Vaccinia-Viren Reporter zur Quantifizierung von Viral-Funktion auf allen Stufen der Genexpression

Zusammenfassung

Wir beschreiben die Verwendung eines fluoreszierenden Reporter Vaccinia-Virus, das Echtzeit-Messung der viralen Infektiosität und Genexpression ermöglicht durch die Stufe-spezifische Expression von spektral unterschiedlichen Fluorophoren Reporter. Wir detailliert ein plattenbasierte Verfahren zum genauen Identifizieren der Phase, in der die Virusreplikation in Reaktion auf kleine Molekül Inhibierung betroffen.

Zusammenfassung

Pockenviren sind eine Familie von Doppelstrang-DNA-Viren, die aktive menschliche Krankheitserreger wie Affenpocken, Dell contagiousum und Contagalo Virus enthalten. Die Familie umfasst auch die Pocken-Virus, Variola. Aufgrund der Komplexität des Pockenvirus-Replikation, bleiben noch viele Fragen hinsichtlich ihrer Genexpression Strategie. In diesem Artikel beschreiben wir die Konzeption und die Verwendung von rekombinanten Vaccinia-Viren, die Echtzeitmessung von einzelnen und mehrfachen Stufen der viralen Genexpression in einem Format mit hohem Durchsatz zu ermöglichen. Dies wird durch die Verwendung von spektral unterschiedlichen fluoreszierenden Proteine ​​als Reporter für jede der drei Phasen der Virusreplikation ermöglicht. Diese Viren einen hohen Signal-zu-Rausch-Verhältnis unter Beibehaltung Stufe spezifische Expressionsmuster, wodurch plattenbasierten Assays und mikroskopische Beobachtungen der Virus Vermehrung und Replikation. Diese Tools verwendet haben für antivirale Entdeckung, Studien der Virus-Wirt-Interaktion, und evolutionäre biologie.

Einleitung

Traditionell wird Virus-Expressions mit molekularbiologischen Techniken (zB Northern Blot, Western Blot, Microarray-Hybridisierung, etc.) ¹ untersucht. Diese Verfahren sind in der Lage, detaillierte Informationen in Bezug auf die Kategorisierung Expressionsänderungen der einzelnen mRNAs bzw. Proteine, sind sie typischerweise nicht zugänglich Echtzeit-und Hochdurchsatzverfahren. Alternative Ansätze mit Fluoreszenz-basierten Reporter haben bisher bei der Arbeit mit Pockenviren angewandt worden; hat jedoch ihre Entwicklung und Nutzung durch abwechslungsreiche Ziele motiviert. Mehrere solche Verfahren wurden zur Selektion von rekombinanten Viren ^2,3 entwickelt. Diese Techniken auszudrücken EGFP auf ordnungsgemäße Einbau und die Expression von exogener DNA aus rekombinanten Vaccinia-Klonen. Ebenso mehrere Vacciniastämme stabil exprimieren EGFP löslich oder GFP-markierten Proteine ​​unter einer nativen Vaccinia-Promotor exprimiert sind weit verbreitet. Diese sind typ.tisch verwendet werden, um das Eindringen von Viren und die Replikation während Antikörper-basierten Neutralisationstests, chemische Hemmung oder Vergleich der antiviralen Wirksamkeit ^4-6 quantifizieren. Obwohl diese Viren nützlich erwiesen haben, sind sie in ihrer Fähigkeit, Informationen über den Punkt der Inhibition durch ihre Nutzung eines einzelnen mehrdeutigen frühen / späten viralen Promotor bereitzustellen begrenzt. Bisherige Verfahren haben auch die Verwendung von EGFP Protein gemacht mit suboptimalen Signal-zu-Rauscheigenschaften.

