Vaccinia Virus Reporter para cuantificar la función viral en todas las etapas de la Expresión Génica

Resumen

Se describe el uso de un virus vaccinia reportero fluorescente que permite la medición en tiempo real de la infectividad viral y la expresión génica a través de la expresión de etapa específica de fluoróforos espectralmente distintos reportero. Nos detalle un método basado en la placa para identificar con precisión la etapa en la que la replicación del virus se ve afectada en respuesta a la inhibición pequeña molécula.

Resumen

Los poxvirus son una familia de virus de ADN de doble cadena que incluyen patógenos humanos activos tales como viruela de los monos, molusco contagioso, y virus de Contagalo. La familia también incluye el virus de la viruela, de la viruela. Debido a la complejidad de la replicación del virus de la viruela, aún quedan muchas preguntas con respecto a su estrategia de la expresión génica. En este artículo se describe la conceptualización y el uso de los virus vaccinia recombinantes que permiten la medición en tiempo real de las etapas individuales y múltiples de la expresión génica viral en un formato de alto rendimiento. Esto es posible mediante el uso de proteínas fluorescentes espectralmente distintas como reporteros para cada una de tres etapas de la replicación viral. Estos virus ofrecen una alta relación señal-ruido al tiempo que conserva los patrones de expresión específicos de la etapa, los ensayos basados ​​en la placa de habilitación y observaciones microscópicas de la propagación del virus y la replicación. Estas herramientas tienen usos para el descubrimiento antiviral, los estudios de la interacción virus-huésped, y la bio evolutivología.

Introducción

Tradicionalmente, la expresión del virus se estudia el uso de técnicas de biología molecular (por ejemplo, transferencia de Northern, Western Blot, microarrays de hibridación, etc) ^1. Si bien estos métodos son capaces de proporcionar información detallada con respecto a los cambios de expresión de ARNm o proteínas individuales categorizar, por lo general no son susceptibles de procesos en tiempo real y de alto rendimiento. Los enfoques alternativos que utilizan los periodistas basados ​​en fluorescencia se han aplicado anteriormente al trabajar con poxvirus; Sin embargo, su desarrollo y su uso ha sido motivado por diversos objetivos. Varios de tales métodos se diseñaron para la selección de virus recombinantes ^2,3. Estas técnicas expresan EGFP después de la incorporación y expresión del ADN exógeno a partir de clones de vaccinia recombinantes adecuada. Del mismo modo, varias cepas de vaccinia que expresan establemente EGFP solubles o proteínas GFP-etiquetados expresadas bajo un promotor de vaccinia nativo han sido ampliamente utilizados. Estos son typcamente utiliza para cuantificar la entrada del virus y la replicación durante los ensayos de neutralización a base de anticuerpos, inhibición química, o la comparación de la eficacia antiviral ^4-6. Si bien estos virus han demostrado ser útiles, están limitados en su capacidad para proporcionar información detallada sobre el punto de inhibición debido a su uso de un único promotor viral temprano / tardío ambigua. Los métodos anteriores también han hecho uso de la proteína EGFP con características óptimas de señal a ruido.

Debido a la complejidad de la replicación del virus de la viruela y la falta de herramientas existentes disponibles para ensayar los cambios en tiempo real en la expresión génica viral, hemos desarrollado una serie de virus reportero sola etapa y de múltiples ^7,8. Como se ha descrito en publicaciones anteriores, estos virus expresan uno, dos, o tres proteínas fluorescentes espectralmente distintos promotores de vaccinia nativos durante principios, etapas intermedias o tardías de la infección. Estos virus pueden ser nosotrosed como indicadores de progreso de la replicación del virus utilizando un microscopio de fluorescencia y son igualmente adecuados para los ensayos de placa-y-lector basado en alto rendimiento. Estos virus son fáciles de usar en lugar del virus de tipo salvaje, creciendo con una cinética similar para alcanzar títulos equivalentes ^7. Durante la planificación y creación de estos virus, mucho se tuvo cuidado en la selección de fluoróforos que tienen altas características de señal a fondo con la eficiencia de plegado superiores para facilitar la cuantificación fiable con retroalimentación rápida a los cambios en la expresión (Venus, mCherry y TagBFP). Además, se eligieron combinaciones de promotores virales que producen alta fidelidad, inequívoca expresión-etapa específica, el suministro de información sobre la gama completa de temprana (promotor C11R), intermedio (promotor G8R) y tardía (promotor F17R) la expresión de genes, en contraste con ambigua principios / finales de los promotores.

