וירוסי כתב Vaccinia לכימות פונקציה ויראלי בכל השלבים של ביטוי גנים

Summary

אנו מתארים את השימוש של וירוס vaccinia כתב ניאון המאפשר מדידה של infectivity הנגיפי וביטוי גנים בזמן אמת דרך הביטוי בשלב מסוים של fluorophores כתב ספקטרלית שונה. אנחנו פירוט שיטה המבוססת על צלחת לזיהוי מדויק השלב שבו שכפול נגיף מושפע בתגובה לעיכוב מולקולה קטן.

Abstract

Poxviruses הוא משפחה של וירוסי DNA גדילים כפולים הכוללים פתוגנים פעילים אדם כגון קוף, contagiousum molluscum, ווירוס Contagalo. המשפחה כוללת גם את נגיף האבעבועות השחורות, אבעבועות. בשל המורכבות של שכפול poxvirus, שאלות רבות עדיין נותרו לגבי אסטרטגית ביטוי הגנים שלהם. במאמר זה אנו מתארים את המשגה והשימוש בוירוסי vaccinia רקומביננטי המאפשרים מדידה של שלבי יחיד המרובים של ביטוי גנים נגיפי בפורמט תפוקה גבוהה בזמן אמת. זו מופעלת באמצעות השימוש בחלבוני ניאון ספקטרלית להבדיל כתבים לכל אחד משלושה שלבים בשכפול נגיף. וירוסים אלה מספקים יחס אות לרעש גבוה, תוך שמירה על דפוסי שלב ספציפיים ביטוי, מבחני מבוססי צלחת מאפשרים ותצפיות מיקרוסקופיות של התפשטות נגיף ושכפול. כלים אלה שימושים לגילוי נגיפים, מחקרים של האינטראקציה מארח וירוס, וביו אבולוציוניתמשעמם.

Introduction

באופן מסורתי, ביטוי וירוס הוא למד תוך שימוש בטכניקות ביולוגיה מולקולריות (סופג למשל צפוני, מערבי סופג, הכלאה microarray, וכו ') ^1. בעוד שיטות אלה מסוגלים לספק מידע מפורט ביחס לסיווג שינויי ביטוי של mRNAs או חלבונים הבודדים, הם בדרך כלל לא ניתנים לתהליכים בזמן אמת ותפוקה גבוהה. גישות אלטרנטיביים באמצעות כתבי הקרינה מבוססת יושמו בעבר בעבודה עם poxviruses; עם זאת, הפיתוח והשימוש שלהם כבר מונעים על ידי מטרות מגוונות. מספר שיטות כגון נועדו לבחירה של וירוסי רקומביננטי ^2,3. טכניקות אלה מבטאים EGFP על התאגדות וביטוי של ה-DNA אקסוגני משיבוטי vaccinia רקומביננטי מתאימים. באופן דומה, מספר זני vaccinia יציבות להביע EGFP מסיס או חלבוני GFP-tagged הביעו תחת אמרגן vaccinia ילידים היו בשימוש נרחב. אלה typically משמש לכמת כניסת וירוס ושכפול במהלך מבחני נטרול מבוסס נוגדנים, עיכוב כימי, או השוואה של יעילות אנטי ^4-6. בעוד וירוסים אלה הוכיחו שימושיים, הם מוגבלים ביכולתם כדי לספק מידע מפורט על הנקודה של עיכוב עקב שימושם של אמרגן מוקדם / מאוחר משמעי אחת נגיפי. גם שיטות קודמות עשו שימוש בחלבון EGFP עם מאפייני אות לרעש שאינו אופטימליים.

