Microfluidic Flusso Camere con sangue ricostituito al modello Emostasi e piastrine Transfusion<em&gt; In Vitro</em

Riepilogo

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

Abstract

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Introduzione

Emostasi richiede l'attività combinata e regolata di cellule, proteine, ioni e tessuti in un contesto spazio-temporale limitato ^1. Attività incontrollata può portare a emorragia o trombosi e morbilità o mortalità in uno spettro di disturbi legati alla coagulazione del sangue. Un esperimento camera di flusso microfluidica è una tecnica impegnativa che imita emostasi in vitro. Questo approccio permette di indagine della complessa interazione di processi che prendono parte a emostasi con un ruolo di primo piano per le piastrine del sangue.

A seguito di danno vascolare, le piastrine aderiscono alle proteine ​​della matrice sottoendoteliale esposto (glico) per prevenire la perdita di sangue. Dopo l'adesione, piastrine attivano e aggregate in risposta automatiche e segnalazione paracrina che alla fine porta alla formazione di una rete di piastrine, stabilizzata da fibrina e conseguente fermo, avvolti trombo ² sigillatura. A differenza di molti altri test di funzionalità piastrinica, rienzementi con camere di flusso tengono conto del parametro fisico del flusso sanguigno e quindi l'influenza della reologia sulle cellule e biomolecole ^3,4 partecipanti.

esperimenti camera di flusso hanno generato intuizioni punto di riferimento in emostasi e trombosi variando i parametri chiave che influenzano emostatico (sub) processi tra cui i profili matrice adesiva, reologia e di flusso, composizione cellulare, la presenza di tossine o farmaci, forza ionica e molti altri. Negli ultimi due decenni, bassa produttività esperimenti camera di flusso che richiedono grandi volumi di campione (10-100 ml) si sono evoluti per camere di microfluidica spesso costituite da piccole camere a piatti paralleli e tra le moderne tecnologie per la perfusione di sangue intero in condizioni di parete di taglio a controllo ^5. Microscaling ha notevolmente aumentato il throughput test soprattutto perché la configurazione hardware è semplificato ed è richiesto meno (del sangue) del volume, rendendo l'esperimento più accessibile e versatiLe. Per esempio, il sangue da piccoli animali da laboratorio può ora essere utilizzato senza dover sacrificare animali. I campioni di sangue di topi geneticamente modificati hanno quindi aiutato l'identificazione di molecole chiave che promuovono o inibiscono emostasi e in nuove intuizioni fondamentali ^6.

Laboratori di ricerca specializzati spesso usano ancora camere a flusso su misura, ad esempio, da polidimetilsilossano (PDMS) ⁷ che polimerizza su stampi litografate che può essere blueprinted da un software. La camera risultante è poco costoso, monouso e può essere facilmente smontato per l'analisi post hoc. Inoltre, in pratica qualsiasi progettazione di navi, comprese le biforcazioni o curve strette può essere costruito su comando. Questo vantaggio è anche il suo lato negativo in quanto la standardizzazione era già il problema principale con gli esperimenti camera di flusso, e PDMS su misura le camere non hanno aiutato questo. In cima a questa particolare questione, rivestimento (condizioni), sonde fluorescenti, anticoagulante, temperaturaeratura e ora tra il campionamento e l'analisi sono tutti poco standardizzati ^8. La standardizzazione di queste variabili è impegnativo, ma comunque atti a consentire un confronto dei risultati tra laboratori. Questo argomento è il principale soggetto della Società Internazionale sulla Trombosi e Emostasi in sottocomitato scientifico e standardizzazione su Biorheology ^9,10.

concentrati piastrinici (PC) sono trasfusi in pazienti affetti da varie malattie che causano trombocitopenia e / o sanguinamento. Ma piastrine in PC sono noti per desensibilizzare, soprattutto in funzione del tempo di memorizzazione ^11, un processo di degrado legato all'invecchiamento e comunemente indicato come lesione stoccaggio delle piastrine. A volte si afferma che tali piastrine ripristinare in circolazione una volta trasfuse ^12, ma la prova di questo è scarsa. Inoltre, la funzionalità delle piastrine che compongono un PC non è normalmente testato perché il rapporto tra tali analisi eefficacia terapeutica o profilattica non è chiaro ^13. camere di flusso microfluidica offrono un mezzo per indagare la funzione piastrinica in PC per ottimizzare la catena di manipolazioni tra raccolta e rilascio. Si tratta di un potente strumento di ricerca per (appaiati) il confronto diretto dei PC, come abbiamo precedentemente pubblicati ^14,15 ed è descritto qui.

