux. Avec le transgène K14-Scf incorporé, l'épiderme devient pigmenté avec notamment la caractéristique de la mélanine de pigments de pigmentsouche de l'animal ^1. souris K14-SCF sur le fond génétique C57BL / 6 de type sauvage signalisation Mc1r ont la peau noire de jais caractérisé par des niveaux très élevés de l'eumélanine pigment. Sans surprise, ces animaux sont très résistants aux UV. En revanche, génétiquement adaptés K14-SCF C57BL / 6 animaux qui abritent un inactif Mc1r mutant n'ont presque pas d'eumélanine dans l'épiderme. Au lieu de cela, ces animaux «d'extension» (Mc1r ^{e / e)} ont un teint de peau juste causée par le dépôt de pheomelanin pigment (figure 1A) et sont beaucoup plus sensibles aux UV ^48-49.

Composés pharmacologiques ayant des propriétés chimiques qui permettent la pénétration dans la peau ont été montré pour induire puissamment eumélanine dans le prolongement (Mc1r ^{e / e)} modèle animal K14-Scf en manipulant directement les taux d'AMPc dans les mélanocytes de l'épiderme de la peau. La mélanine régulation à la hausse dans ce modèle a été reported par adénylylcyclase activation ¹ ainsi que de la phosphodiestérase 4 inhibition ^35. Dans cet article, nous démontrons la préparation et l'application topique de la forskoline en extension (Mc1r ^{e / e)} animaux K14-SCF qui modèle la sensible aux UV humain à la peau claire. Nous montrons que l'application deux fois par jour du médicament favorise la mélanisation accélérée, ce noircissement de la peau est due au dépôt de l'épiderme de mélanine et qui induit la mélanine épidermique protège contre les coups de soleil induite par les UV à travers la mesure de la "dose minimale érythémateuse" (MED) ^48.

Protocole

Une. Préparation de la forskoline pour l'administration topique d'un extrait de racine de brut de l'usine de Plectranthus barbatus (Cohleus forskohlii)

1. Protocoles pour expériences murines ont suivi les lignes directrices pour la conduite éthique dans le soin et l'utilisation des animaux et ont été approuvés par la institutionnel de protection et d'utilisation des animaux Comité à l'Université du Kentucky (Protocole # 00768M2004). L'extrait de racine est constituée à 40% poids / volume dans une base dermatologique norme de 70% d'éthanol, 30% de propylène glycol.
2. Peser 200 g de forskoline brut extrait de racine et le transférer dans un bêcher. Pour faire 500 ml de 40% (p / v) de solution, remettre en suspension 200 g de forskoline brut extrait de racine par l'ajout de la plupart, mais pas la totalité du volume du véhicule (70% éthanol, 30% de propylene glycol) et porter la solution à environ 450 ml.
3. Agiter pendant une heure à température ambiante. La solution sera un peu visqueux et peut nécessiter une agitation manuelle de «lever» l'extrait en solution avantla barre d'agitation est en mesure de prendre le relais.
4. Après une heure d'agitation, verser le mélange dans un cylindre gradué et porter le volume à 500 ml en utilisant un véhicule qui a été utilisé à "rincer" le bêcher qui a été utilisé pour agiter la bouillie (pour maximiser la récupération de la forskoline à partir du bécher) .
5. Transférer la suspension de tubes de 50 ml à centrifuger en polypropylène. Centrifugeuse (1500 xg, la température ambiante, 15 min) à l'aide d'une centrifugeuse de table. A ce moment, la matière insoluble sera assez compacté, ce qui permet au surnageant d'être facilement déversé.
6. Filtrer la solution à travers une membrane d'acétate de cellulose de 0,22 um pour éliminer toute matière insoluble résiduelle à partir de l'extrait. On utilise un système de haut-bouteille conçue pour la culture cellulaire, ainsi que l'utilisation des pré-filtres qui viennent avec l'appareil pour éviter un colmatage prématuré de la membrane à partir de composants insolubles de l'extrait de racine. Lors de grands volumes de l'extrait, un filtrage d'environ 100 ml à la fois, en changeant le pari préfiltreween chaque volume ajouté.
7. Lorsqu'elles sont stockées à la température ambiante, l'extrait maintient l'activité biologique pour jusqu'à un an.

