Gen İfade Tüm Dönemlerinde Viral Fonksiyonu sayısallaştırabilmek için vaksiniya Reporter Virüsler

Özet

Bu spektral farklı raportör florofor safha spesifik ifadesi ile bir viral enfeksiyon ve gen ifadesinin gerçek zaman ölçümünü sağlayan bir flüoresan raportör ineklerdeki çiçek hastalığı virüsünün kullanımını tarif eder. Bu detay doğru virüs çoğaltma, küçük moleküllü inhibisyonuna yanıt olarak etkilendiği aşama belirlenmesi için, bir plaka-bazlı yöntem.

Özet

Poxvirüsler aktif insan gibi Monkeypox gibi patojenleri, molluscum contagiousum ve Contagalo virüsü, çift sarmallı DNA virüsleri bir aileyiz. Aile de çiçek virüsü, Variola içerir. Nedeniyle poksvirüs çoğaltma karmaşıklığı, pek çok soru hala gen ekspresyon stratejisine ilişkin kalır. Bu yazıda, bir yüksek verimli bir biçimde viral gen ekspresyonu, tek ve çok sayıda etap gerçek zaman ölçümünü sağlayacak rekombinant vaccinia virüsleri kavramsallaştırılmasını ve kullanımını tarif eder. Bu, viral replikasyon üç aşamada her biri için ayrı bir muhabir olarak, spektral floresan proteinlerinin kullanımı ile etkinleştirilir. Aşama özel ekspresyonu, etkinleştirme plaka bazlı tahliller ve virüs yayılması ve replikasyon mikroskobik gözlemler korurken Bu virüsler yüksek sinyal-gürültü oranını sağlar. Bu araçlar antiviral keşif, virüs-konak etkileşim çalışmaları, ve evrimsel biyo için kullanan varlogy.

Giriş

Geleneksel olarak, virüs ifade moleküler biyoloji teknikleri (örneğin, Kuzey leke, western blot, mikrodizi hibridizasyon, vb) ¹ kullanılarak incelenmiştir. Bu yöntemler bireysel mRNA veya protein ifadesini değiştirir kategorize ile ilgili detaylı bilgi sağlama yeteneğine sahip olsa da, bunlar genellikle gerçek zamanlı ve yüksek verimli işlemlere uygun değildir. Poksvirüslerden çalışırken floresan tabanlı gazetecilere kullanarak alternatif yaklaşımlar önceden uygulanmış; Ancak, onların gelişimi ve kullanımı çeşitli amaçlarla tarafından motive edilmiştir. Bu gibi birkaç yöntem rekombinant virüslerin ^2,3 seçimi için tasarlanmıştır. Bu teknikler dahil edilmesi ve uygun rekombinant vaccinia klonlardan eksojen DNA'nın sentezlenmesi üzerine EGFP ifade eder. Benzer şekilde, birçok aşı suşları stabil bir şekilde çözünür EGFP ifade eden ya da yerel bir ineklerdeki çiçek hastalığı promotörün kontrolü altında eksprese GFP-etiketli proteinler, yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu tip vardırically virüs giriş ve replikasyon antikor bazlı nötralizasyon deneyleri sırasında, kimyasal önleme veya antiviral etkinliği ^4-6 karşılaştırma ölçmek için kullanılır. Bu virüsler yararlı olduğu kanıtlanmış olsa da, onlar yüzünden bir tek muğlak erken / geç viral desteğin onların kullanımına engellenmesi noktası hakkında detaylı bilgi vermek için kendi yeteneği sınırlıdır. Önceki yöntemler de optimal sinyal-gürültü özellikleri ile EGFP protein kullanımı yaptık.

