Flujo de microfluidos Cámaras utilizando sangre reconstituida a Modelo Hemostasia y Transfusión de Plaquetas<em&gt; In Vitro</em

Resumen

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

Resumen

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Introducción

Hemostasis requiere la actividad combinada y regulada de células, proteínas, iones y tejidos en un contexto espacio-temporal restringida ^1. actividad no controlada puede conducir a hemorragia o trombosis y la morbilidad o la mortalidad en un espectro de trastornos relacionados con la coagulación de la sangre. Un experimento de la cámara de flujo de microfluidos es una técnica difícil que imita hemostasis in vitro. Este enfoque permite la investigación de la compleja interacción de procesos que intervienen en la hemostasia con el protagonismo de las plaquetas sanguíneas.

Después de una lesión vascular, las plaquetas se adhieren a las proteínas de la matriz subendotelial expuesta (glico) para prevenir la pérdida de sangre. Después de la adhesión, las plaquetas se activan y el agregado en respuesta a auto- y señalización paracrina que finalmente conduce a la formación de una red de plaquetas, fibrina y estabilizada por lo que resulta en una firma, la herida trombo ² de sellado. A diferencia de la mayoría de las otras pruebas de la función plaquetaria, expetos con cámaras de flujo tienen en cuenta el parámetro físico del flujo sanguíneo y por lo tanto la influencia de la reología en las células y biomoléculas ^3,4 participantes.

experimentos en cámara de flujo han proporcionado multitud de datos de la señal en la hemostasia y la trombosis mediante la variación de los parámetros clave que influyen hemostático (sub) procesos, incluyendo los perfiles de matriz adhesiva, reología y de flujo, composición celular, presencia de toxinas o drogas, fuerza iónica y muchos más. En las últimas dos décadas, experimentos con la cámara de flujo bajo rendimiento que requieren grandes volúmenes de muestra (10-100 ml) se han desarrollado para cámaras de microfluidos menudo consisten en pequeñas cámaras de placas paralelas y que incluyen la tecnología moderna para la perfusión de sangre total en condiciones controladas muro de corte ^5. Microscaling ha aumentado significativamente el rendimiento de ensayo sobre todo porque la instalación del hardware ha simplificado y se requiere menos volumen (sangre), lo que hace el experimento más accesible y VersatiLe. Por ejemplo, la sangre de los animales pequeños de laboratorio ahora puede ser utilizado sin la necesidad de sacrificar los animales. De este modo muestras de sangre de ratones modificados genéticamente han ayudado en la identificación de moléculas clave promover o inhibir la hemostasis y en nuevos conocimientos básicos ^6.

Laboratorios de investigación especializados a menudo todavía utilizan cámaras de flujo a la medida, por ejemplo de polidimetilsiloxano (PDMS) ⁷ que polimeriza en moldes litografiado que puede ser blueprinted por software. La cámara resultante es barato, desechable y se puede desmontar fácilmente para el análisis post hoc. Por otra parte, básicamente cualquier diseño de embarcaciones, incluyendo las bifurcaciones o giros bruscos se puede construir en el comando. Esta ventaja es también su lado negativo porque su normalización ya era el principal problema con experimentos en cámara de flujo, y PDMS encargo cámaras no han ayudado esto. En la parte superior de este tema en particular, recubrimiento (condiciones), sondas fluorescentes, anticoagulante, tempratura y el tiempo entre el muestreo y análisis están mal estandarizados ^8. La estandarización de estas variables es un reto, pero no obstante necesario para permitir la comparación de resultados entre laboratorios. Este tema es el tema principal de la Sociedad Internacional de Trombosis y Hemostasia en subcomité científico y Normalización en Biorheology ^9,10.

