マイクロ流体チャンバーモデル止血や血小板輸血に再構成された血液を使用しました<em&gt;インビトロ</em

要約

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

要約

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

概要

止血は制限された時空間コンテキスト¹で細胞、タンパク質、イオンと組織の組み合わせと調整活動が必要です。制御されていない活動は、血液凝固に関連する疾患のスペクトルに出血や血栓症および罹患率や死亡率につながる可能性があります。マイクロ流体フローチャンバー実験は、 インビトロで止血を模倣困難な技術です。このアプローチは、血小板のための先導的な役割で止血に参加するプロセスの複雑な相互作用の調査を可能にします。

血管損傷後、血小板は血液の損失を防止するために、露出した内皮下マトリックス（糖）タンパク質に付​​着します。接着に続いて、血小板が最終的にフィブリンおよび事務所の結果によって安定化された血小板のネットワークの形成につながるシグナル伝達を自動およびパラクリンに応答して活性化し、骨材、血栓^2を封止巻か。他のほとんどの血小板機能検査、experiとは異なり、フローチャンバーを持つメントは、アカウントへの血流の物理的パラメータ、したがって、参加した細胞や生体分子^3,4上のレオロジーの影響を取ります。

チャンバー実験フロー止血（サブ）に影響の重要なパラメータを変化させることによって、止血および血栓症の中で画期的な洞察を生成した接着剤マトリックス、レオロジー及び流れプロファイル、細胞組成、毒素または薬物、イオン強度および多くの存在を含む処理されます。過去20年間では、大規模なサンプル容量（10〜ml）を必要とする低スループットフローチャンバー実験は、多くの場合、小さな平行板室からなり、制御された壁面せん断条件⁵で全血を灌流するための近代的な技術を含むマイクロ流体室に進化してきました。ハードウェアのセットアップを簡略化しており、以下（血液）のボリュームが必要とされる主な理由Microscalingが大幅に実験をよりアクセスし、versatiレンダリング、アッセイのスループットを増加していますル。例えば、小型の実験動物からの血液は、現在、動物を犠牲にすることなく使用することができます。遺伝的に改変されたマウスの血液サンプルは、このように止血を促進または阻害鍵分子の同定におよび新規の基本的な洞察⁶に支援しています。

専門の研究室は、多くの場合、まだソフトウェアによってblueprintedすることができリトグラフ金型に重合したポリジメチルシロキサン^（PDMS）7からインスタンスのカスタムメイドのフローチャンバーを使用します。その結果、チャンバは、安価な使い捨てであり、容易に事後解析のために分解することができます。また、分岐点または鋭いターンを含む血管の基本的にはどのようなデザインは、コマンド上に構築することができます。この利点は、標準化は既にフローチャンバー実験と主要な問題であり、PDMSは、カスタムメイドの室がこれを支援していないので、その欠点です。この特定の問題、コーティング（条件）、蛍光プローブ、抗凝固剤、温度の上サンプリングと分析の間eratureと時間がすべての悪い^8を標準化されています。これらの変数の標準化は、困難、それにもかかわらず、研究室間の結果の比較を可能にするために必要とされます。このトピックでは、生物レオロジー^9,10に関する科学と標準化小委員会における血栓止血に関する国際社会の主要な対象です。

血小板濃縮物（PC）は、血小板減少症および/または出血を引き起こす様々な疾患に罹患している患者に輸血されています。しかし、PC中の血小板は、特に貯蔵時間¹¹の関数で、脱感作することが知られており、劣化プロセスは、加齢および一般血小板貯蔵病変と呼ばに連結されました。時々 、このような血小板はかつて¹²輸血血液循環に復元することが主張されているが、これのための証拠は乏しいです。さらに、PCを構成する血小板の機能は、日常的にテストされていないため、このようなアッセイとの間の関係治療的または予防的有効性は¹³不明です。マイクロ流体フローチャンバーは、コレクションと発行間の操作のチェーンを最適化するために、PC内の血小板機能を調査するための手段を提供しています。それは我々が以前に^14,15を公開しているし、ここに記載されているように、PCの直接（ペアリング）比較のための強力な研究ツールです。

プロトコル

このプロトコルは、ヒト試料の研究のための制度倫理指針に従っており、インフォームドコンセントは、関係する全てのドナーから得られました。ここに記載された実験の承認は、アントワープ大学病院の施設内倫理委員会から入手しました。

