Reporter vaccine virus pour quantifier la fonction virale à toutes les étapes de l'expression des gènes

Résumé

Nous décrivons l'utilisation d'un virus de la vaccine rapporteur fluorescent qui permet la mesure en temps réel de l'infectivité virale et l'expression des gènes par le biais de l'expression spécifique au stade de fluorophores spectralement distincts rapporteurs. Nous détaillons une méthode basée plaque pour identifier avec précision l'étape à laquelle la réplication du virus est affecté en réponse à petite molécule inhibition.

Résumé

Les poxvirus sont une famille de virus à ADN à double brin qui comprennent des agents pathogènes humains actifs tels que la variole du singe, le molluscum contagiousum et Contagalo virus. La famille comprend également le virus de la variole, de la variole. En raison de la complexité de la réplication du virus de la variole, de nombreuses questions restent encore en ce qui concerne leur stratégie de l'expression des gènes. Dans cet article, on décrit la conception et l'utilisation des virus de la vaccine recombinants qui permettent de mesurer en temps réel des étapes uniques et multiples de l'expression du gène viral dans un format à haut débit. Cela est rendu possible grâce à l'utilisation de protéines fluorescentes spectralement distinctes comme reporters pour chacune des trois étapes de la réplication virale. Ces virus constituent un rapport signal-bruit tout en conservant les modes de scène spécifiques d'expression, permettant des analyses basées sur plaque et observations microscopiques de la propagation du virus et la réplication. Ces outils ont des utilisations pour la découverte d'antiviraux, les études de l'interaction virus-hôte, et bio évolutivelogie.

Introduction

Traditionnellement, l'expression de virus est étudiée en utilisant des techniques de biologie moléculaire (par exemple de transfert de Northern, Western blot, hybridation microarray, etc) ^1. Bien que ces méthodes sont capables de fournir des informations détaillées en ce qui concerne la catégorisation des changements de l'expression des ARNm ou des protéines individuelles, ils ne sont généralement pas prêter à des processus en temps réel et à haut débit. Des approches alternatives à l'aide de journalistes basés sur la fluorescence ont été appliquées auparavant lorsque vous travaillez avec des poxvirus; Cependant, leur développement et leur utilisation a été motivé par des objectifs variés. Plusieurs de ces méthodes ont été conçues pour la sélection de virus recombinants ^2,3. Ces techniques exprimer EGFP lors de la constitution et de l'expression de l'ADN exogène à partir de clones de la vaccine recombinants bon. De même, plusieurs souches de la vaccine exprimant de manière stable soluble ou EGFP protéines GFP-étiqueté exprimées sous un promoteur de la vaccine natif ont été largement utilisés. Ce sont typquement utilisé pour quantifier l'entrée et la replication du virus au cours de dosages de neutralisation à base d'anticorps, l'inhibition chimique, ou la comparaison de l'efficacité antivirale ^6.4. Bien que ces virus se sont révélés utiles, ils sont limités dans leur capacité à fournir des informations détaillées sur le point d'inhibition en raison de leur utilisation d'un seul promoteur précoce / tardif virale ambiguë. Les méthodes précédentes ont également fait usage de la protéine EGFP avec des caractéristiques sous-optimaux signal-bruit.

En raison de la complexité de la réplication du virus de la variole et le manque d'outils existants disponibles pour analyser les changements en temps réel de l'expression des gènes viraux, nous avons développé une série de virus rapporteurs unique et multi-étape ^7,8. Comme décrit dans les publications précédentes, ces virus expriment un, deux, ou trois protéines fluorescentes spectralement distinctes de promoteurs de la vaccine indigènes au début, des étapes intermédiaires, ou à la fin de l'infection. Ces virus peuvent nous êtreed comme indicateurs de progrès réplication du virus en utilisant un microscope à fluorescence et ils conviennent aussi bien pour la plaque et-lecteur basé tests à haut débit. Ces virus sont faciles à utiliser à la place de virus de type sauvage, de plus en plus avec une cinétique similaire pour atteindre titres équivalents ^7. Lors de la planification et de la création de ces virus, on a pris soin dans le choix des fluorophores ayant des caractéristiques élevées signal à fond avec une efficacité supérieure de pliage pour faciliter la quantification fiable avec retour rapide à des changements dans l'expression (Vénus, mCherry et TagBFP). En outre, des combinaisons de promoteurs viraux ont été choisis qui produisent de haute fidélité, l'expression spécifique de stade sans ambiguïté, fournissant des informations sur la gamme complète de début (promoteur C11R), intermédiaire (promoteur G8R) et la fin (promoteur F17R) l'expression des gènes, contrairement aux ambiguë promoteurs début / fin.