Protocollo

Questo protocollo segue le linee guida etiche istituzionali per la ricerca su campioni umani e il consenso informato è stato ottenuto da tutti i donatori coinvolti. L'approvazione per gli esperimenti descritti qui è stato ottenuto dal Comitato Etico dell'Ospedale di Anversa University.

Nota: le indicazioni di temperatura sono sempre a temperatura ambiente, se non diversamente specificato.

Installazione 1. Preparazione camera di flusso

1. Lanes Preparazione, tubi e Pins
   1. Vortex la sospensione collagene vigorosamente e diluire 1/20 nella soluzione di glucosio isotonica fornito dal fornitore per una concentrazione finale di 50 pg / ml.
      Nota: Usiamo collagene tendine equino, costituito principalmente di tipo I fibrille. Il equina collagene di tipo I è spesso definito come "Horm" collagene ed è lo standard d'oro per questo tipo di test ⁹ per entrambe le ragioni storiche e biologiche. tipo umano collagene III può anche essere utilizzato, ma the fibrille cappotto meno bene e la risposta piastrinica non è così forte. Altre superfici rivestimento possono anche essere utilizzati, ad esempio von Willebrand (VWF), fibrinogeno, fibronectina, laminina, vitronectina, thrombospondin-1 o combinazioni di questi ^16.
   2. Prendere un nuovo biochip usa e getta dal contenitore del provider. Le dimensioni dei biochip usati qui sono 0.4W x 0,1H x 20L in mm ^3.
   3. Pipettare 0,8 microlitri nella corsia (s) del biochip microfluidico su un'estremità del chip e marchio come uscita. Assicurarsi che la corsia è riempito 5/6 ° con il collagene contenente soluzione di rivestimento preparata in 1.1.1. Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria.
      Nota: I canali sono parzialmente rivestite per evitare l'accumulo di fibre collagene all'ingresso del canale (vedi la discussione).
   4. Incubare a 4 ° C per 4 ore o durante la notte in un contenitore umidificato e chiuso.
   5. Bloccare i canali rivestiti pipettando tampone di bloccaggio (1,0% (w / v) di siero bovino di albumina und 0.1% (w / v) di glucosio in 10 mM 4- (2-idrossietil) -1-acido piperazineethanesulfonic (HEPES) Soluzione salina tamponata (HBS, 0,9% (w / v) di NaCl, pH 7,4) all'altra estremità e marchio come ingresso. Assicurarsi che la corsia è completamente riempito con il tampone bloccante evitando bolle d'aria.
   6. Tagliare il tubo a parità di lunghezza (12 cm). Utilizzare uno per corsia e collegare ogni tubo con uno spillo. Ad esempio, un esperimento a confronto due condizioni, eseguire in duplice copia richiederà quattro tratti di tubi e quattro perni per essere preparati.
   7. Risciacquare il tubo con acqua distillata utilizzando una siringa e un ago G 26 o connettori di accompagnamento.
   8. Saturare il tubo con tampone di bloccaggio. Conservare in un contenitore chiuso e umidificato per almeno 1 ora.
2. Preparazione della pompa e collettore
   1. Risciacquare la pompa e il collettore con acqua distillata, rimuovere le bolle d'aria.
   2. Aspirare il tampone bloccante dalla corsia biochip (s) con la punta 10 microlitri fissato all'uscita. Pulire la superficie diil biochip con una polvere di precisione senza strofinare e alcol denaturato per rimuovere impronte e polvere.
   3. Fissare il biochip su un palco microscopio automatizzato. Se più di una corsia viene utilizzata contemporaneamente in una corsa, collegare l'otto corsie collettore splitter alla presa biochip.
      Nota: Il collettore splitter otto corsie è un pezzo di hardware (Figura S1) collegato alla pompa e il biochip. Esso consente il funzionamento di tutti (otto) corsie su un biochip o una combinazione di corsie che possono essere operatore definito nel software di accompagnamento disponibile.
   4. Utilizzare i perni nel tubo di risolverli in entrata biochip. Inserire l'altra estremità del tubo (senza perno) in 1,5 ml provetta conica riempita con HBS. Risciacquare tutti i tubi e loro corsie comunicanti con 1 ml HBS utilizzando la pompa, in modo da eliminare resto tampone bloccante e scarsamente aderente collagene.