בשל המורכבות של שכפול poxvirus והמחסור בכלים קיימים לרשות assay שינויים בזמן אמת בביטוי גנים נגיפי, פיתחנו חבילה של וירוסי כתב במה יחיד ורב ^7,8. כפי שמתואר בפרסומים קודמים, וירוסים אלה מבטאים אחד, שתיים, או שלושה חלבוני ניאון ספקטרלית להבדיל מיזמי vaccinia ילידים במהלך מוקדם, שלבי ביניים, או מאוחר בזיהום. וירוסים אלה יכולים להיות לנוed כסמן להתקדמות שכפול נגיף באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי והם באותה מידה גם מתאימים למבחני צלחת וקורא המבוסס על תפוקה גבוהה. וירוסים אלה הם קלים לשימוש במקום של סוג בר וירוס, הולך וגדל עם קינטיקה דומה כדי להגיע לכותרות שווה ערך ^7. במהלך התכנון וההקמה של הווירוסים הללו, הרבה טיפול נלקח בבחירת fluorophores שיש להם מאפייני אות לרקע גבוהים עם יעילות קיפול מעולה כדי להקל על כימות אמין עם משוב מהיר לשינויים בביטוי (ונוס, mCherry וTagBFP). בנוסף, שילובים של יזמים ויראלי נבחרו אשר מייצרים באיכות גבוהה, ביטוי בשלב מסוים חד משמעי, המספק מידע על מגוון רחב של מוקדם (אמרגן C11R), (אמרגן G8R) ביניים וביטוי גנים (אמרגן F17R) באיחור, בניגוד למעורפל יזמים מוקדם / מאוחר.

וירוסים אלה יכולים לשמש ככלי לinvestigating את מחזור החיים של poxvirus, וירוס vaccinia הטיפוסי. הרבה עדיין לא ידוע על האינטראקציה מארח וירוס למרות ההיסטוריה הארוכה של מחקר. Vaccinia הוא מורכב, לייצר מעל 200 חלבונים ייחודיים, אשר רבים מהם המערכת החיסונית ולארח עוינים. לאחר ההדבקה, וירוס vaccinia מתחיל מייד שעתוק mRNA המוקדם. זה הקל על ידי גורמי RNA פולימראז ותעתיק שהועמסו על הגנום הנגיפי במהלך אריזת virion והחזיקו במצב מושהה עד זיהום שלאחר מכן. ביטוי מוקדם זה בעיקר מייצר חלבונים הנדרשים לדיכוי של מערכת חיסון המארח (decapping-mRNA, תפיסת dsRNA, וחלבונים הקולטן דמה כמו גם מעכבים של אפופטוזיס, תגובת לחץ, ושיחה, אילינוי, ואיתות NF-κB) ושכפול הגנום. ביטוי מוקדם מייצר גם גורמי שעתוק הכרחיים לביטוי ביניים. ביטוי ביניים כולל את הביטוי של גורמי שעתוק בשלב מאוחר. זהמפל ביטוי מוביל לייצור של חלבוני נגיף מבניים והאנזימטית בשלבים מאוחרים של זיהום, אשר נחוצים להרכבה של virion vaccinia הבוגרת מלאה.

הקבוצה של וירוסי כתב ניאון שלנו מאפשרת להתקדמות מהירה שעשתה בהבנה של הביולוגיה poxvirus. אחת השיטות הנפוצות וזמן רב ביותר בתחום וירולוגיה הוא assay הצמיחה. זה בדרך כלל כרוך בהדבקה של תאים, לחוקק שורה של טיפולים, וירוס קצירה ידי lysing תאים נגועים, וכימות כייל נגיף וכתוצאה מכך על ידי assay פלאק. שימוש בוירוסי הכתב המתואר כאן מאפשר מדידה בזמן אמת של צמיחת וירוס שיכול להיות assayed בקלות ובהשוואה בין מספר רב של טיפולים שבוצעו במקביל. אנו צופים זו קבוצה של חומרים כימיים אשר תשמש בפרוטוקולים שונים לזיהוי שינויים בביטוי הגנים נגיפי בתגובה לטיפול תרופתי, RNAi knockdown, או הגבלת טווח מארח.