Ces virus peuvent être utilisés comme un outil pour investigating le cycle de vie du virus de la variole, le virus de la vaccine prototypique. Beaucoup ne sait toujours pas sur l'interaction hôte-virus malgré sa longue histoire de l'étude. Vaccine est complexe, produisant plus de 200 protéines uniques, dont beaucoup sont des immunomodulateurs et hébergent antagoniste. Lors de l'infection, le virus de la vaccine commence immédiatement tôt transcription de l'ARNm. Ceci est facilité par une ARN polymérase et des facteurs de transcription qui ont été chargés sur le génome viral lors de l'emballage du virion et détenus dans un état de pause jusqu'à ce que l'infection ultérieure. Cette expression précoce produit principalement des protéines nécessaires à la suppression du système immunitaire de l'hôte (ARNm de décapsulage, l'ARN double brin séquestration, et des protéines réceptrices leurres ainsi que des inhibiteurs de l'apoptose, la réponse au stress, et Toll, IL, et la signalisation NF-kB) et la réplication du génome. Expression précoce produit également des facteurs nécessaires à l'expression intermédiaire de transcription. Intermédiaire expression inclut l'expression de facteurs de transcription de fin d'étape. Ceexpression cascade conduit à la production de protéines structurales et enzymatiques virales au cours des stades tardifs de l'infection, qui sont nécessaires pour l'assemblage du virion complet de la vaccine mature.

Notre série de virus rapporteurs fluorescents permet de progresser plus rapidement réalisés dans la compréhension de la biologie poxvirus. L'une des méthodes les plus courantes et fastidieuses dans le domaine de la virologie est le test de croissance. Cela implique généralement l'infection des cellules, l'adoption d'une série de traitements, le virus de la récolte par la lyse des cellules infectées, et de quantifier le titre viral obtenue par dosage de plaque. Utilisation des virus rapporteurs décrits ici permet la mesure en temps réel de la croissance du virus qui peut être facilement testée et comparée entre les nombreux traitements effectués en parallèle. Nous prévoyons que cet ensemble de réactifs est utilisé dans divers protocoles pour identifier des altérations de l'expression des gènes viraux en réponse à un traitement médicamenteux, l'ARNi knockdown, ou restriction de la gamme d'hôtes.

Cette méthode permet également l'analyse à haut contenu sur une plus grande échelle qu'auparavant, permettant à haut débit de dépistage de drogues anti-viraux pour les étapes cibles spécifiquement définis d'intérêt. Alors que de nombreux traitements possibles pour lutter contre l'infection par le virus de la variole ont été identifiés, le seul approuvé par la FDA des thérapies efficaces pour le traitement de l'infection par le virus de la variole sont nucléoside acyclique phosphonate, cidofovir, et le traitement par la vaccine immunoglobuline ^9,10. Malgré l'éradication de la variole en 1977 ^11, poxvirus restent une menace importante pour la santé humaine ^12. Arrêt de la vaccination généralisée contre les virus de la variole a conduit à une sensibilité accrue à d'autres poxvirus ^13. Par exemple, les régions de l'Afrique centrale qui étaient auparavant protégés par la vaccination connaissent une forte augmentation des infections par le virus monkeypox ^14. Préoccupation importante a également étésoulevées au sujet de la sensibilité latente à la libération intentionnelle du virus de la variole. En raison des thérapies limitées actuellement disponibles, il ya un besoin urgent de développer de nouveaux traitements. Ces virus rapporteurs permettent le dépistage d'inhibiteur de petite molécule rapide et à haut débit pour l'inhibition d'une étape spécifique de la réplication virale. Identification d'inhibiteurs qui ciblent les stades d'expression viraux actuellement pas la cible d'inhibition facilitera le développement de thérapies de combinaison avec une puissance accrue.

Beaucoup de choses peuvent être tirées à propos de la vaccine biologie cellulaire en observant les changements dans l'expression des gènes de chaque étape. Atténuation par manipulation chimique ou génétique d'une cellule hôte infectée est généralement exprimée en termes de titres viraux réduits. Toutefois, en comparant les changements dans chaque étage de la cascade d'expression viral, on peut obtenir une compréhension plus complète de la façon de fitness viral est l'impacted par un traitement particulier. Ces données ont été montré une bonne corrélation avec la sortie traditionnelle du titre de virus, mais de fournir des informations plus détaillées mécanique ainsi que des capacités à haut débit ^7.