Nedeniyle poksvirüs çoğaltma ve viral gen ifadesinde gerçek zamanlı değişiklikleri tahlil için kullanılabilir mevcut araçların eksikliği karmaşıklığı, biz tek ve çok kademeli muhabiri virüsler ^7,8 paketi geliştirdik. Daha önceki yayınlarda tarif edildiği gibi, bu virüsler, erken enfeksiyon içinde bir ara madde ya da geç aşamaları sırasında bir, iki, veya yerel vaccinia promoterler üç ayrı spektral floresan proteinleri ifade eder. Bu virüsler bizi olabilirflöresanlı bir mikroskop kullanılarak virüs replikasyonu ilerleme göstergesi olarak ed ve yüksek verimli ve plaka-okuyucu bazlı tahliller için de aynı derecede uygundur. Bu virüsler eşdeğer titreleri ⁷ ulaşmak için benzer kinetik ile büyüyen, yabani tip virüs yerine kullanmak kolaydır. Planlama ve bu virüslerin yaratılması sırasında, çok bakım ifadesi (Venüs, mCherry ve TagBFP) değişikliklere hızlı bir geri besleme ile güvenilir ölçümü kolaylaştırmak için üstün katlama verimlilik ile yüksek sinyal-zemin özelliklerine sahip florosforlar seçiminde alındı. Ek olarak, viral promoterlerin kombinasyonları belirsiz aksine, yüksek bağlılık, açık safha spesifik ifadesi, (C11R promoter) erken dizi hakkında bilgi veren, ara madde (G8R promotör) ve geç (F17R promoter) gen ekspresyonunu üreten seçilmiştir erken / geç promoterleri.

Bu virüsler inve için bir araç olarak da kullanılabilirPrototipik çiçek virüsü, vaccinia virüs yaşam döngüsünü stigating. Çok çalışmanın uzun tarihine rağmen hala konak-virüs etkileşimi hakkında bilinen değildir. Vaksiniya immunomodulator ve uzlaşmaz ev sahipliği birçoğu 200 üzerinde benzersiz proteinlerini üreten, karmaşık. Enfeksiyon üzerine, ineklerdeki çiçek hastalığı virüsü erken hemen mRNA transkripsiyonunu başlar. Bu virion paketleme sırasında viral genom üzerinde yüklenir ve daha sonraki enfeksiyonlar kadar durdurulmuş halde yapıldı bir RNA polimeraz ve transkripsiyon faktörleri tarafından kolaylaştırılır. Bu erken ifade esas konakçı bağışıklık sistemi (mRNA Dekapaj, dsRNA sekestrasyon ve yem reseptör proteinleri hem de apoptoz inhibitörleri, stres tepkisi ve Toll, IL, ve NF-KB sinyal) ve genom replikasyon bastırılması için gerekli proteinler üretir. Erken ifade aynı zamanda ara ekspresyon için gerekli transkripsiyon faktörlerini üretir. Ara madde ifade geç aşama transkripsiyon faktörlerinin ortaya çıkarılmasını içerir. Buifade kademeli olgun vaccinia virionun tam montaj için gerekli olan enfeksiyonun geç aşamalarında sırasında yapısal ve enzimatik virüs proteinlerinin üretimine yol açar.

Floresan haberci virüslerinin Bizim grubu poksvirüs biyoloji anlaşılmasında yapılacak hızlı bir ilerleme sağlar. Viroloji alanında en yaygın ve zaman alıcı bir yöntemlerden biri büyüme deneyidir. Bu, tipik olarak, hücrelerin enfekte enfekte hücreleri lize ile tedaviler, hasat virüs bir dizi yürürlüğe koymak ve plak tahlili ile elde edilen viral titresi miktarının içerir. Burada açıklanan raportör virüs kullanılarak kolayca deneye tabi tutulur ve paralel olarak gerçekleştirilen işlemler arasında çok sayıda mukayese edilebilir virüs büyüme gerçek zaman ölçümünü sağlar. Bu reaktifler, bu dizi ilaç tedavisi, RNAi k tepki olarak viral gen ekspresyonunda değişiklikler belirlenmesi için çeşitli protokoller kullanılacak öngörmeknockdown, veya konak aralığı kısıtlama.