Estos virus pueden ser utilizados como una herramienta para la investigating el ciclo de vida del virus de la viruela, virus de la vacuna prototípica. Gran parte todavía no se sabe acerca de la interacción huésped-virus a pesar de su larga historia de estudio. Vaccinia es complejo, produciendo más de 200 proteínas únicas, muchas de las cuales son inmunomoduladores y albergan antagónica. Tras la infección, el virus vaccinia se inicia inmediatamente la transcripción de ARNm temprano. Esto es facilitado por una ARN polimerasa y los factores de transcripción que se cargaron en el genoma viral durante el envasado del virión y se mantienen en un estado de pausa hasta que la infección subsiguiente. Esta expresión temprana produce principalmente proteínas necesarias para la supresión del sistema inmune del huésped (ARNm decapping, el secuestro de dsRNA, y las proteínas de los receptores de señuelo, así como inhibidores de la apoptosis, la respuesta al estrés, y peaje, IL, y la señalización de NF-kappa B) y la replicación del genoma. Expresión temprana también produce factores de transcripción necesarios para la expresión intermedia. Expresión intermedia incluye la expresión de factores de transcripción etapa tardía. Estecascada de expresión conduce a la producción de proteínas del virus estructurales y enzimáticas durante las etapas tardías de la infección, que son necesarios para el montaje completo de la vaccinia virion maduro.

Nuestro conjunto de virus reportero fluorescentes permite un rápido progreso que se hará en la comprensión de la biología de los poxvirus. Uno de los métodos más comunes y que requieren mucho tiempo en el campo de la virología es el ensayo de crecimiento. Normalmente, esto implica la infección de células, la promulgación de una serie de tratamientos, el virus de la cosecha mediante la lisis de las células infectadas, y cuantificar el título viral resultante mediante ensayo en placa. Uso de los virus descritos aquí reportero permite la medición en tiempo real de crecimiento del virus que puede ser ensayada y se comparó entre los numerosos tratamientos realizados en paralelo fácilmente. Prevemos este conjunto de reactivos se utiliza en diversos protocolos para la identificación de alteraciones en la expresión génica viral en respuesta al tratamiento con fármacos, el ARNi knockdown o restricción gama de huéspedes.

Este método también permite el análisis de alto contenido en una escala mayor que la disponible anteriormente, lo que permite alto rendimiento pantallas de drogas antivirales para las etapas de destinatarios definidos específicamente-de interés. Aunque se han identificado numerosos tratamientos potenciales para combatir la infección por poxvirus, el único aprobado por la FDA terapias eficaces para el tratamiento de la infección por virus de la viruela son el nucleósido acíclico fosfonato, cidofovir, y el tratamiento con la vacuna inmune ^9,10 globulina. A pesar de la erradicación de la viruela en 1977 ^11, poxvirus siguen siendo una amenaza considerable para la salud humana ^12. El cese de la vacunación generalizada contra el virus de la viruela ha llevado a un aumento de la susceptibilidad a otros poxvirus ^13. Por ejemplo, las regiones de África central que antes estaban protegidos por la vacunación están experimentando un aumento de las infecciones por virus del simio ^14. Preocupación significativa también ha sidoplanteadas en relación con la susceptibilidad latente para la liberación intencional de virus de la viruela. Debido a las terapias limitadas disponibles actualmente, existe una necesidad urgente para el desarrollo de nuevos tratamientos. Estos virus informadores permiten la detección inhibidor de molécula pequeña rápida y de alto rendimiento para la inhibición de una etapa específica de la replicación viral. Identificación de inhibidores dirigidos a las etapas de expresión viral en la actualidad no es el objetivo de la inhibición facilitará el desarrollo de las terapias combinadas con una mayor potencia.

Mucho se puede extraer acerca de la biología celular de la vacuna mediante la observación de los cambios en la expresión génica de cada etapa. Atenuación por manipulación química o genética de una célula huésped infectada se expresa normalmente en términos de reducción de los títulos virales. Sin embargo, mediante la comparación de los cambios en cada etapa de la cascada de expresión viral, se puede obtener una comprensión más completa de cómo la aptitud virus es impactoed por un tratamiento en particular. Estos datos han sido demostrado que se correlaciona bien con la salida de título de virus tradicional, pero proporcionar información mecanicista más detallada, así como capacidades de alto rendimiento ^7.