Protocole

1. Cellules de la plaque

1. Dissocier les cellules HeLa de la plaque et diluer dans un milieu de croissance (DMEM, 2 mM de L-surabondance, 10% de FBS) à environ 2,0 x 10 ⁵ cellules / ml. Distribuer 100 pl / puits dans une plaque à fond plat noir clair paroi de 96 puits (20 000 cellules / puits).
2. Incuber les cellules pendant 24 heures jusqu'à la confluence dans un incubateur à 37 ° C + 5% CO _2.

2. Infecter les cellules

1. Diluer virus et infecter les cellules.
   1. Dégel TRPV (virus Triple; début Vénus, intermédiaire mCherry, fin TagBFP) et PLV (promoteur-moins Vénus) virus fluorescent et ventiler l'aide ultrasons pendant 5 minutes. En variante, les stocks de virus brut peuvent être mélangés à 1:1 avec 0,25 mg / ml de trypsine dans un milieu d'infection et incubées à 37 ° C pendant 30 min.
   2. Diluer stocks de virus brut dans 37 ° C médias d'infection (DMEM, 2 mM de L-surabondance, 2% de FBS). Pour les infections à MOI élevé (10 PFU / cellule), diluer stock de virus à 1,0 x 10 ⁷ UFP / ml en supposant 5 x 10 ⁴cellules / puits et le volume de l'inoculum de 50 ul. Plan sur infecter 3 puits réplicats pour chaque traitement avec TRPV et 3 autres puits répétés pour le même traitement avec PLV pour tenir compte de la fluorescence de fond propres à chaque traitement.
   3. Infecter puits en ajoutant 50 virus de pl / puits dilué dans les médias d'infection. Elle est définie comme une infection temps = 0 h post (0 hpi).
2. Diluer les composés de traitement souhaités dans les médias d'infection. Pour tous les traitements d'un seul master mix 2x dilution doit être établie et appliquée pour reproduire puits (par exemple 350 pi volume total de six à 96 puits avec 50 pi de chacun).
   1. Diluer composés expérimentaux dans les médias d'infection.
   2. Diluer le contrôle-véhicule solvant (par exemple PBS, DMSO) dans le milieu de l'infection. Remarque: les concentrations finales similaires de solvants véhicule de contrôle devraient être utilisées comme appliquée pour les composés expérimentaux (par exemple si votre IBT stock est fait avec du DMSO et utilisé à une concentratio finalens de 1 pl / ml, puis utilisez DMSO seul à 1 pl / ml que le contrôle du véhicule).
   3. Diluer composés de contrôle dans les médias d'infection. Composés de commande recommandées comprennent: 3,6 uM (1 pg / ml) de 1-β-D-arabinofuranosylcytosine (AraC), 50 uM (11,7 ug / ml) isatine β-thiosemicarbazone (IBT), 60 uM (50 pg / ml) rifampicine, ou 5 uM (1,9 pg / ml) ST-246 ^8,15,16. Voir résultats représentatifs pour les effets escomptés. Remarque: rendre cette dilution à deux fois (2x) à la concentration finale désirée puisque ceci est ajouté à un rapport de 1:1 avec le volume déjà dans le puits.
3. Immédiatement après l'ajout de virus, ajouter 50 médias d'infection ul contenant les traitements et les contrôles souhaités comme dilué dans l'étape 2.2. Remarque: Pour doser l'inhibition de l'expression avant de stade précoce, le composé (s) peut soit être ajouté directement à l'inoculum de virus dilué (étape 2.1.2), ou aux cellules hôtes avant l'infection (avant l'étape 2.1.3).
4. Incuber 6-24 h dans un 37 & #176; incubateur C + 5% CO _2.

3. Fixer les cellules

1. Fixer les cellules en ajoutant 100 pi 8% de paraformaldéhyde aux médias de l'infection déjà dans chaque puits. Incuber à température ambiante pendant 15 min à l'abri de la lumière. Note: Il est recommandé d'ajouter 2x PFA (8%) directement sur un support d'infection pour empêcher aérosol de la vaccine infectieuse qui peut se produire si les médias à titre élevé est inversée directement dans le plat des déchets avant la fixation.
2. Retirer fixateur en retournant la plaque dans le plat de déchets.
3. Ajouter 100 ul de PBS température ambiante.
4. Sceller la plaque avec un film adhésif optiquement clair. Remarque: Les plaques peuvent être conservés à 4 ° C si pas lire immédiatement. Soyez sûr de revenir plaques scellées à la température ambiante avant de le lire pour éviter la condensation de fausser les mesures du spectrophotomètre.