שיטה זו גם מאפשרת ניתוח גבוה תוכן בקנה מידה גדולה יותר מאשר היו זמין בעבר, מה שמאפשר למסכי תרופה אנטי ויראלית תפוקה גבוהה לשלבים יעד ספציפי מוגדרים של עניין. בעוד טיפולים פוטנציאליים רבים כדי להילחם בזיהום poxvirus זוהו, ה-FDA אישרה רק טיפולים יעילים לטיפול בזיהום poxvirus הם נוקלאוזידים אציקליות פוספונאט, cidofovir, וטיפול עם ^9,10 גלובולין חיסוניים vaccinia. למרות מיגור האבעבועות השחורות בשנת 1977 ^11, poxviruses יישאר איום משמעותי על בריאות אדם ^12. הפסקת חיסון רחב היקף נגד וירוס אבעבועות הובילה לרגישות מוגברת לpoxviruses האחר ^13. לדוגמא, האזורים של מרכז אפריקה המוגן בעבר על ידי חיסון חווים עלייה חדה בנגיף Monkeypox ^14. גם דאגה משמעותית כברהועלה בנוגע הרגישות הסמויה לשחרור מכוון של נגיף אבעבועות. בשל הטיפולים מוגבלים הזמינים כרגע, יש צורך דחוף בפיתוח של טיפולים חדשניים. וירוסי כתב אלה מאפשרים הקרנת מעכבי מולקולה קטנות מהירה ותפוקה גבוהה לעיכוב של שלב מסוים בשכפול נגיף. זיהוי של מעכבים כי יעד שלבי ביטוי ויראלי כרגע לא היעד של עיכוב יהיה להקל על פיתוח של טיפולים משולבים עם עוצמה מוגברת.

ניתן ללמוד הרבה על ביולוגיה של תא vaccinia על ידי התבוננות שינויים בביטוי הגנים של כל שלב. הנחתה על ידי כימי או מניפולציה גנטית של תא מארח נגוע מתבטאת בדרך כלל במונחים של כותרות ויראלי מופחתות. עם זאת, על ידי השוואת שינויים בכל שלב של מפל ביטוי ויראלי, ניתן לקבל הבנה של איך כושר וירוס הוא השפעה שלמה יותרed על ידי טיפול מסוים. נתונים אלו הוכחו לתאם גם עם פלט כייל נגיף המסורתי, אלא לספק מידע מכניסטית מפורט יותר, כמו גם יכולות תפוקה גבוהה ^7.

Protocol

1. תאי פלייט

1. לנתק את תאי הלה מהצלחת ולדלל בתקשורת צמיחה (DMEM, 2 L-שפע מ"מ, 10% FBS) לכ 2.0 x 10 ⁵ תאים / מיליליטר. לוותר 100 μl / גם בצלחת שחורה עם קירות, ברורה שטוחה תחתונה 96 היטב (20,000 תאים / טוב).
2. דגירה תאים עבור 24 שעות עד מחוברות בחממה 37 ° C + 5% CO _2.