注：指定しない限り、温度表示は、常に室温です。

1.準備フローチャンバーのセットアップ

1. レーン、チューブおよびピンの準備
   1. 渦激しくコラーゲン懸濁液および50μg/ mlの最終濃度になるように、プロバイダにより供給された等張グルコース溶液で1/20に希釈します。
      注：私たちは、主にI型線維の構成された、ウマ腱コラーゲンを使用します。ウマコラーゲンI型はしばしば「HORM「コラーゲンと呼ばれ、歴史的なだけでなく、生物学的な理由の両方のためのアッセイ⁹のこのタイプの黄金の標準です。ヒトIII型コラーゲンを使用することもできるが、目eはあまりよくコートをフィブリルおよび血小板応答は、強力ではありません。他のコーティング表面は、例えばフォン・ヴィレブランド因子（VWF）、フィブリノゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、トロンボスポンジン-1、またはこれらの¹⁶の組み合わせのために、使用することができます。
   2. プロバイダーのコンテナから新しい使い捨てバイオチップを取ります。ここで使用されるバイオチップの寸法はミリメートル³で0.4Wのx 0.1Hのx 20Lです。
   3. ピペットの出口としてチップとマークの一端のマイクロ流体バイオチップのレーン（複数可）に0.8μlの。レーンが1.1.1で調製した塗布溶液を含有するコ​​ラーゲンと5/6日に満たされていることを確認します。気泡がないことを確認してください。
      注：チャンネルは、部分的に（説明を参照）、チャネルの入口にコラーゲン線維の蓄積を回避するためにコーティングされています。
   4. 加湿と密閉容器内の4時間または一晩4℃でインキュベートします。
   5. / v）のウシ血清アルブミンwは（ブロッキング緩衝液（1.0％をピペットでコーティングされたチャネルを遮断他端とマークで、D、0.1％（w / v）のグルコース、10mMの4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）の緩衝化生理食塩水（/ v）の塩化ナトリウム、pH7.4のW、0.9％（HBS）で入口として。車線が完全に空気の泡を避けブロッキング緩衝液で満たされていることを確認します。
   6. 同じサイズ（12センチ）でチューブをカットします。レーンあたり1を使用し、ピンで各チューブを接続します。例えば、二重に実行する二つの条件を比較した実験では、4チューブストレッチと4本のピンを用意する必要があります。
   7. シリンジと26 Gの針または添付コネクタを使用して蒸留水でチューブを洗浄します。
   8. ブロッキング緩衝液でチューブを飽和。 1時間の最小値のため、閉鎖し、加湿容器に保管してください。
2. ポンプとマニホールドの準備
   1. ポンプを洗浄し、蒸留水でマニホールド、気泡を除去。
   2. 出口で固定10μlのチップを用いたバイオチップレーン（複数可）のうち、ブロッキング緩衝液を吸引します。の表面を清掃してください精密無料ワイプほこりや変性アルコールによるバイオチップは、プリントやほこりを除去します。
   3. 自動化された顕微鏡ステージ上のバイオチップを修正しました。複数のレーンが1回の実行で同時に使用されている場合は、バイオチップコンセントに8レーンマニホールドスプリッタを接続します。
      注：8レーンマニホールドスプリッタは、ポンプやバイオチップに接続されたハードウェアの一部（ 図S1）です。これは、添付のソフトウェアで操作者が定義することができるバイオチップ又はレーンの組み合わせ（8個）のレーンすべての動作が利用できることができます。
   4. バイオチップの入口でそれらを修正するためにチューブでピンを使用してください。 HBSで満たされた1.5ミリリットルコニカル試験管に（ピンなし）チューブのもう一方の端を置きます。バッファおよび不十分な付着コラーゲンをブロックし、残りを除去するために、ポンプを使用して、1ミリリットルのHBSですべてのチューブとその接続されたレーンをすすぎます。

