Repórter Vaccinia vírus para quantificar Função Viral em todas as fases da Expressão Gênica

Resumo

Descreve-se a utilização de um vírus vaccinia repórter fluorescente que permite a medição em tempo real da infectividade viral e a expressão do gene através da expressão específica da fase de fluoróforos espectralmente distintos repórter. Detalhamos um método baseado em placa para identificar com precisão a fase em que a replicação do vírus é afetada em resposta a pequena inibição molécula.

Resumo

Poxviruses são uma família de vírus de DNA fita dupla que incluem patógenos ativos humanos, tais como macacos, molusco contagiousum e vírus Contagalo. A família também inclui o vírus da varíola, da varíola. Devido à complexidade da replicação de poxvírus, muitas questões ainda permanecem em relação à sua estratégia de expressão gênica. Neste artigo, descreve-se a concepção e utilização de vírus vaccinia recombinantes que permitem a medição em tempo real das fases únicas e múltiplas de expressão de genes virais em um formato de alto rendimento. Esta é activada através da utilização de proteínas fluorescentes espectralmente distintos como repórteres para cada uma das três fases da replicação viral. Estes vírus proporcionar uma razão elevada de sinal-para-ruído de fase, mantendo padrões específicos de expressão, permitindo ensaios baseados em placas e as observações microscópicas de propagação de vírus e de replicação. Estas ferramentas têm usos para descoberta antiviral, os estudos sobre a interação vírus-hospedeiro, e bio evolutivologia.

Introdução

Tradicionalmente, a expressão do vírus é estudada, utilizando técnicas de biologia molecular (por exemplo, transferência de Northern, transferência de western, de microarray de hibridação, etc) ^1. Enquanto estes métodos são capazes de fornecer a informação detalhada com respeito à categorização mudanças de mRNAs individuais ou de proteínas de expressão, que não são normalmente passíveis de processos em tempo real e de alto rendimento. Abordagens alternativas usando os repórteres à base de fluorescência foram aplicadas anteriormente ao trabalhar com poxvírus; no entanto, o seu desenvolvimento e uso foi motivado por objetivos variados. Vários destes métodos foram concebidos para a selecção de vírus recombinantes ^2,3. Estas técnicas expressar EGFP com a incorporação apropriada e expressão de ADN exógena a partir de clones de vaccinia recombinantes. Da mesma forma, várias estirpes de vaccinia que expressam estavelmente EGFP solúveis ou proteínas GFP expressos sob um promotor de vacina nativa tem sido amplamente usado. Estes são typcamente utilizadas para quantificar a entrada do vírus e replicação durante ensaios de neutralização com base em anticorpos, inibição química, ou a comparação da eficácia antiviral ^4-6. Embora esses vírus têm se mostrado útil, eles são limitados em sua capacidade de fornecer informações detalhadas sobre o ponto de inibição devido ao seu uso de um único promotor viral início / final ambíguo. Métodos anteriores também fizeram uso da proteína EGFP com características sub-ótimos sinal-ruído.

Devido à complexidade da replicação de poxvírus ea falta de ferramentas existentes disponíveis para analisar mudanças em tempo real na expressão genética viral, desenvolvemos um conjunto de vírus repórter fase única e multi ^7,8. Conforme descrito em publicações anteriores, esses vírus expressar um, dois, ou três proteínas fluorescentes espectralmente distintas de promotores vaccinia nativas durante o início, etapas intermediárias, ou no final infecção. Esses vírus podem ser nósed como indicadores de andamento da replicação do vírus, utilizando um microscópio de fluorescência e que são igualmente adequados para a placa-e-leitor de ensaios à base de alto rendimento. Estes vírus são fáceis de usar no lugar do vírus de tipo selvagem, crescendo com cinética similar para alcançar títulos equivalentes ^7. Durante o planejamento e criação desses vírus, muito cuidado foi tomado na seleção de fluoróforos que têm altas características de sinal-para-fundo com eficiência dobradura superiores para facilitar a quantificação confiável, com feedback rápido às mudanças na expressão (Vênus, mCherry e TagBFP). Além disso, as combinações de promotores virais foram escolhidos que produzem alta fidelidade, a expressão específica do estágio inequívoca, fornecendo informações sobre a gama completa de início (C11R promotor), intermediária (promotor G8R) e tardia (F17R promotor) a expressão do gene, em contraste com a ambígua promotores de início / final.