Los concentrados de plaquetas (PC) se transfunden en pacientes que sufren de diversas enfermedades que causan trombocitopenia y / o sangrado. Pero plaquetas en PC son conocidos para desensibilizar, especialmente en función del tiempo de almacenamiento ^11, un proceso de deterioro relacionado con el envejecimiento y comúnmente conocida como lesión de almacenamiento de plaquetas. A veces se afirma que tales plaquetas restaurar en circulación una vez transfundida ^12, pero la evidencia de esto es escasa. Además, la funcionalidad de las plaquetas que forman un PC no se prueba de forma rutinaria debido a que la relación entre tales ensayos yla eficacia terapéutica o profiláctica está claro ^13. cámaras de flujo de microfluidos ofrecen un medio para investigar la función plaquetaria en PC para optimizar la cadena de manipulaciones entre la recogida y entrega. Es una poderosa herramienta de investigación para las comparaciones directas (pares) de PC como hemos previamente publicados ^14,15 y se describe aquí.

Protocolo

Este protocolo sigue las directrices éticas institucionales para la investigación en muestras humanas y el consentimiento informado se obtuvo de todos los donantes involucrados. La aprobación de los experimentos descritos aquí se obtuvo de la junta de revisión institucional del Hospital de la Universidad de Amberes.

Nota: Las indicaciones de temperatura son siempre la temperatura ambiente, a menos que se especifique.

1. Configuración de la cámara de flujo Preparación

1. Los carriles se preparan, intubación y prendedores
   1. Vortex la suspensión de colágeno vigorosamente y se diluye 1/20 en la solución de glucosa isotónica suministrado por el proveedor para una concentración final de 50 mg / ml.
      NOTA: Nosotros usamos colágeno de tendón equino, hecha principalmente de tipo I fibrillas. El equino colágeno tipo I se refiere a menudo como "Horm" colágeno y es el estándar de oro para este tipo de ensayo ^9, tanto por razones históricas, así como biológicos. humano de tipo colágeno III también se puede utilizar, pero THe fibrillas capa menos bien y la respuesta de las plaquetas no es tan fuerte. Otras superficies de revestimiento también se pueden utilizar, por ejemplo factor de von Willebrand (VWF), el fibrinógeno, la fibronectina, laminina, vitronectina, trombospondina-1 o combinaciones de éstos ^16.
   2. Tome un nuevo biochip desechable desde el recipiente del proveedor. Las dimensiones de los biochips utilizados aquí son 0.4W x 0,1H x 20L en mm ^3.
   3. Pipetear 0,8 l en el carril (s) del biochip de microfluidos en un extremo del chip y la marca como de salida. Asegúrese de que el carril está vacío 5/6 ° con el colágeno que contiene la solución de revestimiento preparada en el apartado 1.1.1. Asegúrese de que no hay burbujas de aire.
      Nota: Los canales están revestidos parcialmente para evitar la acumulación de fibras de colágeno en la entrada del canal (véase la discusión).
   4. Se incuba a 4 ° C durante 4 horas o durante la noche en un recipiente humidificado y cerrada.
   5. Bloquear los canales revestidos pipeteando tampón de bloqueo (1,0% (w v) de suero / albúmina bovina unad 0,1% (w / v) de glucosa en mM solución salina 10 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico (HEPES) tamponada (HBS; 0.9% (w / v) de NaCl, pH 7,4) en el otro extremo y la marca como entrada. Asegúrese de que el carril está completamente lleno con el tampón de bloqueo evitando las burbujas de aire.
   6. Cortar un tubo a igual longitud (12 cm). Utilice uno por carril y conectar cada tubo con un alfiler. Por ejemplo, un experimento que compara dos condiciones, por duplicado requerirá cuatro tramos de tubería y cuatro pasadores para ser preparados.
   7. Enjuague el tubo con agua destilada utilizando una jeringa y una aguja de 26 G o los conectores que se acompañan.
   8. Saturar el tubo con tampón de bloqueo. Almacenar en un recipiente cerrado y humidificado durante un mínimo de 1 hora.
2. Preparación de la bomba y el colector
   1. Enjuagar la bomba y el colector con agua destilada, eliminar las burbujas de aire.
   2. Aspirar el tampón de bloqueo fuera del carril (s) biochip usando la punta 10 l fija en la salida. Limpiar la superficie deel biochip con un polvo de precisión sin pelusa y alcohol desnaturalizado para eliminar huellas y polvo.
   3. Fijar el biochip en una platina del microscopio automatizado. Si se utiliza más de un carril de forma simultánea en una sola carrera, conectar el divisor múltiple de ocho carriles a la salida de biochips.
      Nota: El divisor de colector de ocho carriles es una pieza de hardware (Figura S1) conectado a la bomba y el biochip. Se permite el funcionamiento de todos los carriles (ocho) disponibles en un biochip o una combinación de carriles que pueden ser definidas por el operador en el software adjunto.
   4. Utilice las clavijas en el tubo para fijarlos en la entrada del biochip. Coloque el otro extremo del tubo (sin pin) en un tubo de ensayo cónico de 1,5 ml lleno con HBS. Enjuague todos los tubos y sus carriles conectados con 1 ml de HBS usando la bomba, a fin de eliminar resto tampón de bloqueo y mal adheridas colágeno.