Protocolo

1. Células de la placa

1. Disociar las células HeLa de la placa y se diluye en medio de crecimiento (DMEM, 2 mM de L-superabundancia, 10% de FBS) a aproximadamente 2,0 x 10 ⁵ células / ml. Dispense 100 l / pocillo en una placa de negro-amurallado, clara de fondo plano de 96 pocillos (20.000 células / pocillo).
2. Se incuban las células durante 24 horas hasta la confluencia en un incubador de 37 º C + 5% de CO _2.

2. Infectar células

1. Diluir el virus e infectar las células.
   1. Descongele TRPV (virus Triple; Early Venus, Intermedio mCherry, Abierto TagBFP) y PLV (promotor de menos Venus) virus fluorescente y desagregar utilizando sonicación durante 5 minutos. Alternativamente, las reservas de virus en bruto se pueden mezclar 1:1 con 0,25 mg / ml de tripsina en los medios de comunicación de infección y se incubaron a 37 ° C durante 30 min.
   2. Diluir las reservas de virus crudo en 37 ° C medios de infección (DMEM, 2 mM L-superabundancia, 2% de SFB). Para las infecciones de alto MOI (10 UFP / célula), diluir de virus a 1,0 x 10 ⁷ PFU / ml suponiendo 5 x 10 ⁴células / pocillo y un volumen de inóculo de 50 l. Plan de infectar en 3 pocillos replicados para cada tratamiento con TRPV y otros 3 pocillos replicados para el mismo tratamiento con PLV para tener en cuenta la fluorescencia de fondo específica para cada tratamiento.
   3. Infectar pozos mediante la adición de 50 l / pocillo diluida virus en medios de infección. Esta se define como la infección por el tiempo = 0 h después (0 hpi).
2. Diluir compuestos deseados del tratamiento en los medios de comunicación de infección. Para todos los tratamientos se debe hacer un único maestro dilución mezcla 2x y se aplicó a pocillos por duplicado (por ejemplo, 350 l de volumen total de seis de 96 pocillos con 50 l cada uno).
   1. Diluir compuestos experimentales en los medios de comunicación de infección.
   2. Diluir-control del vehículo disolvente (por ejemplo, PBS, DMSO) en los medios de la infección. Nota: Las concentraciones finales similares de disolventes de control del vehículo deben utilizarse conforme a lo solicitado compuestos experimentales (por ejemplo, si sus acciones IBT se hace con DMSO y se utiliza a una concentratio definitivans de 1 l / ml, a continuación, utilizar DMSO solo a 1 mu l / ml como el control del vehículo).
   3. Diluir compuestos de control en los medios de comunicación de infección. Compuestos de control recomendados incluyen: 3,6 M (1 mg / ml) 1-β-D-arabinofuranosilcitosina (AraC), 50 M (11,7 g / ml) isatina β-tiosemicarbazona (IBT), 60 M (50 g / ml) rifampicina, o 5 M (1,9 g / ml) ST-246 ^8,15,16. Ver Resultados representante para efectos esperados. Nota: asegúrese de esta dilución en dos veces (2x) la concentración final deseada ya que este se añade en una proporción de 1:1 para el volumen ya en el pozo.
3. Inmediatamente después de la adición del virus, añadir 50 l que contenía medios de infección tratamientos deseados y los controles, se diluye en el paso 2.2. Nota: Para ensayar para la inhibición de la expresión antes de etapa temprana, el compuesto (s) puede ser agregada bien directamente al inóculo de virus diluido (etapa 2.1.2) o a las células huésped antes de la infección (antes de la etapa 2.1.3).
4. Incubar 6-24 horas en un 37 & #176; incubadora a + 5% de CO _2.

3. Fijar Celdas

1. Fijar las células mediante la adición de 100 l 8% de paraformaldehído a los medios de comunicación ya la infección en cada pocillo. Se incuba a temperatura ambiente durante 15 min protegidos de la luz. Nota: Se recomienda añadir PFA 2x (8%) directamente a los medios de comunicación para prevenir la infección por aerosolización de vaccinia infecciosa que puede ocurrir si los medios de comunicación de alto título se invierte directamente en la fuente de residuos antes de la fijación.
2. Quite el fijador invirtiendo la placa en el plato de residuos.
3. Añadir 100 l de PBS temperatura ambiente.
4. Sellar la placa con película adhesiva ópticamente transparente. Nota: Las placas pueden guardarse a 4 º C si no se lee inmediatamente. Asegúrese de volver placas selladas a temperatura ambiente antes de la lectura para evitar la condensación de distorsionar las mediciones del espectrómetro.