4. Quantifier la croissance du virus

1. Mesurer critère fluorescence à 515:530 pour Vénus, 587:610 pour mCherry, et 415:457 fou TagBFP (excitation: longueur d'onde d'émission en nm). Quatre mesures devraient être en moyenne par puits en utilisant les réglages de gain optimisés pour chaque canal. Remarque: La longueur d'onde d'émission approprié peut être différente en fonction des caractéristiques des modèles et de filtrage spécifiques de votre lecteur de plaques. Ceci peut être déterminé de façon empirique en réalisant un balayage de longueur d'onde d'émission afin de déterminer le point où se trouve la plus grande différence entre TRPV et PLV pour chaque canal.
2. Normaliser les données brutes pour faciliter la comparaison entre les expériences.
   1. Pour chaque canal, déterminer la moyenne de répétition TRPV et puits de PLV.
   2. Soustraire les moyennes des mesures de fond PLV-infectés à partir des mesures expérimentales TRPV infectés moyennes pour chaque traitement.
   3. Normaliser les données en divisant chaque valeur soustraite fond par la valeur d'un véhicule uniquement bien.
   4. Une fois une expérience a été répétée plusieurs fois, une analyse unidirectionnelle de variance (ANOVA) et test de multiples comparaison post-test peut être effectué afin de déterminer si l'un quelconque des traitements reflète une différence statistiquement significative par rapport au traitement avec le véhicule seulement pour chaque canal.

. 5 Alternative Protocole: essais sur plaque cinétiques

1. Effectuez toutes les étapes par l'ajout de traitements (étape 2.3).
2. Sceller la plaque avec un film adhésif et le lieu dans la chambre de lecteur de plaque équilibré à 37 ° C. Remarque: Une attention particulière doit être prise pour garder plaques constamment à 37 ° C pour prévenir le stress cellulaire excessive et la condensation. Pour les essais cinétiques, il est particulièrement important d'utiliser un milieu tamponné (bicarbonate de sodium et de l'HEPES) pour maintenir le pH correct, sans addition de 5% de CO _2.
3. Ensemble lecteur de plaque obtenir manuellement pour empêcher la saturation de points de temps ultérieurs. Remarque: l'optimisation de gain précis peut être obtenue en réalisant un essais finaux dans des conditions similaires.
4. Acquérir des relevés horaires pour 8-24 hpi et normaliser au moyen de simiprocédure de lar comme dans l'essai de point de terminaison (étape 4.2).
5. Points dans le temps individuel peuvent être analysées pour la signification statistique en utilisant des méthodes similaires que l'essai du point de terminaison décrit précédemment.

Résultats

A titre d'exemple de l'utilisation normale de ces virus, le virus triple fluorescence reporter a été utilisé pour comparer le point d'inhibition de plusieurs inhibiteurs de poxvirus bien définies.

Des cellules HeLa ont été étalées dans une culture tissulaire traitée claires des plaques à 96 puits à fond plat à parois noires et incubées pendant une nuit. Des monocouches confluentes ont été infectées à une multiplicité d'infection (MOI) de 10 en utilisant soit...

Discussion

Ici, nous avons décrit l'utilisation pratique d'un virus de la vaccine reporter multi-étape (TRPV), qui fournit reproductibles, en temps réel des mesures de rétroaction de la réplication du virus. En utilisant des inhibiteurs de poxvirus bien définis, nous avons pu montrer que TRPV répond d'une manière compatible avec le mécanisme d'action compris pour chaque inhibiteur. Alors que le virus TRPV fournit l'information la plus complète à propos de la progression de la phase de virus, en deux ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065
Fetal Bovine Serum - Optima, Heat Inactivated (FBS)	Atlanta Biologicals	S12450H
200 mM L-Glutamine, (L-glut)	Gibco	25030-081
96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates	Corning	3603
384 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates	Corning	3712
Trypsin, 2X, Sterile, Irradiated	Worthington Biochemical Corp.	TRLVMF
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-023
Dimethyl Sulfoxide, Cell Culture (DMSO)	American Bioanalytical	AB03091
1-β-D-Arabinofuranosylcytosine  (AraC), MW= 280 g/mol	SigmaAldrich Co	C6645
isatin β -thiosemicarbazone (IBT), MW= 234 g/mol	Fisher Scientific	NC9075202
Rifampicin, MW= 823 g/mol	SigmaAldrich Co	R3501
ST-246, MW= 376 g/mol	SIGA Labs, Corvallis, OR
8% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	157-8
TempPlate RT optically clear film	USA Scientific	2978-2700
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Gibco	31985-070