유전자 발현의 모든 단계에서 바이러스 성 기능을 정량화 우두 바이러스 기자

요약

우리는 스펙트럼 구별 리포터 형광의 단계 - 특이 적 발현을 통해 바이러스 감염 및 유전자 발현의 실시간 측정을 가능하게하는 형광 리포터 백시 니아 바이러스의 사용을 설명한다. 우리 세부 정확하게 바이러스 복제가 저분자 저해에 응답하여 영향되는 단계를 식별하기위한 플레이트 기반 방법.

초록

폭스 바이러스 활성 인간과 같은 monkeypox에 같은 병원체, 전염성의 contagiousum 및 Contagalo 바이러스를 포함 이중 가닥 DNA 바이러스의 가족입니다. 이 제품군은 또한 천연두 바이러스, 천연두를 포함한다. 인해 폭스 바이러스 복제의 복잡성, 많은 질문들은 여전히​​ 유전자 발현 전략에 대하여 남아있다. 이 문서에서 우리는 높은 처리량 형식의 바이러스 유전자 발현의 단일 및 다중 단계의 실시간 측정을 가능하게 재조합 우두 바이러스의 개념화 및 사용에 대해 설명합니다. 이것은 바이러스 복제의 세 단계 각각에 대한 기자로서 스펙트럼 별개의 형광 단백질의 사용을 통해 사용할 수 있습니다. 스테이지 별 발현 패턴, 가능하게 플레이트 - 기반 분석법 및 바이러스 전파 및 복제의 현미경 관찰을 유지하면서 이러한 바이러스는 높은 신호 대 잡음비를 제공한다. 이 도구는 바이러스 검색, 바이러스 호스트 상호 작용의 연구, 진화 생물에 대한 용도가의 뜻.

서문

전통적으로, 바이러스 발현 분자 생물학 기술 (예를 들면 북부 블로 팅, 웨스턴 블롯, 마이크로 어레이 하이브리드 ^등)를 사용하여 공부한다. 이러한 방법은 개인의 mRNA 또는 단백질의 발현 변화를 범주화에 대해 상세한 정보를 제공 할 수 있지만, 그들은 일반적으로 실시간 및 높은 처리량 프로세스에 순종하지 않다. 폭스 바이러스 작업을 할 때 형광 기반의 기자를 사용하여 다른 방식의 접근은 이전에 적용되었습니다; 그러나, 자신의 개발과 사용은 다양한 목적에 의해 동기 부여를하고있다. 몇 가지 이러한 방법은 재조합 바이러스 ^2,3의 선택을 위해 설계되었습니다. 이 기술은 적절한 결합 재조합 우두 클론에서 외래 DNA의 발현에 EGFP을 표현한다. 마찬가지로, 여러 우두 균주 안정적으로 용해 EGFP을 표현하거나 기본 우두 프로모터에서 표현 GFP - 태그 단백질은 널리 사용되어왔다. 이들은 일반 있습니다ically 바이러스 항목 및 복제 항체 기반의 중화 분석하는 동안, 화학 억제, 또는 항 바이러스 효과 ^4-6의 비교를 정량화하는 데 사용됩니다. 이 바이러스가 유용한 입증하는 동안, 그들은 하나 때문에 모호한 말 / 초기 바이러스 성 프로모터의 자신의 사용을 억제 포인트에 대한 자세한 정보를 제공 할 수있는 능력이 제한되어있다. 이전의 방법은 또한 차선 신호 대 잡음 특성 EGFP 단백질을 살린있다.