2. Preparación de muestras de sangre

1. Recogida y separación desangre total fresca de un voluntario sano. ¹⁷
   1. Recoger los primeros ml de sangre en un tubo al vacío que contiene ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) como anticoagulante y utilizar exclusivamente esta muestra para recuento sanguíneo completo (CBC) con un analizador hematológico automatizado.
   2. Recoger un volumen de sangre en un anticoagulante adecuado utilizando tubos de vacío. anticoagulantes estándar para experimentos en cámara de flujo son heparina o hirudina cuando formación de fibrina no es parte del protocolo de estudio y citrato de sodio cuando es.
      Nota: La heparina se utiliza como anticoagulante para todos los experimentos descritos en los resultados.
      Nota: La cantidad de sangre depende del número de experimentos a realizar. Aproximadamente 1 tubo (7 ml) durante 3 carriles.
   3. Colocar los tubos en un rotador a la espera de la reconstitución de la sangre.
      Nota: El ensayo debe ser completado dentro de 3 horas de la flebotomía.
   4. Centrifugar durante 15 min a 250 g para preparar plasma rico en plaquetas (PRP). No utilice la ruptura centrífuga para evitar la perturbación de la pastilla sin apretar.
      1. Cuando se recogió más de un tubo, en común la sangre en un único tubo de centrifugación cónico.
         Nota: La centrifugación se puede hacer más lenta o menos largo, en función del rendimiento de PRP y la "contaminación" diferencial celular preferida.
   5. Retire y deseche el PRP y la capa leucocitaria produciendo glóbulos rojos empaquetados con pocas plaquetas.
      Nota: El número de plaquetas en la fracción de glóbulos rojos es de 13 ± 5 x 10 ³ por l (media ± SD, n = 12) en promedio en nuestras manos.
2. La reconstitución de sangre
   1. grupo sanguíneo AB deshielo (Rhesus D negativo) de plasma a 37 ° C durante 5 min y 20 seg por 4 ml.
   2. Determinar el hematocrito de los glóbulos rojos concentrados preparados en 2.1.5 utilizando un analizador de hematología automatizado.
   3. Determinar la concentración de plaquetas en el banco de sangre preparado de plaquetas concentrado that se utilizó para reconstituir la fracción de glóbulos rojos por encima.
   4. Calcular el volumen de glóbulos rojos empaquetados y concentrado de plaquetas que producirán el 40% de hematocrito y 250 x 10 $ ³ $ plaquetas / l en una muestra de 1 ml.
      Nota: Otros títulos de destino de las células se pueden fijar arbitrariamente, dependiendo del protocolo de estudio.
   5. Transferencia de glóbulos rojos empaquetados y plasma en un tubo fresco usando una punta de pipeta recortado y agregar el concentrado de plaquetas hasta que se alcanza un volumen de muestra de 1 ml.
      Nota: En función de las variables estudiadas, la fracción de plasma debe ser igual en todas las muestras reconstituidas porque plasma tiene una influencia significativa en la tasa de formación de trombos. Por ejemplo, ciclos de congelación-descongelación o plasma tomado de diferentes donantes o en diferentes anticoagulantes puede influir en el resultado.
   6. Mezclar la sangre reconstituida suavemente por inversión y realizar un hemograma completo.
   7. Preparar una muestra de control "en blanco" en el que se sustituye el volumen de la fracción de plaquetaspor el mismo volumen de 0,9% (m / v) de cloruro sódico en agua para determinar la concentración de plaquetas endógenas (es decir, las plaquetas de banco no sanguíneos) en la sangre reconstituida usando un CBC.
3. etiquetado
   1. Pipetear 1 ml reconstituidos sangre en un tubo de ensayo que contiene 1 l 5 mM de calceína AM (5 M de concentración final).
      Nota: Otros colorantes cubetas se pueden utilizar ^14.
   2. Mezclar suavemente por inversión.
   3. Incubar durante 5 min a 37 ° C antes de su uso.