Bu yöntem de ilginç spesifik olarak tanımlanmış hedef aşamaları için yüksek verimli bir anti-viral ilaç ekranlar için izin veren, önceden mevcut olandan daha büyük bir ölçekte, yüksek içerik analizini sağlar. Çiçek virüsü enfeksiyon ile mücadele etmek için çok sayıda olası tedaviler tespit edilmiş olsa da, sadece FDA çiçek virüsü enfeksiyonunun tedavi edilmesi için etkili tedaviler Asiklik nükleosit fosfonat, Cidofovir, ve vaccinia immün globulin ^9,10 ile tedavi edilir onayladı. 1977 ¹¹ çiçek eradikasyonu rağmen, poxvirüsler insan sağlığı ¹² için önemli bir tehdit olmaya devam etmektedir. Variola virüsüne karşı yaygın aşılama bırakma diğer çiçek virüsleri ¹³ için artmış duyarlılık yol açmıştır. Örneğin, daha önce aşılama tarafından korunan Orta Afrika bölgelerinde Monkeypox virüs enfeksiyonlarına ¹⁴ bir artış yaşanıyor. Önemli endişe de olmuşturVariola virüsün kasıtlı serbest bırakılması için gizli duyarlılık konusunda kaldırdı. Nedeniyle, şu anda mevcut olan sınırlı tedavilere, yeni tedavilerin geliştirilmesi yönünde acil bir ihtiyaç vardır. Bu raportör virüsler, viral replikasyonun spesifik bir aşamasının önlenmesi için hızlı ve yüksek verimli, küçük molekül inhibitörü, tarama izin verir. Inhibisyon anda değil hedef viral sentezleme evreleri hedefleyen önleyicilerinin tespiti yüksek etki ile kombinasyon tedavilerinin geliştirilmesini kolaylaştırır.

Kadar her aşamanın gen ifadesi değişikliklerini gözlemleyerek aşı hücre biyolojisi hakkında toplanan olabilir. Kimyasal ya da enfekte olmuş konakçı hücrenin genetik manipülasyonu ile zayıflatılması tipik haliyle düşük viral titreleri cinsinden ifade edilir. Ancak, viral sentezleme kaskadının her safhasında değişiklik karşılaştırarak, bir virüs uygunluk etkisinin ne kadar daha kapsamlı bir anlayış elde edebilirsinizBelirli bir tedavi ile ed. Bu veriler geleneksel virüs titresi çıkışı ile iyi bir korelasyon, ancak daha detaylı bilgi mekanistik hem de yüksek miktarda ⁷ yetenekleri temin ettiği gösterilmiştir.

Protokol

1.. Plaka Hücreler

1. Plakasından HeLa hücreleri ayırmak ve yaklaşık olarak 2.0 x 10 ⁵ hücre / ml büyüme ortamı (DMEM, 2 mM L-fazlalığı,% 10 FBS) içerisinde seyreltin. , Siyah duvarlı, şeffaf, düz tabanlı 96 oyuklu bir plakanın (20,000 hücre / oyuk) içinde 100 ul / oyuk dağıtın.
2. +% 5 _CO2 37 ° C kuluçka makinesi içinde birleşene kadar 24 saat boyunca inkübe hücreleri.