때문에 폭스 바이러스 복제 및 바이러스 유전자 발현의 실시간 변화를 분석 실험 할 수 기존 도구의 부족의 복잡성 때문에, 우리는 단일 및 다중 단계 기자 바이러스 ^7,8의 제품군을 개발했습니다. 이전의 출판물에서 설명한 바와 같이,이 바이러스는 감염 초기, 중간, 또는 늦은 단계 중 한 개, 두 개, 또는 네이티브 우두 프로모터로부터 3 스펙트럼 별개의 형광 단백질을 표현한다. 이 바이러스는 우리가 될 수형광 현미경을 사용하여 바이러스 복제 진행의 지표로 ED 그들은 높은 처리량 판과 리더를 기반으로 분석을위한 동등하게 적합하다. 이러한 바이러스는 동등한 역가 ^{7에 도달하는} 유사한 동역학으로 성장, 야생형 바이러스의 장소에서 사용하기 쉽다. 계획과 이러한 바이러스의 작성 중에 많은주의가 식 (금성, mCherry 및 TagBFP)의 변화에​​ 신속하게 피드백을 신뢰할 수있는 정량을 용이하게하기 위해 뛰어난 폴딩 효율 높은 신호 배경 특성이 형광을 선택에서 촬영했다. 또한, 바이러스 성 프로모터의 조합은 모호한 대조적으로, 고 충실도, 명확한 단계 특정 식 (C11R의 프로모터) 초기의 전체 범위에 대한 정보를 제공하고, 중간 (G8R 프로모터)와 후기 (F17R 프로모터) 유전자 발현을 생산하는 선택 하였다 일찍 / 늦게 발기인.

이러한 바이러스 INVE위한 도구로 사용할 수원형 폭스 바이러스, 우두 바이러스의 수명주기를 stigating. 대부분은 연구의 오랜 역사에도 불구하고 여전히 호스트 바이러스 상호 작용에 대한 알 수 없습니다. 우두는 면역하고 반목하는 호스트 중 많은 200 개 이상의 고유 한 단백질을 생산, 복잡합니다. 감염되면, 우두 바이러스는 즉시 초기 mRNA의 전사를 시작한다. 이는 비리 포장하는 동안 바이러스 게놈로드 및 후속 감염 될 때까지 일시 중지 된 상태로 유지 된 RNA 중합 효소 및 전사 인자에 의해 촉진된다. 이 초기의 표현은 주로 숙주 면역 시스템 (mRNA의 decapping, dsRNA에 격리 및 미끼 수용체 단백질뿐만 아니라 세포 사멸의 억제, 스트레스 반응,, 수신자, IL 및 NF-κB 신호)와 게놈 복제의 억제에 필요한 단백질을 생산한다. 조기 발현은 중간 표현에 필요한 전사 인자를 생성합니다. 중간 표현은 말기 전사 인자의 발현을 포함한다. 이표현 계단식 성숙한 우두 비리의 전체 어셈블리에 필요한 감염의 후반 단계 동안 구조 및 효소 바이러스 단백질의 생산에 이르게한다.

형광 기자 바이러스의 우리의 세트는 폭스 바이러스 생물학의 이해를 할 수있는 빠른 진행이 가능합니다. 바이러스학 분야에서 가장 일반적으로 시간이 많이 소요되는 방법 중 하나는 성장 분석이다. 이것은 일반적으로, 세포를 감염에 감염된 세포를 용균에 의해 처리, 수확 바이러스의 시리즈를 제정하고, 플라크의 분석에 의해 생성 된 바이러스 역가를 정량화 포함한다. 여기에 설명 된 리포터 바이러스를 사용하여 쉽게 정량과 병렬로 수행 수많은 치료 사이에 비교 될 수있는 바이러스 성장의 실시간 측정을 허용한다. 우리는 시약의이 세트는 약물 치료, RNAi의 K에 응답하여 바이러스의 유전자 발현의 변화를 확인하기위한 다양한 프로토콜에 사용될 예견nockdown, 또는 호스트 범위 제한.

