Коровьей оспы Reporter Вирусы для Количественная Вирусный функции на всех этапах экспрессии генов

Резюме

Мы описываем использование флуоресцентного репортера вируса коровьей оспы, который позволяет в режиме реального времени измерения вирусной инфекционной и экспрессии генов через выражение стадии конкретных спектрально различных репортеров флуорофорами. Мы подробно метод пластина основе для точного определения стадии, на которой репликация вируса поражается в ответ на небольшой торможения молекулы.

Аннотация

Поксвирусы представляют собой семейство двухцепочечной ДНК вирусов, которые включают активные человеческих патогенов, таких как обезьян, моллюск contagiousum и вирус Contagalo. Семья также включает в себя вирус оспы, оспы. Из-за сложности поксвирусной репликации, многие вопросы все еще остаются относительно их стратегии экспрессии генов. В этой статье мы расскажем концептуализации и использование рекомбинантных вирусов осповакцины, которые позволяют в режиме реального времени измерения одного и нескольких стадиях вирусной экспрессии генов в формате высокой пропускной. Это возможно за счет использования спектрально различных флуоресцентных белков в качестве репортеров для каждой из трех стадий репликации вируса. Эти вирусы обеспечивают высокую отношение сигнал-шум, сохраняя при этом характер экспрессии этапе, позволяющие плиты на основе анализов и микроскопические наблюдения размножения вируса и репликации. Эти инструменты имеют использует для противовирусной открытия, исследования вируса-хозяина взаимодействия, и эволюционной биология.

Введение

Традиционно, выражение вирус изучается с помощью молекулярных методов (например, северная блоттинга, вестерн-блоттинга, микрочипов гибридизации, и т.д.) Биология ^1. Хотя эти методы способны обеспечить подробную информацию относительно классификации изменений экспрессии отдельных мРНК или белков, они, как правило, не поддаются реального времени и высокой пропускной процессов. Альтернативные подходы с помощью флуоресцентной основе журналистам были применены ранее при работе с поксвирусов; Однако, их развитие и использование, был мотивирован разнообразных целей. Несколько таких методов были разработаны для отбора рекомбинантных вирусов ^2,3. Эти методы выразить EGFP при правильном включении и экспрессии экзогенной ДНК из рекомбинантных коровьей клонов. Аналогичным образом, несколько штаммов вируса осповакцины, стабильно экспрессирующие растворимый EGFP или GFP с метками белки, экспрессированные под нативного промотора коровьей оспы были широко использованы. Это типчески используется для количественной запись вируса и репликации во время на основе антител нейтрализации анализов, химическую ингибирование, или сравнение противовирусной эффективности ^4-6. В то время как эти вирусы оказались полезными, они ограничены в своей способности обеспечить подробную информацию о точке торможения из-за их использования одного неоднозначного начале / конце вирусного промотора. Предыдущие методы также использовали EGFP белка с субоптимальными сигнал-шум характеристик.

Из-за сложности поксвирусной репликации и отсутствием существующих инструментов, доступных для анализа изменений в режиме реального времени в экспрессии вирусных генов, мы разработали набор одно-и многоступенчатый репортер вирусов ^7,8. Как описано в предыдущих публикациях, эти вирусы выразить один, два, или три спектрально различных флуоресцентных белков из родных промоутеров коровьей во время рано, промежуточные или поздно этапы инфекции. Эти вирусы могут быть намред качестве индикаторов прогресса репликации вируса с помощью флуоресцентного микроскопа, и они одинаково хорошо подходит для высокой пропускной пластина-и-ридер на основе анализов. Эти вирусы очень легко использовать вместо вируса дикого типа, растет с аналогичными кинетики достичь эквивалентные титры ^7. В ходе планирования и создания этих вирусов, гораздо внимание было уделено в выборе флуорофоры, которые имеют высокий сигнал-фон характеристики с превосходной эффективности складной для облегчения надежную количественную с быстрым обратной связи с изменениями в выражении (Венера, mCherry и TagBFP). Кроме того, комбинации вирусных промоутеров были выбраны, которые производят высокую точность, однозначное выражение этап конкретных, предоставляя информацию о полном диапазоне рано (C11R промоутер), промежуточный (G8R промотор) и поздний (F17R промоутер) экспрессию генов, в отличие от неоднозначной ранний / поздний промоторы.