Estes vírus podem ser utilizados como uma ferramenta para a investigating o ciclo de vida do poxvírus, vírus vaccinia prototípico. Muito ainda não se sabe sobre a interação hospedeiro-vírus, apesar da sua longa história de estudo. Vaccinia é complexo, produzindo mais de 200 proteínas específicas, muitas das quais são imunomoduladores e hospedar antagônicos. Após a infecção, o vírus vaccinia imediatamente começa a transcrição do mRNA precoce. Isto é facilitado por uma RNA polimerase e transcrição fatores que foram carregados no genoma viral durante a embalagem virion e mantidas em um estado pausado até que a infecção subseqüente. Esta expressão precoce produz principalmente proteínas necessárias para a supressão do sistema imunológico hospedeiro (decapping mRNA, dsRNA seqüestro e proteínas receptoras chamariz, bem como inibidores de apoptose, resposta ao estresse, e Toll, IL, e sinalização NF-kB) e replicação do genoma. A expressão precoce também produz fatores necessários para a expressão intermediário de transcrição. Expressão intermédio inclui a expressão de fatores de transcrição fase final. Esteexpressão cascata leva à produção de proteínas de vírus estruturais e enzimáticas durante a fase tardia da infecção, que são necessários para a montagem completa do virião maduro vaccinia.

Nosso conjunto de vírus repórter fluorescentes permite um rápido progresso a ser feito na compreensão da biologia poxvírus. Um dos métodos mais comuns e demoradas no campo da virologia é o ensaio de crescimento. Isto tipicamente envolve a infecção de células, promulgação de uma série de tratamentos, o vírus da colheita por lise das células infectadas, e quantificando o título viral resultante por ensaio de placas. Usando os vírus repórter descritos aqui permite a medição em tempo real do crescimento do vírus que pode ser facilmente ensaiada e comparada entre os vários tratamentos realizados em paralelo. Prevemos este conjunto de reagentes serão utilizados em vários protocolos para a identificação de alterações na expressão de genes virais, em resposta a tratamento medicamentoso, o RNAi knockdown ou restrição gama de hospedeiros.

Este método também permite a análise de alto conteúdo em uma escala maior do que anteriormente disponível, permitindo a de alto rendimento telas de drogas anti-virais para estágios alvo bem definidas de interesse. Enquanto numerosos potenciais tratamentos para combater a infecção poxvírus têm sido identificadas, a FDA aprovou apenas terapias eficazes para o tratamento de infecção por poxvírus são o nucleosídeo acíclico fosfonato, Cidofovir, e tratamento com vaccinia imune ^9,10 globulina. Apesar da erradicação da varíola em 1977 ^11, poxvírus continuam a ser uma ameaça significativa para a saúde humana ^12. Cessação da vacinação generalizada contra o vírus da varíola levou a um aumento da susceptibilidade a outros poxvírus ^13. Por exemplo, as regiões da África Central anteriormente protegidos pela vacinação está enfrentando um surto de infecções por vírus Monkeypox ^14. Preocupação significativa também foilevantadas em relação a susceptibilidade latente a libertação intencional de vírus da varíola. Devido às terapias limitados actualmente disponíveis, há uma necessidade urgente de desenvolvimento de novos tratamentos. Estes vírus repórter permitir rastreio pequena molécula inibidora rápido e de alta produtividade para a inibição de um determinado estádio da replicação viral. Identificação de inibidores que visam estágios de expressão virais atualmente não alvo de inibição irá facilitar o desenvolvimento de terapias de combinação com o aumento da potência.

Muito pode ser adquirida sobre biologia celular vaccinia observando mudanças na expressão gênica de cada etapa. Atenuação por manipulação química ou genética de uma célula hospedeira infectada é normalmente expressa em termos de redução dos títulos virais. No entanto, comparando as alterações em cada fase da cascata de expressão viral, pode-se obter uma compreensão mais completa da forma como a aptidão do vírus é impactoed por um tratamento em particular. Estes dados foram mostrados para correlacionar bem com a saída título do vírus tradicional, mas fornecer informações mecanicista mais detalhada, bem como capacidades de alto rendimento ^7.