이 방법은 그 구체적으로 정의 된 목표 단계에 대한 높은 처리량 항 바이러스 약물 스크린을 허용 이전에 사용할 수보다 더 큰 규모로 높은 콘텐츠 분석을 할 수 있습니다. 폭스 바이러스 감염을 방지하기 위해 다수의 잠재적 인 처리가 확인되었지만, 유일한 FDA는 폭스 바이러스 감염 치료를위한 효과적인 치료가 비 환식 포스 뉴 클레오 시드, 시도 포비 및 우두 면역 글로불린 ^9,10 치료입니다 승인했다. 1977 ¹¹ 천연두의 박멸에도 불구하고, 폭스 바이러스는 인간의 건강 ^(12)에 큰 위협이 남아있다. 천연두 바이러스에 대한 광범위한 예방 접종의 중단은 다른 폭스 바이러스 ^(13)에 대한 감수성을 증가되었다. 예를 들어, 이전에 예방 접종에 의해 보호 중앙 아프리카 지역은 monkeypox에 바이러스 감염 ^14의 급증을 경험하고 있습니다. 중요한 문제도있다천연두 바이러스의 의도적 방출에 잠재 된 감수성에 관한 올렸다. 때문에 현재 사용 가능한 제한된 치료로, 신규 치료법의 개발이 절실히 요구되고있다. 이 기자의 바이러스는 바이러스 복제의 특정 단계의 억제를위한 신속하고 높은 처리량 작은 분자 억제제 검사를 할 수 있습니다. 억제의 현재 사용하지 대상 바이러스 발현 단계를 대상으로 억제제의 확인이 증가 힘과 함께 치료의 개발을 촉진 할 것이다.

대부분은 각 단계의 유전자 발현의 변화를 관찰하여 백시 세포 생물학에 대한 많은 정보를 수집 할 수 있습니다. 화학 물질 또는 감염된 숙주 세포의 유전자 조작에 의한 감쇠는 일반적으로 감소 바이러스 역가 표현된다. 그러나, 바이러스 성 발현 캐스케이드의 각 단계에서 변화를 비교함으로써, 하나는 바이러스가 적당 충격 방법의 더욱 완전한 이해를 얻을 수있다특히 처리에 의해 에드. 이러한 데이터는 기존의 바이러스 역가 출력과 상관 관계가 있지만,보다 상세한 기계론 정보뿐만 아니라 높은 처리 능력 ^(7)을 제공하는 것으로 나타났다.

프로토콜

1. 플레이트 세포

1. 판에서 HeLa 세포를 떼어 놓다 약 2.0 × 10 ⁵ 세포 / ml로 성장 배지 (DMEM, 2 MM의 L-과잉, 10 % FBS)에 희석. 검은 벽, 분명 평면 바닥 96 - 웰 플레이트 (20,000 세포 / 웰)에 100 μL / 잘 분배.
2. + 5 % CO ₂ 37 ° C 배양기에 합류 할 때까지 24 시간 동안 세포를 품어.