2.. Hücreleri enfekte

1. Virüs sulandırmak ve hücreleri enfekte.
   1. Çözülme TRPV (Triple virüsü; Erken Venüs, Orta MCherry, Geç TagBFP) ve PLV (Promotörle az Venüs) floresan virüs ve 5 dakika boyunca Sonikasyon kullanarak ayrıştırılacaktır. Seçenek olarak ise, ham virüs stokları enfeksiyonu ortam içinde 0.25 mg / ml tripsin ile 1:1 karıştırıldı ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilebilir.
   2. 37 ° C enfeksiyon ortamı (DMEM, 2 mM L-fazlalığı,% 2 FBS) içinde, ham virüs stokları seyreltin. Yüksek İçişleri Bakanlığı enfeksiyonları (10 PFU / hücre) için, PFU / ml 5 x 10 ⁴ varsayarak 1,0 x 10 ⁷ virüs stok sulandırmakiyi hücre / 50 ul bir inokulum hacmi. TRPV her tedavi ve her bir tedaviye özel eşiğe hesaba PLV ile aynı tedavi için bir başka 3 suret kuyu boyunca 3 suret kuyu enfekte planı.
   3. Enfeksiyon ortam içinde 50 ul / göz miktarında seyreltilmiş virüs eklenerek kuyu Infect. Bu sefer = 0 saat sonrası enfeksiyon (0 HPI) olarak tanımlanır.
2. Enfeksiyon ortamı içine arzu edilen tedavi bileşikleri seyreltin. Tüm tedaviler için tek bir ana karışım 2x seyreltme yapılmış ve kuyu (50 ul, her altı 96-kuyu için, örneğin 350 ul toplam hacim) çoğaltmak için uygulanmalıdır.
   1. Enfeksiyon ortama deney bileşikleri seyreltin.
   2. Enfeksiyon ortama araç kontrol çözücü (örneğin, PBS, DMSO) seyreltin. Not: Deney bileşikleri (örneğin başvurusunda olarak IBT stok DMSO ile yapılır ve nihai concentratio kullanılır ise araç kontrol çözücülerin benzer nihai konsantrasyonlar kullanılmalıdır1 ul ns / ml, daha sonra araç kontrolü olarak 1 ul / ml), tek başına DMSO kullanın.
   3. Enfeksiyon ortama kontrol bileşikleri sulandırmak. Tavsiye edilen kontrol bileşikler şunlardır: 3.6 uM (1 ug / ml) 1-β-D-arabinofuranosilsitosinin (AraC), 50 uM (11.7 ug / ml) isatin β-tiyosemikarbazon (IBT), 60 uM (50 ug / ml) Rifampisin, ya da 5 uM (1.9 ug / ml) ST-246 ^8,15,16. Beklenen etkileri Temsilcisi Sonuçları gör. Not: Bu da zaten birime bir 01:01 oranında ilave edilir Başlangıcı iki kez (2x) ile istenen son konsantrasyona bu seyreltme olun.
3. Hemen virüs ilave edildikten sonra, aşama 2.2 'de inceltilmiş olarak arzu edilen tedavi ve kontroller içeren 50 ul enfeksiyon ortamı eklenir. Not: Erken evre ifade önce engellenmesi için tahlil edilmesi için, bileşik (ler) ya da seyreltilmiş virüs aşı (aşama 2.1.2) doğrudan ilave edilebilir veya (aşama 2.1.3 önce), enfeksiyondan önce konakçı hücreler için.
4. 37 ve # 6-24 saat inkübe176; C inkübatör +% 5 CO _2.

3.. Hücreleri Fix

1. De daha önce her bir enfeksiyon ortam için 100 ul% 8 paraformaldehit ekleyerek, hücreler. Işıksız bir ortamda 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Not: Bu yüksek titre medya öncesinde tespit atık çanak doğrudan ters çevrilir ise oluşabilir bulaşıcı ineklerdeki aerosolizasyonu önlemek için doğrudan enfeksiyon medyaya 2x PFA (% 8) eklemek için önerilir.
2. Atık çanak içine plakayı baş aşağı çevirerek Fiksatif çıkarın.
3. Oda sıcaklığı PBS 100 ul ekleyin.
4. Optik olarak berrak yapışkan film ile plaka mühür. Not: hemen okuyun değilse Plakalar, 4 ° C'de saklanabilir. Spektrofotometre ölçümleri bozan yoğunlaşmayı önlemek için okumadan önce oda sıcaklığına mühürlü plakaları dönmek emin olun.

4. Virüs Büyüme belirlememize

1. Son nokta mCherry için Venüs, 587:610 için 515:530 de floresan ve 415:457 f ölçünveya TagBFP (Uyarım: nm emisyon dalga boyu). Dört ölçümleri, her bir kanal için optimize edilmiş kazanç ayarları kullanarak oyuk başına ortalaması alınmalıdır. Not: Uygun emisyon dalga plaka okuyucu özel model ve filtre özelliklerine bağlı olarak farklı olabilir. Bu, her bir kanal için TRPV ve PLV arasındaki en büyük fark yoktur noktayı belirlemek için bir emisyon dalga boyu tarama yaparak ampirik bir şekilde tespit edilebilir.
2. Deneyler arasındaki karşılaştırmayı kolaylaştırmak için ham veri normalleştirmek.
   1. Her bir kanal için, suret TRPV ve PLV kuyu ortalamasını belirler.
   2. Her tedavi için ortalama TRPV enfekte deneysel ölçümlerden elde edilen ortalama PLV enfekte arka ölçümleri çıkarın.
   3. De sadece araç verilen değer, her arka plan çıkarıldı değerine bölünerek verileri normalleştirir.
   4. Bir deney birden çok kez, varyans tek yönlü analizi (tek yönlü ANOVA) testi ve çoklu c tekrarlanan edildikten sonraomparison sonrası test tedavilerinin herhangi her kanal için sadece araç tedavisinden istatistiksel olarak önemli bir fark olup olmadığını belirlemek için yansıtmaktadır gerçekleştirilebilir.