Aufgrund der Komplexität des Pockenvirus-Replikation und der Mangel an vorhandenen Werkzeugen zur Verfügung, um Echtzeit-Änderungen in der viralen Genexpression zu untersuchen, haben wir eine Reihe von Einzel-und Mehrstufen-Reporter Viren ^7,8 entwickelt. Wie bereits in früheren Veröffentlichungen beschrieben, diese Viren Ausdruck ein, zwei, oder drei spektral unterschiedlichen fluoreszierenden Proteinen aus nativen Vaccinia-Promotoren in der frühen, mittleren oder späten Stadien der Infektion. Diese Viren können unsed als Indikatoren für die Virusreplikation Fortschritte mit einem Fluoreszenzmikroskop und die sie für Hochdurchsatz-Platte-basierte Assays Leser gleich gut geeignet sind. Diese Viren sind einfach anstelle des Wildtyp-Virus verwenden, wachsen mit ähnlichen Kinetik gleichwertige Titer ⁷ zu erreichen. Bei der Planung und Erstellung dieser Viren wurde viel Sorgfalt bei der Auswahl der Fluorophore, die hohen Signal-zu-Hintergrund-Merkmale mit überlegener Effizienz Klapp müssen zuverlässige Quantifizierung mit schneller Rückmeldung an Veränderungen in der Expression (Venus, mCherry und TagBFP) Erleichterung aufgenommen. Zusätzlich Kombinationen von viralen Promotoren wurden ausgewählt, die eine hohe Wiedergabetreue, eindeutige Phase-spezifische Expression, die Bereitstellung von Informationen über das gesamte Spektrum der früh (C11R-Promotor), Mittelstufe (G8R Promotor) und späten (F17R Promotor) Genexpression zu produzieren, im Gegensatz zu zweideutig frühen / späten Veranstalter.

Diese Viren können als ein Werkzeug verwendet werden, für investigating den Lebenszyklus des prototypischen Pockenvirus, Vaccinia-Virus. Vieles ist noch nicht bekannt über die Wirt-Virus-Interaktion trotz seiner langen Geschichte der Studie. Vaccinia ist komplex, produziert mehr als 200 einzigartige Proteine, von denen viele immunmodulatorische und hosten antagonistisch. Bei Infektion beginnt Vaccinia-Virus sofort frühen mRNA-Transkription. Dies wird durch eine RNA-Polymerase und Transkriptionsfaktoren, die auf der viralen Genoms während der Virion Verpackungs geladen und in einem angehaltenen Zustand, bis nachfolgende Infektion gehalten wurden, erleichtert. Diese frühe Ausdruck produziert vor allem Proteine ​​für die Unterdrückung der das Immunsystem des Wirts (mRNA Decapping, dsRNA-Sequestrierung und Köder Rezeptorproteine ​​sowie Inhibitoren der Apoptose, Stressantwort und Toll, IL, und NF-kB-Signalisierung) und Genom-Replikation erforderlich. Frühe Ausdruck produziert auch Transkriptionsfaktoren für Zwischenausdruck erforderlich. Zwischen Ausdruck schließt die Expression von Transkriptionsfaktoren spät. DiesAusdruck Kaskade führt zur Produktion von strukturellen und enzymatischen Virusproteine ​​während der späten Stadien der Infektion, die für die komplette Montage des reifen Virions Vaccinia notwendig sind.

Unsere Gruppe von fluoreszierenden Reporter-Viren ermöglicht rasche Fortschritte im Verständnis der Biologie Pockenvirus hergestellt werden. Eine der häufigsten und zeitraubenden Methoden auf dem Gebiet der Virologie ist die Wachstumstest. Dies beinhaltet typischerweise Infizieren von Zellen, Festlegung einer Reihe von Behandlungen, Virus-Ernte durch Lyse von infizierten Zellen und der Quantifizierung des erhaltenen Virustiter durch Plaque-Assay. Mit den hier beschriebenen Reporter Viren ermöglicht Echtzeit-Messung der Viruswachstum, die leicht untersucht und verglichen zwischen zahlreichen Behandlungen, die parallel ausgeführt werden können. Wir sehen dieses Set von Reagenzien werden in verschiedenen Protokollen für die Identifizierung Veränderungen im viralen Genexpression in Reaktion auf Medikamente, RNAi-k verwendet werdennockdown oder Wirtsspektrum Einschränkung.