Protocolo

1. Placa Células

1. Dissociar células HeLa a partir de chapa e dilua em meio de crescimento (DMEM, 2 mM de L-glut, FBS a 10%) para aproximadamente 2,0 x 10 ⁵ células / ml. Distribuir 100 ^ l / poço de uma, claro placa de 96 poços de fundo plano com paredes pretas (20000 células / poço).
2. Incubar as células durante 24 horas até à confluência em uma incubadora a 37 ° C + 5% de CO _2.

2. Infectar as células

1. Diluir vírus e infectar as células.
   1. Thaw TRPV (vírus Triplo; Precoce Vênus, Intermediário mCherry, Late TagBFP) e PLV (Promotor-less Vênus) vírus fluorescente e desagregar utilizando sonicação por 5 minutos. Alternativamente, os estoques de vírus em bruto pode ser misturado a 1:1 com 0,25 mg / ml de tripsina em meio de infecção e incubados a 37 ° C durante 30 min.
   2. Diluir stocks de vírus bruto em 37 ° C media de infecção (DMEM, 2 mM L-glut, 2% FBS). Para infecções de alto MOI (10 UFP / célula), diluir stock de virus para 1,0 x 10 ⁷ PFU / ml assumindo 5 x 10 ⁴células / poço e um volume de inoculo de 50 ul. Plano de infectar 3 poços réplicas para cada tratamento com TRPV e outros 3 poços idênticas para o mesmo tratamento com PLV para explicar a fluorescência de fundo específico para cada tratamento.
   3. Infect poços por adição de 50 ul / cavidade diluída em meio de infecção do vírus. Esta é definida como a infecção tempo = 0 hr post (0 hpi).
2. Dilui-se os compostos de tratamento desejados para o meio de infecção. Para todos os tratamentos, uma única diluição 2x mestre mistura deve ser feita e aplicada a replicar poços (volume total de 350 ul, por exemplo para seis placas de 96 poços com 50 mL de cada).
   1. Dilui-se os compostos experimentais em meios de infecção.
   2. Dilui-controlo com o veículo solvente (por exemplo, PBS, DMSO) para o meio de infecção. Nota: parecidos concentrações finais de solventes de controle de veículo deve ser usado como aplicado para compostos experimentais (por exemplo, se o seu estoque IBT é feito com DMSO e utilizado numa concentratio finaisns de 1 ul / ml, em seguida, utilizar apenas DMSO a 1 mL / mL como o controlo do veículo).
   3. Dilui-se os compostos em meios de controlo de infecção. Compostos de controlo recomendadas incluem: 3,6 uM (1 ug / ml) 1-β-D-arabinofuranosilcitosina (AraC), 50 ^ M (11,7 mg / ml) de isatina β-tiossemicarbazona (TBI), 60 uM (50 ug / ml), rifampicina, ou 5 uM (1,9 ug / ml) de ST-246 ^8,15,16. Veja resultados representativos para efeitos esperados. Nota: certifique-esta diluição em duas vezes (2x), a concentração final desejada, desde que este é adicionado numa proporção de 1:1 para o volume já no poço.
3. Imediatamente após a adição do vírus, adicionar 50 ul de meios de infecção contendo tratamentos e controles desejados como diluída no passo 2.2. Nota: Para ensaiar a inibição de expressão antes fase inicial, o composto (s) pode ser adicionado directamente à suspensão de inóculo de vírus diluído (passo 2.1.2) ou a células hospedeiras antes da infecção (antes do passo 2.1.3).
4. Incubar 6-24 hr em um 37 & #176; incubadora C + 5% de CO _2.

3. Corrigir Células

1. Fixar as células por adição de 100 ul de paraformaldeido a 8% mídia infecção já em cada poço. Incubar à temperatura ambiente durante 15 minutos ao abrigo da luz. Nota: Recomenda-se adicionar 2x PFA (8%) diretamente para a mídia de infecção para evitar aerosolization de vaccinia infecciosa que pode ocorrer se a mídia de alta titulação é invertida diretamente no prato resíduos previamente à sua fixação.
2. Remover fixador invertendo a placa para o prato de resíduos.
3. Adicionar 100 ul de PBS temperatura ambiente.
4. Selar placa com película adesiva opticamente clara. Nota: As placas podem ser armazenadas a 4 ° C se não for lida imediatamente. Certifique-se de retornar placas seladas à temperatura ambiente antes de ler para evitar a condensação de distorcer as medições espectrofotômetro.