3. Ensayo de perfusión

1. Enfoque el objetivo sobre las fibras de colágeno adheridas en la parte inferior de los carriles. Lo ideal es utilizar la configuración de contraste diferencial de interferencia (DIC) de contraste de fase o de esta estrategia de enfoque. Seleccione 'Z actual Conjunto para las regiones de azulejos seleccionados' en el software experimento para corregir digitalmente los Z-posiciones seleccionadas.
2. Seleccionar una región de interés (ROI) en el carril (xy) en el software de experimento de la microscope que será grabado durante el experimento.
   Nota: El rendimiento de la inversión puede ser cualquier superficie escogida arbitrariamente dentro de un carril de perfusión. Es aconsejable no para analizar la formación de trombos cerca de la entrada y salida de un carril para que para evitar efectos secundarios del perfil de flujo variable en esa región, a pesar de que esto es relativamente pequeño. El área de superficie ROI debe contener un número significativo de plaquetas o trombos para permitir la nivelación de la señal. En este protocolo la ROI es un agregado cosido digital de tres imágenes del mismo tamaño de lado a lado que resulta en 0,62 mm ² en el medio de los 2 cm de largo carril.
3. Mezclar suavemente las muestras por inversión y la posición de éstas junto al biochip en el escenario automatizado.
4. Coloque el tubo que está conectado con la entrada del biochip en los tubos de ensayo que contienen las muestras de sangre reconstituidas.
5. Poner en marcha la bomba a 50 dinas / cm ² (u otras tensiones tangenciales como se desee) para los canales vinculados a tubos de ensayoque contiene las muestras de sangre reconstituidos utilizando el software de la bomba.
   Nota: Otros esfuerzos de corte pueden ser utilizados.
6. grabar imágenes cada 15 segundos durante 5 minutos en tiempo real usando el software de adquisición y el experimento del microscopio.
   Nota: Otra serie de tiempo se puede utilizar dependiendo de la configuración experimental.
   Nota: Generalmente usamos un aumento de 100X (10X y 10X objetivo lentes), pero mayor (o menor) de ampliación se puede utilizar fácilmente como una alternativa.

4. Enjuague

1. Lavar todos los tubos unido a la salida y conectado al colector de multicanal o de la bomba con agua destilada, seguido de hipoclorito de sodio (lejía) 0,5% (v / v) y, finalmente, NaOH 0,1 M en agua. Desechar el tubo fijado a la entrada del biochip como residuos peligrosos.

Análisis 5. Datos

1. Determinar la cinética de crecimiento de trombos con el software de análisis de imágenes. Los siguientes comandos son específicos para ZEN2012.
   1. Análisis abrir el complemento de imagen para determinar la cobertura de la superficie de las plaquetas.
   2. Establecer el umbral de fluorescencia en la pestaña Analizar interactiva para definir la intensidad de los píxeles que se correlaciona con una señal positiva, es decir, un plaquetas adheridas o plaquetas adheridas.
   3. Utilice Crear tablas para generar automáticamente una hoja de cálculo que contendrá las superficies separadas (en m ²⁾ de esos "objetos" que contienen píxeles con una señal entre los umbrales seleccionados. Esto se realiza para cada punto de tiempo.
      Nota: Una vez que los umbrales de fluorescencia han sido elegido, el software de análisis detecta automáticamente "objetos" en el campo de visión de que cumplan los criterios. Estos objetos son trombos, pequeños agregados de plaquetas o plaquetas individuales y cubren un número de píxeles. Cada objeto aparece en la hoja de cálculo por separado.
   4. Guarde estas hojas de cálculo en formato XML y abrirlos en una hoja de cálculopara los cálculos posteriores.
   5. Total de las zonas de la superficie de los objetos seleccionados por la suma y dividir el resultado por el área total del campo de medición (m ^2). Esto dará lugar a la cobertura de la superficie relativa (%). Hacerlo para cada punto de tiempo.
   6. Trazar estas coberturas de superficie en función del tiempo de perfusión y calcular la pendiente por regresión lineal, obteniéndose la cinética de crecimiento de trombos de esa condición particular.