Diese Methode ermöglicht auch High-Content-Analyse in einem größeren Maßstab als bisher zur Verfügung, so dass für Hochdurchsatz-Anti-Virus-Drogen-Bildschirme für speziell definierte Zielstufen von Interesse. Während zahlreiche mögliche Behandlungen zur Bekämpfung von Pockenvirus-Infektion identifiziert worden sind, die einzige von der FDA zugelassenen Therapien wirksam zur Behandlung von Pockenvirusinfektion sind die acyclischen Nucleosid-Phosphonats, Cidofovir, und Behandlung mit Vaccinia-Immunglobulin ^9,10. Trotz der Ausrottung der Pocken im Jahr 1977 ^11, bleiben Pockenviren eine erhebliche Bedrohung für die menschliche Gesundheit ^12. Einstellung der weit verbreiteten Impfung gegen Variola-Virus hat zu einer erhöhten Anfälligkeit für andere Pockenviren ¹³ geführt. Zum Beispiel werden die Regionen Zentralafrikas zuvor durch Impfung geschützt erleben einen Anstieg der Affenpocken-Virus-Infektionen ^14. Erhebliche Bedenken hat auchhob in Bezug auf die latente Anfälligkeit für vorsätzliche Freisetzung von Variola-Virus. Aufgrund der begrenzten Therapien derzeit zur Verfügung, es besteht ein dringender Bedarf für die Entwicklung von neuartigen Behandlungen. Diese Reporterviren erlauben eine schnelle und Hochdurchsatz-Screening niedermolekularer Inhibitor zur Hemmung einer spezifischen Phase der Virusreplikation. Identifizierung von Inhibitoren, die viralen Expressions Stufen Ziel derzeit nicht das Ziel der Hemmung wird die Entwicklung von Kombinationstherapien mit erhöhter Potenz zu erleichtern.

Man kann viel über Vaccinia Zellbiologie durch Beobachtung von Veränderungen in jeder Stufe der Genexpression zu entnehmen. Dämpfung durch chemische oder genetische Manipulation einer infizierten Wirtszelle wird in der Regel in Form von geringeren Virustiter ausgedrückt. Doch beim Vergleich der Entwicklung in den einzelnen Phasen des viralen Expressionskaskade, kann man ein vollständigeres Verständnis der Virus-Fitness ist Auswirkungen zu erhaltendurch eine besondere Behandlung ed. Diese Daten haben gezeigt, dass auch mit der traditionellen Virustiter Ausgangs korrelieren, aber detailliertere mechanistische Informationen sowie hohe Durchsatzkapazitäten ^7.

Protokoll

1. Platte Cells

1. Distanzieren HeLa-Zellen von der Platte und in Wachstumsmedium (DMEM, 2 mM L-glut, 10% FBS) zu verdünnen, um etwa 2,0 x 10 ⁵ Zellen / ml. Pipettieren von 100 ul / Vertiefung in einem schwarzen Wänden, klare Flachboden-96-Well-Platte (20.000 Zellen / Vertiefung).
2. Zellen für 24 Stunden inkubieren, bis Konfluenz in einer 37 ° C-Inkubator + 5% CO _2.