4. Quantificar Vírus Crescimento

1. Meça endpoint fluorescência em 515:530 para Vênus, 587:610 para mCherry, e 415:457 fou TagBFP (Excitação: comprimento de onda de emissão em nm). Quatro medidas devem ser em média por poço usando ajustes de ganho otimizados para cada canal. Nota: O comprimento de onda de emissão apropriado pode ser diferente, dependendo do modelo e do filtro características específicas do seu leitor de placas. Isto pode ser determinado empiricamente através da realização de um comprimento de onda de emissão de verificação para determinar o ponto em que não é a maior diferença entre TRPV e VLP para cada canal.
2. Normalizar os dados brutos para facilitar a comparação entre experimentos.
   1. Para cada canal, determinar a média de TRPV replicar e poços PLV.
   2. Subtrair os médios medições de fundo PLV-infectados a partir das medições experimentais médios TRPV infectados para cada tratamento.
   3. Normalizar os dados pela divisão de cada fundo valor subtraído pelo valor somente veículo bem.
   4. Uma vez que um experimento foi repetido várias vezes, a análise de um teste de variância (one-way ANOVA) e vários cOMPARAÇÃO pós-teste pode ser executado para determinar se qualquer um dos tratamentos reflecte uma diferença estatisticamente significativa relativamente ao tratamento apenas com veículo, para cada canal.

. 5 Protocolo Alternativa: Ensaios de Placa cinéticos

1. Execute todas as etapas através da adição de tratamentos (passo 2.3).
2. Placa de vedação com película adesiva e coloque na câmara leitor de placas equilibrada a 37 ° C. Nota: Cuidado especial deve ser tomado para manter as placas de forma consistente a 37 ° C para prevenir o stress celular indevida e condensação. Para os ensaios cinéticos, é particularmente importante a utilização de um meio tamponado (bicarbonato de sódio e HEPES) para manter o pH adequado sem a adição de 5% de CO _2.
3. Conjunto leitor de placas de ganhar manualmente para evitar a saturação de pontos de tempo posteriores. Nota: optimização ganho exacta pode ser obtida através da realização de ensaios de um ponto de extremidade, sob condições semelhantes.
4. Adquirir leituras de hora em hora para 8-24 hpi e normalizar usando simiprocedimento lar como no ensaio endpoint (passo 4.2).
5. Os pontos de tempo individuais podem ser analisadas para a significância estatística usando métodos semelhantes como o ponto final do ensaio anteriormente descrito.

Resultados

Como exemplo do uso típico destes vírus, o vírus da fluorescência repórter triplo foi utilizada para comparar o ponto de inibição de vários inibidores de poxvírus bem definidas.

As células HeLa foram colocadas em cultura de tecidos tratados claras placas de 96 poços de paredes pretas de fundo plano e incubadas durante a noite. As monocamadas confluentes foram infectadas a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10 usando um triplo vírus repórter (TRPV; Tabela 1)

Discussão

Aqui, nós descrevemos o uso prático de um multi-estágio vírus vaccinia repórter (TRPV), que fornece em tempo real reprodutíveis medidas, feedback de replicação do vírus. Ao utilizar inibidores poxvírus bem definidos, fomos capazes de mostrar que TRPV responde de uma maneira consistente com o mecanismo entendido de ação para cada inibidor. Embora o vírus TRPV fornece as informações mais abrangentes sobre vírus progressão etapa, em duas etapas (iRev, LREV) e de fase única (EV, IV, LV) vírus também pode...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065
Fetal Bovine Serum - Optima, Heat Inactivated (FBS)	Atlanta Biologicals	S12450H
200 mM L-Glutamine, (L-glut)	Gibco	25030-081
96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates	Corning	3603
384 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates	Corning	3712
Trypsin, 2X, Sterile, Irradiated	Worthington Biochemical Corp.	TRLVMF
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-023
Dimethyl Sulfoxide, Cell Culture (DMSO)	American Bioanalytical	AB03091
1-β-D-Arabinofuranosylcytosine  (AraC), MW= 280 g/mol	SigmaAldrich Co	C6645
isatin β -thiosemicarbazone (IBT), MW= 234 g/mol	Fisher Scientific	NC9075202
Rifampicin, MW= 823 g/mol	SigmaAldrich Co	R3501
ST-246, MW= 376 g/mol	SIGA Labs, Corvallis, OR
8% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	157-8
TempPlate RT optically clear film	USA Scientific	2978-2700
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Gibco	31985-070