Resultados

Para demostrar la variación intra-ensayo, tres idénticas muestras de sangre entera reconstituidas fueron perfundidos simultáneamente sobre superficies revestidas de colágeno (Figura 1). Esto dio lugar a un coeficiente de variación de 8,7%. Esta estadística sugiere intra-ensayo aceptable y la variación intralaboratorio que permite una comparación fiable entre muestras relacionadas.

La entrada de la cám...

Discusión

Experimentos en cámara de flujo de microfluidos son una excelente herramienta para investigar la función de las plaquetas en la sangre que fluye y se utilizan para evaluar la hemostasia in vitro en diversos contextos experimentales. A pesar de su falta de estandarización entre laboratorios ^9, se demuestra que dentro de nuestro laboratorio de la variación experimental es aceptable. Esto permite comparar de forma fiable muestras pareadas () dentro de un determinado estudio. Este fue validado usando...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD vacutainer tube with EDTA	Becton, Dickinson and Company	368856
BD vacutainer tube with Heparin	Becton, Dickinson and Company	368480
BD vacutainer tube with Sodium Citrate	Becton, Dickinson and Company	366575
Hirudin Blood tube	Roche	6675751 001
BD vacutainer Eclipse	Becton, Dickinson and Company	368650	Blood collection needle with preattached holder
Pipette tips 100-1,000	Greiner bio-one	740290
Pipette tips 2-200	Greiner bio-one	739280
Pipette tips 1-10	Eppendorf	A08928
Tube 5 ml	Simport	11691380
Conical tube 15 ml	Greiner bio-one	1888271
Conical tube 50 ml	Greiner bio-one	227261
10 ml Syringe	BD	309604
Precision wipes	Kimtech	5511
Vena8 Fluoro+ Biochips	Cellix	188V8CF-400-100-02P10	Named in Figure S1 A as 'Biochip'
Vena8 Tubing	Cellix	TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F	Named in Figure S1 B as 'Disposable tubing'
Vena8 Needles	Cellix	SS-P-B1IC-B1OC-PACK200	Named in Figure S1 B as 'Pin'
Connectors for single inlet cables of biochips	Cellix	CONNECTORS-B1IC-PACK100
Multiflow8 connect	Cellix	MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS	Named in Figure S1 B as 'Reusable tubing' and 'Splitter'
Humidified box	Cellix	HUMID-BOX
Software microfluidic pump	Cellix	N/A	Venaflux Assay
Horm Collagen	Takeda/Nycomed	1130630	Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented
HEPES buffered saline (HBS)	in house preparation	in house preparation	10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4)
Blocking buffer	in house preparation	in house preparation	1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS
Calcein AM	Molecular probes	C1430
Bleach 10%	in house preparation	in house preparation
0.1 M NaOH	in house preparation	in house preparation
Denaturated alcohol	Fiers	T0011.5
Mirus Evo Nanopump	Cellix	188-MIRUS-PUMP-EVO	with Multiflow8. Named in Figure S1 A as 'Pump' and 'Manifold'
Microscope	Zeiss	Axio Observer Z1	equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera
Software microscope	Zeiss	N/A	ZEN 2012
Hematology analyzer	Sysmex	N/A
Table Top Centrifuge	Eppendorf	521-0095
Platelet incubater	Helmer	PF-48i
Incubation water bath	GFL	1013
Pipette	Brand	A03429
Tube Roller	Ratek	BTR5-12V
Sterile docking device	Terumo BCT	TSCD
Tubing Sealer	Terumo BCT	AC-155
Vortex	VWR	58816-121