2. Zellen infizieren

1. Verdünnen Virus und Zellen infizieren.
   1. Tauwetter TRPV (Dreibett-Virus, Früh Venus, Intermediate mCherry, Spät TagBFP) und PLV (Promoter-less Venus) Fluoreszenz-Virus und zerlegen mit Beschallung für 5 Minuten. Alternativ können rohen Virusvorräte mit 0,25 mg / ml Trypsin in Infektionsmedium gemischt 1:1 und bei 37 ° C für 30 min inkubiert.
   2. Verdünnen rohen Virusvorräte in 37 °-C-Infektion Medien (DMEM, 2 mM L-glut, 2% FBS). Bei hohen MOI-Infektionen (10 PFU / Zelle), verdünnte Virus Lager bis 1,0 x 10 ⁷ PFU / ml unter der Annahme, 5 x 10 ⁴Zellen / Vertiefung und ein Inokulum von 50 ul. Plan zu infizieren 3 Wiederholungsvertiefungen für jede Behandlung mit TRPV und weitere 3 Wiederholungsvertiefungen für die gleiche Behandlung mit PLV auf Hintergrundfluoreszenz spezifisch für jede Behandlung zu berücksichtigen.
   3. Infizieren Vertiefungen durch Zugabe von 50 &mgr; l / Vertiefung verdünnt Virus in Infektionsmedium. Dies wird als Zeit = 0 h nach Infektion (hpi 0) definiert.
2. Verdünnen gewünschten Behandlungs Verbindungen in Infektion Medien. Für alle Behandlungen sollte eine einzige Master-Mix 2x Verdünnung hergestellt werden und auf Brunnen (z. B. 350 ul Gesamtvolumen von sechs 96-Brunnen mit jeweils 50 ul) zu replizieren.
   1. Verdünnen experimentelle Infektion Verbindungen in Medien.
   2. Verdünnen Fahrzeug-Steuer Lösungsmittel (zB PBS, DMSO) in Infektions Medien. Hinweis: Ähnliche Endkonzentrationen von Fahrzeug-Steuerlösemittel sollten wie für experimentelle Verbindungen (z. B. angewendet werden, wenn Ihr IBT Lager ist mit DMSO hergestellt und in einem abschließenden concentratio verwendetns von 1 ul / ml, dann mit DMSO allein bei 1 ul / ml auf der Fahrzeugsteuerung).
   3. Verdünnen Steuer Verbindungen in Infektion Medien. Empfohlene Kontrollverbindungen umfassen: 3,6 um (1 ug / ml) 1-β-D-arabinofuranosylcytosin (AraC), 50 uM (11,7 ug / ml) β-thiosemicarbazon Isatin (IBT), 60 uM (50 ug / ml) Rifampicin, oder 5 &mgr; m (1,9 &mgr; g / ml) ST-246 ^8,15,16. Siehe Repräsentative Ergebnisse für die erwarteten Effekte. Hinweis: machen diese Verdünnung zu zweimal (2x) der gewünschten Endkonzentration da diese im Verhältnis 1:1 auf das Volumen bereits in die Vertiefung gegeben.
3. Unmittelbar nach Zugabe des Virus, 50 &mgr; l Medium, das gewünschte Infektion Behandlungen und Kontrollen wie in Schritt 2.2 verdünnt. Hinweis: Um für die Hemmung vor frühzeitig Ausdruck zu testen, Verbindung (en) kann entweder direkt zu der verdünnten Virusinokulum (Schritt 2.1.2) oder hinzugefügt werden, um Zellen vor der Infektion zu hosten (vor Schritt 2.1.3).
4. Inkubieren 24.06 h in einem 37 & #176; + C-Inkubator mit 5% CO _2.

3. Fix Cells

1. Fix Zellen durch Zugabe von 100 ul 8% Para für Infektionen Medien bereits in jedes Well. Inkubation bei Raumtemperatur für 15 min vor Licht geschützt. Hinweis: Es wird empfohlen, 2x PFA (8%), die direkt auf eine Infektion Medien zu Vernebelung von Infektions Vaccinia die auftreten können, zu vermeiden, wenn mit hohem Titer Medien direkt in die Abfallschale vor der Fixierung invertiert.
2. Entfernen Fixiermittel durch Umdrehen der Platte in den Abfall Gericht.
3. 100 l Raumtemperatur PBS.
4. Dichtungsplatte mit optisch klare Klebstoff-Film. Hinweis: Die Platten können bei 4 ° C gelagert werden, wenn nicht sofort gelesen werden. Achten Sie darauf, versiegelten Platten auf Raumtemperatur vor dem Lesen, um Kondensation zu verzerren Spektralphotometer Messungen verhindern zurückzukehren.

4. Quantifizierung Virus Wachstum

1. Messen Endpunkt Fluoreszenz bei 515:530 für Venus, 587:610 für mCherry und 415:457 foder TagBFP (Anregung: Emissionswellenlänge in nm). Vier Messungen sollten pro Vertiefung mit optimierten Verstärkungseinstellungen für jeden Kanal gemittelt werden. Hinweis: Die entsprechenden Emissionswellenlänge kann je nach Modell und Filtereigenschaften des Plattenlesegerät. Dies kann empirisch durch die Durchführung einer Emissionswellenlängen-Scan, um den Punkt, wo es den größten Unterschied zwischen TRPV und PLV für jeden Kanal bestimmen, bestimmt werden.
2. Normalisieren Sie die Rohdaten zum Vergleich zwischen den Experimenten zu erleichtern.
   1. Für jeden Kanal die mittlere von Wiederholungs TRPV und PLV Brunnen.
   2. Subtrahieren Sie die Mittel PLV-infizierten Hintergrundmessungen aus den Mittel TRPV-infizierten experimentellen Messungen für jede Behandlung.
   3. Normalisieren Sie die Daten, indem jede Hintergrund subtrahiert Wert vom Fahrzeug-only-Wert auch.
   4. Sobald ein Experiment wurde mehrmals, eine Einweg-Varianzanalyse (one-way ANOVA) Test-und Mehrfach c wiederholtERGLEICH Post-Test durchgeführt, um zu bestimmen, ob jede der Behandlungen zeigt einen statistisch signifikanten Unterschied von der Fahrzeug einzige Behandlung für jeden Kanal werden.