Эти вирусы могут быть использованы в качестве инструмента для INVEstigating жизненный цикл прототипа поксвирусной, вирус коровьей оспы. Многое до сих пор не известно о хозяине-вируса взаимодействия, несмотря на свою долгую историю изучения. Коровьей оспы является сложной, выпускающее более 200 уникальных белков, многие из которых являются иммуномодулирующее и принимающих антагонистическими. При заражении вирус коровьей оспы немедленно начинает транскрипцию мРНК раннее. Этому способствует РНК-полимеразы и транскрипционных факторов, которые были загружены на вирусного генома в ходе вириона упаковки и не состоявшихся в приостановленном состоянии до последующей инфекции. Это раннее выражение в основном производит белки, необходимые для подавления иммунной системы хозяина (мРНК decapping, секвестрации дцРНК, и приманки рецепторных белков, а также в качестве ингибиторов апоптоза, реакции стресс, и Toll, IL, и сигнализации NF-kB) и геном репликации. Рано выражение также производит транскрипционные факторы, необходимые для промежуточного выражения. Промежуточный выражение включает экспрессию конце факторов этап транскрипции. Этовыражение каскад приводит к производству структурных и ферментативных белков вируса на поздних стадиях инфекции, которые необходимы для полной сборки зрелого коровьей оспы вириона.

Наш набор флуоресцентных репортер вирусов позволяет быстро добиться прогресса в понимании поксвирусной биологии. Один из наиболее распространенных и трудоемких методов в области вирусологии является анализ роста. Это обычно включает инфицировать клетки, принятие ряд процедур, вирус уборочной лизированием инфицированные клетки, и количественной полученный титр вируса на бляшек. Использование репортерных вирусы, описанные здесь позволяет в режиме реального времени измерение роста вируса, который может быть легко проанализированы и сравнены между многочисленных процедур, выполняемых параллельно. Мы предполагаем этот набор реагентов будет использоваться в различных протоколов для определения изменений в экспрессии вирусного гена в ответ на обработку препарата, RNAi кnockdown или диапазон хозяин ограничение.

Этот метод также позволяет проводить анализ высокого содержания в большем масштабе, чем ранее доступные, что позволяет с высокой пропускной противовирусных лекарств для экранов конкретно определенных целевых стадий интерес. В то время как многочисленные потенциальные обработки по борьбе поксвирусной инфекции были выявлены, только FDA одобрило терапии эффективные для лечения поксвирусной инфекции являются ациклические фосфонатный нуклеозид, Цидофовир, и лечение с иммуноглобулин коровьей оспы ^9,10. Несмотря на ликвидации оспы в 1977 году ^11, поксвирусы остаются серьезной угрозой для здоровья человека ^12. Прекращение широкого вакцинации против вируса натуральной оспы привело к повышенной восприимчивости к другим поксвирусов ^13. Например, регионы Центральной Африке ранее защищенные вакцинации переживают всплеск вирусных инфекций Обезьянья ^14. Значительное беспокойство также был, заданный в отношении скрытой предрасположенности к преднамеренного высвобождения вируса натуральной оспы. В связи с ограниченностью методов лечения в настоящее время, существует настоятельная потребность в разработке новых методов лечения. Эти вирусы репортер позволяют быстро и высокопроизводительного скрининга малую молекулу ингибитора для ингибирования определенной стадии вирусной репликации. Идентификация ингибиторов, предназначенных вирусные этапы экспрессии в настоящее время не является целью торможения будет способствовать развитию комбинированной терапии с повышенной эффективностью.

Многое можно почерпнуть о биологии коровьей оспы клеток, наблюдая изменения в экспрессии генов для каждого этапа,. Ослабление в химической или генетической манипуляции с инфицированной клетки-хозяина, как правило, выражается в виде сокращения вирусных титров. Тем не менее, путем сравнения изменения в каждой стадии вирусной экспрессии каскада, можно получить более полное понимание того, как вирус подготовка является воздействиеред конкретным лечения. Эти данные, как было показано, хорошо коррелирует с традиционным выхода титра вируса, но предоставить более подробную информацию механистическую, а также высокой пропускной способности ^7.