4. Cuantificar el crecimiento del virus

1. Medir la fluorescencia de punto final a 515:530 para Venus, 587:610 para mCherry y 415:457 fo TagBFP (Excitación: longitud de onda de emisión en nm). Cuatro mediciones deben ser promediados por pocillo usando ajustes de ganancia óptimos para cada canal. Nota: La longitud de onda de emisión apropiado puede ser diferente en función de los modelos y de filtro características específicas de su lector de placas. Esto se puede determinar empíricamente mediante la realización de una exploración de longitud de onda de emisión para determinar el punto donde existe la mayor diferencia entre TRPV y PLV para cada canal.
2. Normalizar los datos en bruto para facilitar la comparación entre los experimentos.
   1. Para cada canal, determinar la media de TRPV réplica y pozos PLV.
   2. Restar las mediciones de fondo infectadas por el PLV medias de las mediciones experimentales infectados-TRPV medios para cada tratamiento.
   3. Normalizar los datos dividiendo cada fondo restado valor por el valor del vehículo sólo así.
   4. Una vez que un experimento ha sido repetido varias veces, un análisis unidireccional de la varianza (prueba de ANOVA de una vía) y múltiples COMPARACIÓN después de la prueba se puede realizar para determinar si cualquiera de los tratamientos refleja una diferencia estadísticamente significativa del tratamiento-vehículo sólo para cada canal.

. 5 Protocolo Alternativo: Ensayos de placas cinético

1. Realice todos los pasos a través de la adición de los tratamientos (paso 2.3).
2. Placa de sello con lámina adhesiva y colocar en la cámara lector de placas equilibró a 37 º C. Nota: El cuidado especial se debe tomar para mantener las placas constantemente a 37 º C para evitar el estrés celular y la condensación excesiva. Para los ensayos cinéticos, es particularmente importante usar un medio tamponado (bicarbonato sódico y HEPES) para mantener el pH adecuado sin la adición de 5% de CO _2.
3. Lector Set placa ganar manualmente para evitar la saturación de los puntos de tiempo posteriores. Nota: la optimización de la ganancia exacta se puede obtener mediante la realización de un análisis de punto final, en condiciones similares.
4. Adquirir valores horarios de 8 a 24 hpi y normalizar el uso de simiprocedimiento lar como en el ensayo de punto final (paso 4.2).
5. Puntos de tiempo individuales pueden ser analizados para la significación estadística usando métodos similares como el ensayo de punto final descrito anteriormente.

Resultados

Como un ejemplo de la utilización típica de estos virus, se utilizó el virus de triple fluorescencia de reportero para comparar el punto de la inhibición de varios inhibidores de poxvirus bien definidos.

Las células HeLa se colocaron en placas en cultivo de tejidos claros placas de 96 pocillos de fondo plano de paredes negras tratadas y se incubaron durante la noche. Monocapas confluentes fueron infectadas a una multiplicidad de infección (MOI) de 10 utilizando virus reportero triples ...

Discusión

Aquí, hemos descrito el uso práctico de un multi-etapa reportero virus vaccinia (TRPV), que proporciona medidas de retroalimentación en tiempo real reproducibles de la replicación del virus. Mediante el uso de inhibidores de poxvirus bien definidos, hemos sido capaces de demostrar que TRPV responde de una manera consistente con el mecanismo entendido de acción para cada inhibidor. Mientras que el virus TRPV proporciona la información más completa acerca de la progresión de la fase de virus, de dos etapas (iRev, ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065
Fetal Bovine Serum - Optima, Heat Inactivated (FBS)	Atlanta Biologicals	S12450H
200 mM L-Glutamine, (L-glut)	Gibco	25030-081
96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates	Corning	3603
384 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates	Corning	3712
Trypsin, 2X, Sterile, Irradiated	Worthington Biochemical Corp.	TRLVMF
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-023
Dimethyl Sulfoxide, Cell Culture (DMSO)	American Bioanalytical	AB03091
1-β-D-Arabinofuranosylcytosine  (AraC), MW= 280 g/mol	SigmaAldrich Co	C6645
isatin β -thiosemicarbazone (IBT), MW= 234 g/mol	Fisher Scientific	NC9075202
Rifampicin, MW= 823 g/mol	SigmaAldrich Co	R3501
ST-246, MW= 376 g/mol	SIGA Labs, Corvallis, OR
8% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	157-8
TempPlate RT optically clear film	USA Scientific	2978-2700
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Gibco	31985-070