2. Préparation de C57BL / 6 K14-Scf souris pour des traitements topiques

1. Retirer dorsale fourrure des animaux par cisaillement électrique. Anesthésier brièvement les animaux avec de l'isoflurane inhalation pour faciliter la tonte de dorsale fourrure avec des ciseaux électriques équipés d'une tête préparatoire chirurgicale 0,25 mm (Fisher Scientific). De préférence, utiliser un seul type d'anesthésie (par exemple, la kétamine / xylazine) pour minimiser les risques de surdose d'anesthésique. La chambre d'inhalation saturé comporte des risques au travail lorsqu'il est utilisé en dehors d'une hotte et fournit des quantités inconnues de l'anesthésie des animaux. Idéalement, un vaporisateur de précision doit être utilisé.
2. Pour supprimer résiduelle chaume de cheveux, traiter les animaux avec un dépilatoire chimique. Administrer une anesthésie à l'animal par une injection ip de la kétamine à 40 mg / kg de xylazine et 4 mg / kg
3. Lorsque les animaux sont anesthésiés de façon adéquate (à en juger par pincement de l'orteil), appliquer une quantité doigt de taille de crème dépilatoire à cisaillé peau du dos à l'aide d'un doigt ganté. Frottez la crème dans la peau pendant 30-60 secondes ou jusqu'à ce que les poils sont clairement visibles dans la crème comme il est déplacé. Laissez la crème sur que pour le montant minimum de temps nécessaire pour l'épilation comme l'exposition prolongée conduit à la combustion chimique de la peau, l'éclatement de l'épiderme et de la mort de la perte de l'intégrité de l'épiderme.
4. Essuyez la peau du dos avec des tampons de gaze imbibée d'eau jusqu'à ce que toutes les crèmes a été supprimé. Animaux à sec utilisant des serviettes en papier doux, et leur permettront de récupérer dans un endroit isolé chaud (par exemple cages propres placés sur un coussin chauffant). Épiler les animaux un par un et suivre de près tout au long de la procédure.

3. L'administration topique de la forskoline ou de contrôle des véhicules

1. Les animaux doivent être traités un à la fois. Anesthésier brièvement à inhalerd isoflurane en plaçant la souris au-dessus d'un filtre en nylon perméable à l'air de forme équipée en vertu de laquelle a été placé un papier essuie-isoflurane saturé dans un bocal en verre avec couvercle clair isoflurane saturé dans une hotte. Exposer la souris à l'isoflurane pendant un temps suffisant pour supprimer les mouvements musculaires volontaires mais aussi pour préserver la respiration spontanée (typiquement 10-20 sec). Laissant l'animal dans l'isoflurane trop longtemps se traduira par la suppression respiratoire et la mort. Il est préférable de pécher par excès de «lumière qui" et d'avoir à ré-exposer la souris brièvement plus isoflurane plutôt que de sur-exposer l'animal à la mort de la drogue et les risques.
2. Retirer l'animal de la chambre de l'isoflurane et le placer sur un tapis de banc absorbant propre.
3. Avec une micropipette 1000 pi équipé d'une pointe de polypropylène à usage unique, établir 400 ul de 40% d'extrait de forskoline brut (animaux de contrôle du véhicule recevront 70% d'éthanol, 30% de propylène glycol seul).
4. Transvaser l'extrait sur ledos de l'animal par égouttement il sur la peau, puis, à l'aide du côté de la pointe de la pipette, appliquer l'extrait sur la peau du dos jusqu'à ce que toute la peau a été couvert. Il n'est pas nécessaire d'effacer la peau après application.
5. Retour de la souris dans sa cage, et observer attentivement jusqu'à ce qu'il récupère de l'anesthésie.
6. Afin que les effets de l'AMPc non pigments ne doivent pas confondre expériences de sensibilité UV, arrêter tous les traitements topiques deux jours avant l'exposition aux UV (effet de pigment dure plusieurs jours au-delà dernier traitement topique).

4. Couleur de la peau de mesure par colorimétrie réfléchissant

1. Anesthésier brièvement la souris avec de l'isoflurane en inhalation (voir ci-dessus).
2. Calibrer un colorimètre Minolta en plaçant la tête portable sur la surface blanche standard fourni avec le colorimètre.
3. Placez la tête de mesure portable de la chasse du colorimètre avec la peau du dos de l'animal assurer que le cycle apertur 1 cm ²e est complètement enfoncé sur la peau. Prenez au moins trois mesures distinctes dans différents domaines de la peau du dos.
4. Calculer moyenne L * Partition ± SD par animal et par groupe de traitement. Colorimétrie réfléchissante peut se faire à n'importe quel moment dans l'expérience.