протокол

1. Пластина клеток

1. Диссоциируют HeLa клетки от пластины и разбавленной в питательной среде (DMEM, 2 мМ L-избытком, 10% FBS) в приблизительно 2,0 × 10 ⁵ клеток / мл. Внесите 100 мкл / лунку в черном стенками, ясный плоским дном 96-луночный планшет (20000 клеток / лунку).
2. Инкубируйте клетки в течение 24 часов, пока сливной в инкубаторе 37 ° C ± 5% СО _2.

2. Инфицировать клетки

1. Развести вирус и заразить клетки.
   1. Оттепель TRPV (Трехместный вирус; Рано Венера, средний mCherry, поздний TagBFP) и PLV (Промоутер-менее Венера) люминесцентные вирус и разбивке помощью ультразвука в течение 5 минут. Альтернативно, сырой запасов вируса могут быть смешаны с 1:01 0,25 мг / мл трипсина в средах инфекции и инкубировали при 37 ° С в течение 30 мин.
   2. Развести сырой запасами вируса в 37 ° C инфекции СМИ (DMEM, 2 мм L-перенасыщения, 2% FBS). Для высоких инфекций МВД (10 КОЕ / клетку), разбавить вирус запас до 1,0 х 10 ⁷ PFU / мл предполагая 5 х 10 ⁴клеток / лунку и объем инокулят 50 мкл. План на заражение 3 дублирующие лунки для каждой обработки с TRPV и еще 3 повторных скважин для такой же обработке с PLV для учета фоновой флуоресценции, характерные для каждой обработки.
   3. Infect скважин путем добавления 50 мкл / лунку вирус с разведением в средах инфекции. Это определяется как время = 0 ч после заражения (0 HPI).
2. Развести желаемых соединений лечения в инфекционных СМИ. Для всех процедур одного 2x мастер разбавления смесь должны быть сделаны и применяются для репликации скважин (например, 350 мкл Общий объем в течение шести 96 скважин с 50 мкл каждого).
   1. Развести экспериментальные соединения в инфекции СМИ.
   2. Развести транспортного средства управления растворителе (например, PBS, ДМСО) в инфекции массовой информации. Примечание: Подобные конечные концентрации транспортного средства контроля растворителей следует использовать применительно для экспериментальных соединений (например, если ваш IBT складе производится с ДМСО и использовали в конечной concentratioнс 1 мкл / мл, а затем использовать только ДМСО в 1 мкл / мл, как управления транспортным средством).
   3. Развести управления соединений в инфекции СМИ. Рекомендуемые соединения управления включают в себя: 3,6 мкм (1 мкг / мл) 1-β-D-арабинофуранозилцитозина (AraC), 50 мкм (11,7 мкг / мл) изатин β-тиосемикарбазон (IBT), 60 мкМ (50 мкг / мл) рифампицин, или 5 мкм (1,9 мкг / мл) ST-246 ^8,15,16. Смотреть Представитель результаты ожидаемых эффектов. Примечание: сделать этот раствор при дважды (2x) желаемой конечной концентрации с ней добавляют в соотношении 1:1 по объему уже в скважине.
3. Сразу после добавления вируса, добавить 50 мкл инфекции средах, содержащих желаемые процедуры и управления как разбавленный на шаге 2.2. Примечание: Для анализа на ингибирование экспрессии перед ранней стадии, соединение (ы) может быть добавлен непосредственно в разбавленном вируса инокулята (шаг 2.1.2) или к клеткам-хозяевам до заражения (перед стадией 2.1.3).
4. Выдержите 6-24 ч в 37 & #176, С-инкубатор + 5% СО _2.

3. Fix клетки

1. Fix клетки добавлением 100 мкл 8% параформальдегида в инфекции СМИ уже в каждую лунку. Инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин в защищенном от света. Примечание: Рекомендуется добавить 2x PFA (8%) непосредственно к инфекции СМИ для предотвращения аэрозолизации инфекционного вируса коровьей оспы, которые могут возникнуть, если высокого титра СМИ инвертируется непосредственно в сточных блюдо до фиксации.
2. Удалить фиксатор путем обращения пластину в блюдо отходов.
3. Добавить 100 мкл комнатной температуре PBS.
4. Уплотнение тарелку с оптически прозрачной клейкой пленкой. Примечание: Плиты можно хранить при температуре 4 ° С, если не прочитать немедленно. Будьте уверены, чтобы вернуться запечатанные листы до комнатной температуры, прежде чем читать, чтобы предотвратить конденсацию от искажения измерений спектрофотометра.