. 5 Alternative Protokoll: Kinetic Plattentests

1. Führen Sie alle Schritte durch Zugabe von Behandlungen (Schritt 2.3).
2. Seal Platte mit Haftklebefolie abdecken und in Plattenleseraum auf 37 ° C ins Gleichgewicht Hinweis: Besondere Sorgfalt ist auf Platten bei 37 ° C konstant zu halten, um übermäßige Zellstress und Kondensation zu verhindern. Kinetischen Assays ist es besonders wichtig, einen gepufferten Medium (Natriumbicarbonat und HEPES), um richtigen pH ohne Zusatz von 5% CO ₂ erhalten.
3. Set-Plattenlesegerät manuell zu gewinnen, um die Sättigung des späteren Zeitpunkten zu verhindern. Anmerkung: Die genaue Verstärkungsoptimierung kann durch Durchführen einer Endpunkt-Assays unter ähnlichen Bedingungen erhalten werden.
4. Erwerben Stundenwerte für 8-24 hpi und normalisieren mit ähnlar Verfahren wie in Endpunkt-Assay (Schritt 4.2).
5. Individuelle Zeitpunkte für die statistische Signifikanz unter Verwendung ähnlicher Verfahren wie das zuvor beschriebene Endpunkt-Assay analysiert werden.

Ergebnisse

Als ein Beispiel für die typische Verwendung dieser Viren wurde das dreifache Fluoreszenz-Reportervirus verwendet, um den Punkt der Hemmung von mehreren wohldefinierten Pockenvirus-Inhibitoren zu vergleichen.

HeLa-Zellen wurden in Gewebekultur behandelt vergoldet schwarz-mauert klar Flachboden-96-Well-Platten und über Nacht inkubiert. Konfluente Monolayer wurden bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 10 unter Verwendung von entweder dreifache Reporter Virus (TRPV, Tabelle...

Diskussion

Hier haben wir den praktischen Einsatz eines mehrstufigen Vaccinia-Reportervirus (TRPV), die reproduzierbar ist, Echtzeit-Feedback Maßnahmen der Virusreplikation liefert beschrieben. Durch die Verwendung von gut definierten Pockenvirus-Inhibitoren, konnten wir zeigen, dass TRPV reagiert in einer Weise, die mit dem Wirkmechanismus verstanden, für jeden Inhibitor. Während die TRPV Virus bietet die umfassendsten Informationen über Viren Bühne Progression, zweistufig (IREV, LREV) und einstufigen (EV, IV, LV)-Viren kön...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065
Fetal Bovine Serum - Optima, Heat Inactivated (FBS)	Atlanta Biologicals	S12450H
200 mM L-Glutamine, (L-glut)	Gibco	25030-081
96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates	Corning	3603
384 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates	Corning	3712
Trypsin, 2X, Sterile, Irradiated	Worthington Biochemical Corp.	TRLVMF
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-023
Dimethyl Sulfoxide, Cell Culture (DMSO)	American Bioanalytical	AB03091
1-β-D-Arabinofuranosylcytosine  (AraC), MW= 280 g/mol	SigmaAldrich Co	C6645
isatin β -thiosemicarbazone (IBT), MW= 234 g/mol	Fisher Scientific	NC9075202
Rifampicin, MW= 823 g/mol	SigmaAldrich Co	R3501
ST-246, MW= 376 g/mol	SIGA Labs, Corvallis, OR
8% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	157-8
TempPlate RT optically clear film	USA Scientific	2978-2700
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Gibco	31985-070