2. להדביק תאים

1. לדלל וירוס ולהדביק תאים.
   1. הפשירו TrpV (וירוס חדר לשלושה; המוקדם ונוס, בינוני mCherry, TagBFP המאוחר) וPLV (יזם פחות ונוס) וירוס ניאון וdisaggregate באמצעות sonication במשך 5 דקות. לחלופין, יכולות להיות מעורבות במניות וירוס גולמי 01:01 עם 0.25 מ"ג / מיליליטר טריפסין בתקשורת זיהום וטופחו על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
   2. לדלל מניות וירוס גולמי ב37 ° C מדיה זיהום (DMEM, 2 L-שפע מ"מ, 2% FBS). לזיהומים גבוהים משרד הפנים (10 PFU / תא), לדלל מניות וירוס ל1.0 x 10 ⁷ PFU / מיליליטר בהנחת 5 x 10 ⁴תאים / היטב ובידוד נפח 50 μl. תכנית על הדבקה של 3 בארות לשכפל עבור כל טיפול עם TrpV ועוד בארות לשכפל 3 לאותו טיפול עם PLV לתת דין וחשבון לקרינת רקע ספציפי לכל טיפול.
   3. להדביק בארות על ידי הוספת 50 וירוס μl / מדוללת היטב בתקשורת זיהום. זה מוגדר כזמן = 0 הודעה hr זיהום (0 HPI).
2. לדלל תרכובות טיפול רצויים לתקשורת זיהום. עבור כל טיפולי דילול תערובת אחת 2x אדון צריך להיעשות ומיושם לשכפל בארות (נפח כולל למשל 350 μl במשך שש 96 בארות עם 50 μl כל אחד).
   1. לדלל תרכובות ניסיוניות לתקשורת זיהום.
   2. לדלל ממס רכב שליטה (למשל PBS, DMSO) לתקשורת זיהום. הערה: יש להשתמש בריכוזים סופיים דומים של ממסים רכב שליטה כפי שהוחלו לתרכובות ניסיוניות (למשל, אם מניית IBT שלך הוא עשה עם DMSO והשתמשה בconcentratio סופיNS של μl 1 / מיליליטר, ואז להשתמש DMSO לבד ב1 μl / מיליליטר כשליטה ברכב).
   3. לדלל תרכובות שליטה לתקשורת זיהום. תרכובות שליטה מומלצות כוללות: 3.6 מיקרומטר (1 מיקרוגרם / מיליליטר) 1-β-D-Arabinofuranosylcytosine (Arac), 50 מיקרומטר (11.7 מיקרוגרם / מיליליטר) isatin β-thiosemicarbazone (IBT), 60 מיקרומטר (50 מיקרוגרם / מיליליטר) ריפאמפיצין, או 5 מיקרומטר (1.9 מיקרוגרם / מיליליטר) ST-246 ^8,15,16. ראה נציג תוצאות להשפעות צפויות. הערה: לעשות דילול זה בפעמים (2x) הריכוז הסופי הרצוי שכן זה מתווסף ביחס של 1:1 להיקף כבר בבאר.
3. מייד לאחר תוספת של וירוס, להוסיף 50 תקשורת זיהום μl מכילה טיפולים ובקרות רצויים בדילול בשלב 2.2. הערה: כדי assay לעיכוב לפני ביטוי בשלב מוקדם, מתחם (ים) יכול להיות שהוסיף ישירות לבידוד הנגיף המדולל (הצעד 2.1.2) או לארח את התאים לפני ההדבקה (לפני הצעד 2.1.3).
4. דגירה 6-24 שעות ב# 37 &176; חממת C + CO ₂ של 5%.

3. תקן תאים

1. תקן את התאים על ידי הוספת 100 μl paraformaldehyde 8% לתקשורת זיהום כבר בכל טוב. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות מוגנות מפני אור. הערה: מומלץ להוסיף PFA 2x (8%) ישירות לתקשורת כדי למנוע זיהום aerosolization של vaccinia זיהומיות, אשר יכול להתרחש אם תקשורת גבוה כייל היא הפוכה ישירות לתוך צלחת פסולת לפני הקיבוע.
2. הסר מקבע על ידי היפוך צלחת למנת הפסולת.
3. הוספה של טמפרטורת חדר PBS 100 μl.
4. לאטום צלחת עם סרט דבק ברור אופטי. הערה: ניתן לאחסן צלחות ב 4 ° C, אם לא קראו באופן מיידי. הקפד להחזיר צלחות אטומות לטמפרטורת חדר לפני הקריאה כדי למנוע התעבות מעיוות מדידות ספקטרופוטומטר.

4. לכמת צמיחת וירוס

1. למדוד הקרינה נקודת סיום ב515:530 עבור ונוס, 587:610 לmCherry, ו415:457 fאו TagBFP (עירור: פליטת גל בננומטר). ארבע מדידות צריכה להיות בממוצע לכל גם באמצעות הגדרות רווח מותאמות לכל ערוץ. הערה: פליטת הגל המתאים עשוי להיות שונה בהתאם למאפייני הדגם ומסנן הספציפיים של קורא הצלחת שלך. זה יכול להיקבע באופן אמפירי על ידי ביצוע סריקת פליטת גל כדי לקבוע את הנקודה שבה יש ההבדל הגדול ביותר בין TrpV וPLV לכל ערוץ.
2. לנרמל את הנתונים הגולמיים כדי להקל על השוואה בין ניסויים.
   1. לכל ערוץ, לקבוע את הממוצע של TrpV לשכפל ובארות PLV.
   2. הפחת את מדידות רקע שנדבק ב-PLV הממוצעים מהמדידות הניסיוניות שנדבקו ב-TrpV ממוצע לכל טיפול.
   3. לנרמל את הנתונים על ידי חלוקת כל ערך מופחת רקע על ידי ערך הרכב רק טובה.
   4. ברגע שניסוי כבר חזר מספר פעמים, ניתוח בכיוון אחד של שונות מבחן (ANOVA חד כיווני) וג מספרomparison לאחר הבדיקה ניתן לבצע על מנת לקבוע אם כל אחד מהטיפולים משקף הבדל מובהק סטטיסטי מטיפול הרכב בלבד לכל ערוץ.