4. Количественная роста вируса

1. Измерьте конечной точки флуоресценцию 515:530 для Венеры, 587:610 для mCherry и 415:457 еили TagBFP (Возбуждение: Длина волны излучения в нм). Четыре измерения должны быть в среднем на лунку, используя оптимизированные настройки усиления для каждого канала. Примечание: Соответствующий длина волны излучения может отличаться в зависимости от конкретной модели и фильтров характеристик вашего ридере. Это может быть определено опытным путем, выполняя сканирование длины волны излучения для определения точки, где есть наибольшая разница между TRPV и PLV для каждого канала.
2. Нормализация необработанные данные, чтобы облегчить сравнение между экспериментами.
   1. Для каждого канала, определить среднее реплик TRPV и PLV скважин.
   2. Вычтите средние PLV-инфицированных фоновых измерений от средних TRPV-инфицированных экспериментальных измерений для каждой обработки.
   3. Нормализовать данные путем деления каждого фонового вычитается значение на значение для транспортного средства только хорошо.
   4. После того, как эксперимент был повторен несколько раз, односторонний дисперсионный анализ тест (односторонний ANOVA) и несколько грomparison пост-тест может быть выполнен, чтобы определить, если любой из методов лечения отражает статистически значимое отличие от лечения для транспортного средства только для каждого канала.

. 5 Альтернативный протокол: кинетические Plate Анализы

1. Выполните все шаги через добавлением лечения (шаг 2.3).
2. Печать пластина с клейкой пленкой и поставить в планшет-ридер камеры доведены до 37 ° С Примечание: Особое внимание должно быть принято, чтобы сохранить пластины последовательно при 37 ° С, чтобы предотвратить чрезмерную нагрузку клеток и образование конденсата. Для Кинетические анализы, это особенно важно использовать буферной среде (бикарбонат натрия и HEPES) для поддержания надлежащего рН без добавления 5% CO _2.
3. Набор планшет-ридере получить вручную, чтобы предотвратить насыщение поздних временных точках. Примечание: Точная оптимизация усиления может быть получена путем выполнения анализов конечных точек в аналогичных условиях.
4. Приобретать почасовые показания для 8-24 HPI и нормализовать с помощью аналогичПроцедура LAR как в конечной точке анализа (шаг 4.2).
5. Точки индивидуального времени могут быть проанализированы на статистическую значимость с использованием аналогичных методов, как описано ранее конечной точки анализа.

Результаты

В качестве примера в типичном использовании этих вирусов, вирус тройной флуоресценции-репортер был использован для сравнения точку торможения нескольких четко определенных ингибиторов поксвирусных.

HeLa клетки высевают в культуре ткани обрабатывали черные стенами чет...

Обсуждение

Здесь мы описали практического использования многоступенчатой ​​вакцины репортера вируса в (TRPV), что обеспечивает воспроизводимые в режиме реального времени меры обратной репликации вируса. С помощью четко определенных ингибиторов поксвирус, мы смогли показать, что TRPV отвечает в со...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065
Fetal Bovine Serum - Optima, Heat Inactivated (FBS)	Atlanta Biologicals	S12450H
200 mM L-Glutamine, (L-glut)	Gibco	25030-081
96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates	Corning	3603
384 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates	Corning	3712
Trypsin, 2X, Sterile, Irradiated	Worthington Biochemical Corp.	TRLVMF
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-023
Dimethyl Sulfoxide, Cell Culture (DMSO)	American Bioanalytical	AB03091
1-β-D-Arabinofuranosylcytosine  (AraC), MW= 280 g/mol	SigmaAldrich Co	C6645
isatin β -thiosemicarbazone (IBT), MW= 234 g/mol	Fisher Scientific	NC9075202
Rifampicin, MW= 823 g/mol	SigmaAldrich Co	R3501
ST-246, MW= 376 g/mol	SIGA Labs, Corvallis, OR
8% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	157-8
TempPlate RT optically clear film	USA Scientific	2978-2700
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Gibco	31985-070