5. Détermination de la sensibilité aux UV par calcul de "Minimal érythémateuse Dose" (MED)

1. Utiliser des animaux qui ont été pré-traitées avec le véhicule ou la forskoline comme décrit ci-dessus. Anesthésier les animaux avec une injection intrapéritonéale d'un mélange standard de kétamine et de xylazine (voir ci-dessus).
2. Préparer un morceau de ruban adhésif occlusif-UV pour les tests MED. Pour générer des trous dans la bande, utilisez une perforatrice de grande puissance avec une découpe circulaire 1 cm ² (Figures 2A et B). Ayant des trous d'une taille définie et la disposition symétrique dans la bande facilite la reconnaissance de modifications de la peau après irradiation. Sur chaque trou dans la bande, appliquer une petite mais facilement détachable pièce de ruban qui peut être retiré à des instants définis pendant l'exposition aux UV pour permettre l'administration de différentes doses d'UV.
3. Lorsque les animaux sont suffisamment sédation, placez le ruban sur la surface dorsale. lubrifiant des yeux doit toujours être utilisée sous anesthésie.
4. Allumez la source UV composé de deux Westinghouse F15T8UV-B lampes avec une puissance de pointe de 313 nm et une gamme de 280-370 nm. Laissez la lampe à s'équilibrer à une sortie d'UV constante telle que mesurée par un photomètre UV avec un capteur de rayons UVB (faut généralement quelques minutes pour les lampes à réchauffer).
5. Sur la base de la vitesse de transmission des UV, tel que mesuré par le photomètre UV, UV calculer le temps d'exposition pour chaque dose désirée. Par exemple, UVB mesures de sortie de notre lampe de 2,4 mW / cm ^2. Par conséquent, l'administration de 5 kJ / m ^2, la peau aurait besoin d'être exposé à 208 sec (qui est de 3 min et 28 s) de rayonnement UVB, tel que calculé ci-dessous:
   upload/50670/50670eq1.jpg "/>
6. Placez les animaux sous sédation (chacune avec bande occlusif en place) ventrale de surface vers le bas pour assurer une exposition même UV. Pour administrer les doses choisies de rayonnement UV, retirer successivement les petites bandes occlusifs couvrant les trous d'exposer 1 cm ² zones de peau à des doses correctes de rayonnement. Par conséquent, en utilisant l'exemple ci-dessus, si 40 kJ / m ² est la plus grande dose dans l'expérience, alors que l'animal serait sous la lampe à 27 min et 47 sec total de la peau et dans la condition de 40 kJ / m ² n'aurait pas d' bande recouvrant tout le temps. Cependant, la bande recouvrant la condition 5 kJ / m ² serait supprimé quand il ya 208 sec restant dans l'exposition. Moment de retrait de la bande doit être fait pour que chaque état se termine en même temps.
7. Après l'exposition aux UV, ôtez la pellicule de la peau du dos, en prenant soin de ne pas déchirer la peau avec des mouvements brusques ou trop énergiques. Placer les animaux dans un endroit calme au chaud pour permettrerécupération de l'anesthésie.
8. Surveillance de la souris pendant 24-48 heures à chercher des zones discrètes de l'érythème (rougeur) ou œdème (gonflement) correspondant à des sites anatomiques exposés à la dose spécifique de l'irradiation UV. Documenter les résultats de la peau photographiquement.
9. MED valeur correspond à la dose minimale d'UV qui provoque une inflammation telle que définie par un érythème et / ou d'œdème de l'ensemble du cercle de peau exposée. Notez que la pigmentation de la peau peut contester la détermination de MED, cependant, un érythème et un oedème peuvent encore généralement être évalués avec précision, grâce en partie à la forme définie des ouvertures dans la bande pendant l'exposition aux UV.

6. Analyse statistique

Analyser les données entre les cohortes de souris par une ANOVA avec post-test de Bonferroni (Graph Pad PRISM). Des valeurs de p <0,05 sont considérées comme statistiquement significative.

Résultats

Souris C57BL / 6 ont été générées sur un fond eumelanotic, pheomelanotic ou amélanotiques intégrant le transgène K14-SCF comme décrit (figure 1A). Cohortes d'extension à la peau claire (Mc1r ^{e / e,} Tyr ^{+ / +)} souris ont été traitées par voie topique avec deux doses quotidiennes de véhicule (70% d'éthanol, 30% de propylène glycol) ou 40% d'extrait de coleus brut forskohlii racine (80 uM par dose) pendant 5 jours (Figure ...

Discussion

En utilisant un modèle animal de l'être humain à la peau claire, nous constatons que l'application topique d'un extrait brut racine forskoline riche s'assombrit robuste l'épiderme en stimulant la production de mélanine dans la peau. Mélanisation épidermique est dépendante de l'expression du facteur de cellules souches dans l'épiderme basales, comme cela se produit dans la peau humaine, mais pas dans la peau non modifiée génétiquement souris. La peau dorsale de souris génétiqueme...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Coleus Forskoli extract 20%	Buckton Scott USA Inc.	n/a	Princeton, NJ
Isothesia, Isoflurane , USP	Butler Schein	NCD 11695-6776-1	Dublin, OH, USA
Xylazine	Anased Injection	LA04612	Shenandoah, Iowa, USA
Ketamine HCl, USP	Putney	NDC 26637-411-01	St. Joseph, MO, USA
Ethanol	Decon Labs.	2705
Propylene glycol	Adesco	05751L	Solon, OH, USA
Depilatory cream, Nair	Church Dwight	JF-11 4381322	Priceton, NJ
EQUIPMENT
Germicidal Hg Lamp UV-B	Westinghouse	F15T8UV-B
Radiometer photometer	International light	1LT400A	Peabody, MA,USA
Chromameter	Konica Minolta	CR-400	Ramsey, NJ, USA
Data Processor for Chromameter CR-400	Konica Monilta	DR-400	Ramsey, NJ, USA