. Alternatif 5 Protokol: Kinetik Plate Tahliller

1. Tedavilerin eklenmesi ile tüm adımları uygulayın (2.3 adım).
2. Plaka okuyucu odası içinde yapıştırıcı film ve yer ile mühür levhası 37 ° C'ye dengelenmiş Not: Özel bakım aşırı hücre stres ve yoğunlaşmayı önlemek için 37 ° C'de sürekli plakaları tutmak için alınmalıdır. Kinetik analizi için,% 5 _CO2 ilave olmadan uygun pH değerini muhafaza edilmesi için bir tamponlanmış ortam (sodyum bikarbonat ve HEPES) kullanmak için özellikle önemlidir.
3. Set plaka okuyucu sonra zaman noktalarında doymasını önlemek için el ele. Not: Doğru kazanç optimizasyonu benzer koşullar altında bir uç nokta tahlilleri gerçekleştirilerek elde edilebilir.
4. 8-24 HPI saatlik okumalar Edinme Simi kullanarak normalizeuç nokta deneyi gibi lar prosedürü (adım 4.2).
5. Bireysel zaman noktaları daha önce tarif edildiği nokta deneyi gibi benzer yöntemler kullanılarak istatistiksel olarak analiz edilebilir.

Sonuçlar

Bu virüslerin tipik bir kullanım örneği olarak, üç floresan haberci virüs çok iyi tanımlanmış bir çiçek virüsü inhibitörlerinin inhibisyon noktasını karşılaştırmak için kullanıldı.

HeLa hücreleri, siyah duvarlı açık, düz tabanlı 96 oyuklu plakalar işlemden geçirildi ve gece boyunca inkübe doku kültürü içinde plakalanmıştır. (TRPV Tablo 1) karışmış mono tabakalar üç raportör virüsü kullanarak 10 lik çoklu enfeksiyon (MOI) enf...

Tartışmalar

Burada, virüs replikasyonu, tekrar üretilebilir, gerçek zamanlı geri besleme ölçütleri temin eden bir çok-aşamalı vaccinia raportör virüsü (TRPV), pratik kullanımını tarif etmişlerdir. Iyi tanımlanmış bir çiçek virüsü inhibitörleri kullanarak, TRPV her bir inhibitör için eylem mekanizması ile anlaşılır uygun bir şekilde tepki olduğunu gösterebilmişlerdir. TRPV virüs virüs evre ilerleme hakkında en kapsamlı bilgi sunarken, iki aşamalı (IREV, LREV) ve tek kademeli (EV, IV, LV) vir?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065
Fetal Bovine Serum - Optima, Heat Inactivated (FBS)	Atlanta Biologicals	S12450H
200 mM L-Glutamine, (L-glut)	Gibco	25030-081
96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates	Corning	3603
384 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates	Corning	3712
Trypsin, 2X, Sterile, Irradiated	Worthington Biochemical Corp.	TRLVMF
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-023
Dimethyl Sulfoxide, Cell Culture (DMSO)	American Bioanalytical	AB03091
1-β-D-Arabinofuranosylcytosine  (AraC), MW= 280 g/mol	SigmaAldrich Co	C6645
isatin β -thiosemicarbazone (IBT), MW= 234 g/mol	Fisher Scientific	NC9075202
Rifampicin, MW= 823 g/mol	SigmaAldrich Co	R3501
ST-246, MW= 376 g/mol	SIGA Labs, Corvallis, OR
8% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	157-8
TempPlate RT optically clear film	USA Scientific	2978-2700
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Gibco	31985-070