2. 세포를 감염

1. 바이러스를 희석하고 세포를 감염.
   1. 해동 TrpV (트리플 바이러스, 조기 금성, 중급 mCherry, 늦은 TagBFP)과 PLV (발기인없는 비너스) 형광 바이러스와 5 분 동안 초음파를 사용하여 해리하는. 또한, 원유 바이러스 주식 감염 매체에 0.25 ㎎ / ㎖ 트립신 1:1로 혼합하여 30 분 동안 37 ° C에서 배양 할 수있다.
   2. 37 ° C 감염 미디어 (DMEM, 2 MM의 L-과잉, 2 % FBS)에서 원유 바이러스 주식을 희석. 높은 MOI 감염 (10 PFU / 셀)의 경우, PFU는 / ㎖ 5 × ^{4 가정} 1.0 × 10 ⁷ 바이러스 주식을 희석잘 세포 / 50 μL의 접종 볼륨. TrpV 각각 처리하고 각 치료에 특정 배경 형광을 설명하는 PLV와 같은 치료를위한 또 다른 3 복제 우물 3 복제 우물을 감염에 대한 계획.
   3. 감염 매체에 50 μL / 잘 희석 바이러스를 추가하여 우물을 감염. 이것은 시간 = 0 시간 게시물 감염 (0 HPI)로 정의된다.
2. 감염 매체에 원하는 치료 화합물을 희석. 모든 치료에 대한 하나의 배 마스터 혼합 희석이 만든 우물 (50 ㎕를 각각 여섯 96 우물에 대한 예를 들어, 350 ㎕의 총 부피) 복제에 적용해야합니다.
   1. 감염 매체로 실험 화합물을 희석.
   2. 감염 매체로 차량 제어 용매 (예를 들어, PBS, DMSO)를 희석. 참고 : 실험 화합물 (예를 들면 적용로 IBT 재고가 DMSO로 만든 최종 concentratio에 사용하는 경우 차량 제어 용매 비슷한 최종 농도가 사용되어야한다1 μL의 NS는 /​​ ㎖, 다음 차량 제어로 1 μL / ㎖)에 혼자 DMSO를 사용합니다.
   3. 감염 매체로 제어 화합물을 희석. 추천 제어 화합물은 다음을 포함한다 : 3.6 μM (1 ㎍ / ㎖) 1-β-D-Arabinofuranosylcytosine (ARAC), 50 μM (11.7 ㎍ / ㎖) 이사 틴 β-thiosemicarbazone (IBT), 60 μM (50 ㎍ / ㎖) 리팜피신, 또는 5 μM (1.9 ㎍ / ㎖) ST-246 ^8,15,16. 기대 효과에 대한 대표 결과를 참조하십시오. 참고 :이가 아니라 이미 볼륨에 1:1 비율로 첨가되어 있기 때문에 두 배 (2 배) 원하는 최종 농도를 희석합니다.
3. 즉시 바이러스를 첨가 한 후, 단계 2.2에 희석 원하는대로 처리 및 컨트롤을 포함하는 50 ㎕의 감염 미디어를 추가 할 수 있습니다. 참고 : 초기 단계 표현하기 전에 억제를위한 분석 실험하기 위해, 화합물 (들) 중 하나를 희석 바이러스 접종 물 (단계 2.1.2)에 직접 추가 할 수 있습니다 또는 (단계 2.1.3 전) 감염하기 전에 세포를 호스트 할 수 있습니다.
4. 37 & #에 6-24 시간을 품어176, C 배양기 + 5 % CO _2.

3. 셀 수정

1. 물론 이미 각 감염 미디어에 100 μL에게 8 % 파라 포름 알데히드를 첨가하여 세포를 고정합니다. 빛으로부터 보호 된 15 분 동안 실온에서 배양한다. 참고 :이 높은 역가 미디어는 이전의 고정 폐기물 접시에 직접 반전 경우 발생할 수있는 전염성 우두의 에어로졸을 방지하기 위해 직접 감염 미디어에 배 PFA (8 %)를 추가하는 것이 좋습니다.
2. 폐기물 접시에 반전 판에 의해 정착을 제거합니다.
3. 실내 온도 PBS 100 μl를 추가합니다.
4. 광학적으로 명확한 접착 필름과 플레이트를 밀봉. 참고 : 바로 읽을 경우 플레이트가 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 분광 측정을 왜곡에서 응축을 방지하기 위해 읽기 전에 실온에 밀봉 판을 반환해야합니다.

4. 바이러스의 성장을 정량화

1. 엔드 포인트 mCherry 금성, 587:610에 대한 515:53​​0에서 형광 및 415:457 F를 측정또는 TagBFP (흥분 : 뉴 멕시코에있는 발광 파장). 네 측정은 각 채널에 최적화 된 게인 설정을 사용하여 잘 당 평균되어야한다. 주 : 해당 발광 파장이 플레이트 리더의 특정 모델 및 필터 특성에 따라 다를 수 있습니다. 이것은 각각의 채널에 대한 TrpV 및 PLV 간의 큰 차이가있는 점을 결정하는 발광 파장 스캔을 수행하여 경험적으로 결정될 수있다.
2. 실험의 비교를 용이하게하기 위해 원시 데이터를 정규화.
   1. 각 채널 복제 TrpV과 PLV 우물의 평균을 결정합니다.
   2. 각 치료에 대한 평균 TrpV에 감염된 실험 측정에서 평균 PLV-감염 배경 측정을 뺍니다.
   3. 물론 차량 전용 값함으로써 각각 배경 차감 값으로 나누어 정규화 데이터.
   4. 실험을 여러 번, 분산 단방향 분석 (일방 ANOVA) 시험 및 체류 C 반복되면omparison 사후 테스트는 치료의 각각의 채널에 대한 차량 전용 처리에서 통계적으로 유의 한 차이를 반영하는 경우를 결정하기 위해 수행 될 수있다.