. 5 פרוטוקול אלטרנטיבי: מבחני פלייט קינטי

1. לבצע את כל הפעולות באמצעות תוספת של טיפולים (שלב 2.3).
2. צלחת חותם עם סרט דבק ואת מקומו בתא של צלחת קורא equilibrated 37 ° C. שים לב: יש לנקוט זהירות מיוחדת כדי לשמור על צלחות באופן עקבי על 37 מעלות צלזיוס כדי למנוע מתח תא מופרז ועיבוי. עבור מבחני הקינטית, זה חשוב במיוחד להשתמש במדיום שנאגרו (סודיום ביקרבונט וHEPES) כדי לשמור על רמת חומציות תקינה ללא תוספת של 5% CO _2.
3. קורא צלחת קבוצה לזכות באופן ידני כדי למנוע הרוויה של נקודות זמן מאוחר יותר. הערה: ניתן להשיג אופטימיזציה של רווח מדויק על ידי ביצוע מבחני נקודת סיום בתנאים דומים.
4. לרכוש קריאות לשעה ל8-24 HPI ולנרמל באמצעות סימיהליך lar כמו בassay נקודת הסיום (שלב 4.2).
5. נקודות זמן בודד ניתן לנתח למובהקות סטטיסטיות תוך שימוש בשיטות דומות כמו assay נקודת הסיום שתואר קודם לכן.

תוצאות

כדוגמא לשימוש האופייני של הווירוסים הללו, וירוס הקרינה-כתב המשולש שימש להשוות את הנקודה של עיכוב של כמה מעכבי poxvirus מוגדרים היטב.

תאי הלה היו מצופים ברקמת תרבות מטופלים בעלי קירות שחורות ברור צלחות 96 היטב שטוחות תחתונה וטופחו במש?...

Discussion

הנה, יש לנו תיארתי את השימוש המעשי של וירוס רב שלבית כתב vaccinia (TrpV), המספק אמצעים לשחזור, בזמן אמת משוב של שכפול נגיף. על ידי שימוש במעכבי poxvirus מוגדר היטב, הצלחנו להראות כי TrpV מגיב באופן עקבי עם המנגנון הבין פעולה עבור כל מעכבי. בעוד וירוס TrpV מספק את המידע המקיף ביותר על הת...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065
Fetal Bovine Serum - Optima, Heat Inactivated (FBS)	Atlanta Biologicals	S12450H
200 mM L-Glutamine, (L-glut)	Gibco	25030-081
96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates	Corning	3603
384 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates	Corning	3712
Trypsin, 2X, Sterile, Irradiated	Worthington Biochemical Corp.	TRLVMF
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-023
Dimethyl Sulfoxide, Cell Culture (DMSO)	American Bioanalytical	AB03091
1-β-D-Arabinofuranosylcytosine  (AraC), MW= 280 g/mol	SigmaAldrich Co	C6645
isatin β -thiosemicarbazone (IBT), MW= 234 g/mol	Fisher Scientific	NC9075202
Rifampicin, MW= 823 g/mol	SigmaAldrich Co	R3501
ST-246, MW= 376 g/mol	SIGA Labs, Corvallis, OR
8% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	157-8
TempPlate RT optically clear film	USA Scientific	2978-2700
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Gibco	31985-070