血液試料の調製

1. コレクションとの分離健康なボランティアからの新鮮な全血^。17
   1. 抗凝固剤としてエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を含む真空チューブ内の血液の最初のミリリットルを収集し、排他的に自動血液分析器を用いて完全血球算定（CBC）のために、このサンプルを使用しています。
   2. 避難チューブを用いて、適切な抗凝固剤で血液量を収集します。フィブリン形成が研究プロトコールおよびクエン酸ナトリウムの一部ではない場合がある場合、フローチャンバー実験のための標準的な抗凝固剤は、ヘパリンまたはヒルジンです。
      注：ヘパリンは、結果に記載のすべての実験のための抗凝固剤として使用しました。
      注：血液の量は、実行される実験の数に依存します。 3車線のため、約1管（7ミリリットル）。
   3. 回転子保留中の血液の再構成にチューブを入れます。
      注：このアッセイは、瀉血の3時間以内に完了する必要があります。
   4. 多血小板血漿を準備するために250グラムで15分間遠心分離（PRP）。ゆるく充填されたペレットの乱れを防止するために遠心ブレークを使用しないでください。
      1. 複数のチューブが収集された場合には、単一の円錐形遠心分離管に血液をプールします。
         注：遠心分離は、PRPの収量および差動セル「汚染」に応じて、よりゆっくりと以下の長い行うことができる好ましいです。
   5. 削除して、いくつかの血小板が充填された赤血球を得たPRPと軟膜を捨てます。
      我々の手中に平均1μl当たり13±5×10 ³パック赤血球画分中の血小板数がある（平均±SD、n個= 12）：注意してください。
2. 血液再構成
   1. 5分および4ミリリットルあたり20秒、37℃で解凍血液型AB（アカゲザルD負）プラズマ。
   2. 自動血液分析装置を用いて、2.1.5で製造した濃縮赤血球のヘマトクリットを決定します。
   3. 血液バンクに血小板濃度を決定するには、濃縮血小板股関節を用意しましたtは、上記赤血球画分を再構成するために使用されます。
   4. 1ミリリットルのサンプルで40％のヘマトクリットおよび250×10 3血小板/μLをもたらすパックされた赤血球と血小板濃縮物の体積を計算します。
      注：細胞の他の標的力価は、試験プロトコルに応じて、任意に設定することができます。
   5. 転送がクリップピペットチップを使用し、1mlのサンプル容量に達するまで、血小板濃縮物を加える新しいチューブに赤血球と血漿を充填しました。
      注：プラズマは血栓形成率に大きな影響を持っているので、研究の変数に応じて、血漿分画は、全ての再構成のサンプルで同じでなければなりません。例えば、異なるドナーから、または別の抗凝固剤で撮影を繰り返し凍結融解または血漿は、結果に影響を与えることができます。
   6. 静かに反転させて再構成された血液を混ぜ、CBCを行います。
   7. 血小板画分の量が置換された「ブランク」対照試料を調製し0.9％の同じ体積CBCを使用して再構成された血液中の内因性血小板（ すなわち、非血液バンク血小板）の濃度を決定するために水中で（M / v）の塩化ナトリウム。
3. ラベリング
   1. ピペットで1ミリリットル1μlの5 mMのカルセインAM（5μM最終濃度）を含有する試験管に血液を再構成しました。
      注：他の細胞の色素^14を使用することができます。
   2. 転倒混和し。
   3. 使用前に37℃で5分間インキュベートします。

3.灌流アッセイ

1. レーンの底に付着したコラーゲン繊維上の目的に焦点を当てます。理想的には、この焦点を当て戦略の位相差や微分干渉コントラスト（DIC）の設定を使用します。デジタルで選択されたZ-位置を固定するための実験ソフトウェアで「選択されたタイル領域に設定されている現在のZ]を選択します。
2. メートルの試験ソフトウエアでレーン（XY）に関心領域（ROI）を選択します実験中に記録されますicroscope。
   注：ROIは任意に灌流レーン内で選択した任意の表面積することができます。そのように、これは比較的小さくても、その領域の可変流量プロファイルの副作用を回避するために、近い車線の入口及び出口に血栓形成を分析しないことが望ましいです。 ROIの表面積は、血小板の有意な数を含むか、または信号の平滑化を可能にするために血栓べきです。このプロトコルでは、ROIは2センチ車線の中央に0.62ミリメートル²の結果3等しいサイズのサイドバイサイド画像のデジタルでステッチ集合体です。
3. 自動化されたステージ上でバイオチップの隣に、これらを反転して位置によって穏やかにサンプルを混ぜます。
4. 再構成された血液サンプルを含む試験管内のバイオチップの入口に接続されたチューブを置きます。
5. （希望として、または他のせん断応力）試験管にリンクされ、これらのチャネルを50ダイン/ cm ²のポンプを起動しますポンプのソフトウェアを使用して再構成した血液サンプルを含みます。
   注：他のせん断応力を使用することができます。
6. レコード画像顕微鏡の取得と実験ソフトウェアを使用してリアルタイムで5分ごとに15秒。
   注：他の時系列が、実験のセットアップに応じて使用することができます。
   注：私たちは、一般的に100倍の倍率（10倍対物レンズと10倍レンズ）を使用しますが、より高い（または低い）倍率が簡単に代替として使用することができます。

4.ウォッシュアウト

1. すべてのチューブの出口に取り付けられ、次亜塩素酸ナトリウム（漂白剤）、0.5％（v / v）を、水で最終​​的に0.1 MのNaOH、続いて蒸留水を用いてマルチチャンネルマニホールドまたはポンプに接続さを洗い流します。有害廃棄物のバイオチップの入口に固定チューブを捨てます。