. 5 대체 프로토콜 : 운동 플레이트 분석 실험

1. 치료의 추가를 통해 모든 단계를 수행 (2.3 단계).
2. 플레이트 리더 실에서 접착 필름 및 장소 인감 플레이트는 37 ℃로 평형 참고 : 특별한주의가 과도한 세포 스트레스 및 응축을 방지하기 위해 37 ° C에서 지속적으로 번호판을 유지하기 위해주의해야합니다. 운동 분석을 위해, 5 % CO _2의 첨가없이 적당한 pH를 유지하도록 완충 매체 (중탄산 나트륨 및 HEPES)를 사용하는 것이 특히 중요하다.
3. 고정 플레이트 리더는 나중에 포인트의 포화를 방지하기 위해 수동으로 얻을 수 있습니다. 참고 : 정확한 이득 최적화는 유사한 조건 하에서 끝점 세이를 수행함으로써 획득 될 수있다.
4. 8-24 HPI에 대한 시간별 측정 값을 수집하고 시미를 사용하여 정상화엔드 포인트 분석에서와 같이 LAR 절차 (4.2 단계).
5. 개별 시점은 전술 종점 분석법으로 유사한 방법을 이용하여 통계적인 유의성을 분석 할 수있다.

결과

이러한 바이러스의 일반적인 사용의 예로서, 삼중 형광 리포터 바이러스는 몇개의 잘 정의 된 폭스 바이러스 억제제의 억제의 점과 비교하기 위해 사용되었다.

헬라 세포는 검은 벽으로 둘러싸인 맑은 평면 바닥 96 - 웰 플레이트를 처리하고 하룻밤 배양 조직 문화에서 도금했다. (TrpV, 표 1) 합류 단층은 트리플 기자 바이러스를 사용하여 10의 감염의 다중성 (MOI)?...

토론

여기, 우리는 바이러스 복제의 재현, 실시간 피드백 조치를 제공하는 다단계 우두 기자 바이러스 (TrpV)의 실제 사용을 설명했다. 잘 정의 된 폭스 바이러스 억제제를 사용하여, 우리는 TrpV 각 억제제에 대한 행동의 이해 메커니즘에 부합하는 방식으로 응답하는 것을 보여줄 수 있었다. TrpV 바이러스는 바이러스 스테이지 진행에 대한 가장 포괄적 인 정보를 제공하고 있지만, 두 단계 (IREV, LREV) 및 단...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065
Fetal Bovine Serum - Optima, Heat Inactivated (FBS)	Atlanta Biologicals	S12450H
200 mM L-Glutamine, (L-glut)	Gibco	25030-081
96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates	Corning	3603
384 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates	Corning	3712
Trypsin, 2X, Sterile, Irradiated	Worthington Biochemical Corp.	TRLVMF
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-023
Dimethyl Sulfoxide, Cell Culture (DMSO)	American Bioanalytical	AB03091
1-β-D-Arabinofuranosylcytosine  (AraC), MW= 280 g/mol	SigmaAldrich Co	C6645
isatin β -thiosemicarbazone (IBT), MW= 234 g/mol	Fisher Scientific	NC9075202
Rifampicin, MW= 823 g/mol	SigmaAldrich Co	R3501
ST-246, MW= 376 g/mol	SIGA Labs, Corvallis, OR
8% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	157-8
TempPlate RT optically clear film	USA Scientific	2978-2700
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Gibco	31985-070