2. Preparazione di campioni di sangue

1. Raccolta e separazionesangue intero fresco da un volontario sano. ¹⁷
   1. Raccogliere i primi millilitri di sangue in un tubo sottovuoto contenente acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) come anticoagulante e utilizzare esclusivamente questo campione per la completa emocromo (CBC) con un analizzatore ematologico automatico.
   2. Raccogliere un volume di sangue in un anticoagulante adeguato utilizzando tubi evacuati. anticoagulanti standard per esperimenti di camera di flusso sono eparina o irudina quando fibrina formazione non è parte del protocollo di studio e citrato di sodio quando è.
      Nota: eparina è stato usato come anticoagulante per tutti gli esperimenti descritti nei risultati.
      Nota: La quantità di sangue dipende dal numero di esperimenti da eseguire. Circa 1 tubo (7 ml) per 3 corsie.
   3. Posizionare i tubi su un rotatore in attesa di ricostituzione del sangue.
      Nota: Il test dovrebbe essere completato entro 3 ore di salasso.
   4. Centrifugare per 15 minuti a 250 g per preparare plasma ricco di piastrine (PRP). Non utilizzare la pausa centrifuga per evitare disturbi del pellet poco compresso.
      1. Quando più di un tubo è stato raccolto, unire il sangue in un singolo tubo di centrifugazione conica.
         Nota: centrifugazione può essere fatto più lentamente o meno lungo, a seconda della resa PRP e "contaminazione" differenziale cellulare preferito.
   5. Rimuovere e gettare la PRP e buffy coat cedendo globuli rossi concentrati con poche piastrine.
      Nota: la conta piastrinica nella frazione di globuli rossi al sacco è 13 ± 5 x 10 ³ per ml (media ± SD, n = 12), in media, nelle nostre mani.
2. Ricostituzione del sangue
   1. Scongelare gruppo sanguigno AB (Rhesus D negativo) plasma a 37 ° C per 5 min e 20 sec per 4 ml.
   2. Determinare l'ematocrito dei globuli rossi concentrati preparati in 2.1.5 utilizzando un analizzatore ematologico automatico.
   3. Determinare la concentrazione di piastrine nella banca del sangue preparato concentrato piastrinico that saranno utilizzati per ricostituire la frazione di globuli rossi sopra.
   4. Calcolare il volume di globuli rossi concentrati e concentrato piastrinico che consentiranno di ottenere il 40% di ematocrito e 250 x 10³ piastrine / ml in un campione di 1 ml.
      Nota: Altri titoli bersaglio di cellule possono essere fissate in modo arbitrario, a seconda del protocollo di studio.
   5. Trasferimento imballato globuli rossi e il plasma in una nuova provetta utilizzando una punta della pipetta tagliata e aggiungere delle piastrine concentrato fino a raggiungere un volume di campione di 1 ml.
      Nota: a seconda delle variabili studiate, la frazione di plasma deve essere uguale in tutti i campioni ricostituiti perché plasma ha una notevole influenza sul tasso di formazione di trombi. Per esempio, ripetuti di congelamento-scongelamento o plasma presi da donatori diversi o in differenti anticoagulanti può influenzare il risultato.
   6. Mescolare il sangue ricostituito con cura capovolgendo ed eseguire un CBC.
   7. Preparare un campione di controllo "vuoto", in cui viene sostituito il volume della frazione piastrinicodallo stesso volume di 0,9% (m / v) di cloruro di sodio in acqua per determinare la concentrazione di piastrine endogeni (cioè piastrine bancari non sangue) nel sangue ricostituito utilizzando un CBC.
3. etichettatura
   1. Pipettare 1 ml ricostituito sangue in una provetta contenente 1 ml 5 mM calceina AM (5 mM concentrazione finale).
      Nota: Altri coloranti cellulari possono essere utilizzati ^14.
   2. Mescolare delicatamente per inversione.
   3. Incubare per 5 min a 37 ° C prima dell'uso.