5.データ解析

1. 画像解析ソフトで血栓成長速度を決定します。次のコマンドはZEN2012に特異的です。
   1. 血小板の表面被覆率を決定するために、プラグインの画像解析を開きます 。
   2. 正の信号と相関画素強度を定義するためのインタラクティブなタブを分析 、 すなわち付着血小板または付着血小板中の蛍光閾値を設定します。
   3. 自動的に選択された閾値との間の信号を有する画素を含むもの「オブジェクト」の^（μm2の中の）独立した表面領域を含むことになるスプレッドシートを生成するために、 表の作成 ​​に使用します。これは、各時点で行われます。
      注：蛍光閾値を選んだしたら、解析ソフトウェアは自動的に基準を満たす視野に「オブジェクト」を検出します。これらのオブジェクトは、血栓、小さな血小板凝集または単一の血小板であり、画素数をカバーします。すべてのオブジェクトは、別々のスプレッドシートに記載されています。
   4. xml形式でこれらのスプレッドシートを保存し、スプレッドシートプログラムで開きますさらなる計算のために。
   5. 合計して、選択したオブジェクトの合計表面積とは、測定フィールド（μmの^2）の総面積で結果を分けます。これは、相対的な表面被覆率（％）を生じるであろう。毎回ポイントのためにそう。
   6. 灌流時間の関数にこれらの表面被覆率をプロットし、線形回帰によって傾きを算出し、その特定の状態の血栓成長の速度論を得ました。

結果

アッセイ内変動を示すために、3つの同一の再構成された全血試料を、コラーゲン被覆された表面（ 図1）を介して同時に灌流しました。これは、8.7％の変動係数をもたらしました。この統計は、関連するサンプル間の信頼性の比較を可能にする許容可能なアッセイ内およびintralaboratory変化を示唆しています。

...

ディスカッション

マイクロ流体フローチャンバー実験は、血液の流れに血小板機能を調査するための優れたツールであり、実験的な文脈を変化させるインビトロでの止血を評価するために使用されます。貧しい施設間の標準化⁹にもかかわらず、我々は我々の研究室内実験変動が許容可能であることを示しています。これは確実に与えられた研究の範囲内（ペアリング）のサンプルを比較するこ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD vacutainer tube with EDTA	Becton, Dickinson and Company	368856
BD vacutainer tube with Heparin	Becton, Dickinson and Company	368480
BD vacutainer tube with Sodium Citrate	Becton, Dickinson and Company	366575
Hirudin Blood tube	Roche	6675751 001
BD vacutainer Eclipse	Becton, Dickinson and Company	368650	Blood collection needle with preattached holder
Pipette tips 100-1,000	Greiner bio-one	740290
Pipette tips 2-200	Greiner bio-one	739280
Pipette tips 1-10	Eppendorf	A08928
Tube 5 ml	Simport	11691380
Conical tube 15 ml	Greiner bio-one	1888271
Conical tube 50 ml	Greiner bio-one	227261
10 ml Syringe	BD	309604
Precision wipes	Kimtech	5511
Vena8 Fluoro+ Biochips	Cellix	188V8CF-400-100-02P10	Named in Figure S1 A as 'Biochip'
Vena8 Tubing	Cellix	TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F	Named in Figure S1 B as 'Disposable tubing'
Vena8 Needles	Cellix	SS-P-B1IC-B1OC-PACK200	Named in Figure S1 B as 'Pin'
Connectors for single inlet cables of biochips	Cellix	CONNECTORS-B1IC-PACK100
Multiflow8 connect	Cellix	MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS	Named in Figure S1 B as 'Reusable tubing' and 'Splitter'
Humidified box	Cellix	HUMID-BOX
Software microfluidic pump	Cellix	N/A	Venaflux Assay
Horm Collagen	Takeda/Nycomed	1130630	Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented
HEPES buffered saline (HBS)	in house preparation	in house preparation	10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4)
Blocking buffer	in house preparation	in house preparation	1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS
Calcein AM	Molecular probes	C1430
Bleach 10%	in house preparation	in house preparation
0.1 M NaOH	in house preparation	in house preparation
Denaturated alcohol	Fiers	T0011.5
Mirus Evo Nanopump	Cellix	188-MIRUS-PUMP-EVO	with Multiflow8. Named in Figure S1 A as 'Pump' and 'Manifold'
Microscope	Zeiss	Axio Observer Z1	equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera
Software microscope	Zeiss	N/A	ZEN 2012
Hematology analyzer	Sysmex	N/A
Table Top Centrifuge	Eppendorf	521-0095
Platelet incubater	Helmer	PF-48i
Incubation water bath	GFL	1013
Pipette	Brand	A03429
Tube Roller	Ratek	BTR5-12V
Sterile docking device	Terumo BCT	TSCD
Tubing Sealer	Terumo BCT	AC-155
Vortex	VWR	58816-121