3. perfusione Assay

1. Fuoco l'obiettivo sulle fibre di collagene aderito al fondo delle corsie. Idealmente, utilizzare le impostazioni differenziale contrasto interferenziale (DIC) a contrasto di fase o per questa strategia messa a fuoco. Seleziona 'Z corrente impostato per le regioni di piastrelle selezionate' nel software esperimento per correggere digitalmente gli Z-posizioni selezionate.
2. Selezionare una regione di interesse (ROI) in corsia (xy) nel software esperimento del microscope che verrà registrato durante l'esperimento.
   Nota: Il ROI può essere qualsiasi superficie arbitrariamente scelto all'interno di una corsia di perfusione. Si consiglia di non analizzare formazione di trombi vicino al ingresso e l'uscita di una corsia in modo da evitare effetti collaterali del profilo portata variabile in quella regione, anche se questo è relativamente piccola. La superficie ROI deve contenere un numero significativo di piastrine o trombi per consentire il livellamento del segnale. In questo protocollo il ROI è un aggregato digitalmente cucita di tre immagini uguali dimensioni side-by-side conseguente 0,62 millimetri ² al centro della lunga corsia 2 cm.
3. Miscelare i campioni con cura capovolgendo e posizionare questi accanto al biochip sul palcoscenico automatizzato.
4. Posizionare il tubo che è collegato con l'ingresso del biochip in provette contenenti i campioni ematici ricostituiti.
5. Avviare la pompa a 50 dyne / cm ² (o altre sollecitazioni di taglio a piacere) per quei canali legati alla Provettecontenente i campioni di sangue ricostituiti utilizzando il software della pompa.
   Nota: Altri sollecitazioni di taglio possono essere usati.
6. Registrazione di immagini ogni 15 secondi per 5 minuti in tempo reale utilizzando il software di acquisizione e l'esperimento del microscopio.
   Nota: altre serie tempo può essere utilizzato a seconda del set-up sperimentale.
   Nota: Generalmente usiamo un ingrandimento 100X (obiettivo 10X e 10X lenti), ma superiore (o inferiore) ingrandimento può essere facilmente utilizzato come alternativa.

4. Lavare Out

1. Lavare tutti i tubi attaccato alla presa e collegato al collettore multicanale o pompa con acqua distillata, seguito da ipoclorito di sodio (candeggina) 0,5% (v / v) ed infine 0,1 M NaOH in acqua. Scartare il tubo appuntato verso l'ingresso del biochip come rifiuti pericolosi.

Analisi 5. I dati

1. Determinare cinetica di crescita trombo con il software di analisi delle immagini. I seguenti comandi sono specifici per ZEN2012.
   1. Aprire il plug-in di analisi dell'immagine per determinare la copertura della superficie delle piastrine.
   2. Impostare la soglia di fluorescenza nella Analizzare scheda interattiva per definire l'intensità dei pixel che si correla con un segnale positivo, vale a dire di una targhetta aderito o piastrine aderenti.
   3. Usare Creare tabelle per generare automaticamente un foglio di calcolo che conterrà le superfici separate (in micron ²⁾ di quegli "oggetti" che contengono pixel con un segnale tra le soglie selezionate. Questa operazione viene eseguita per ogni punto.
      Nota: Una volta che le soglie di fluorescenza sono stati scelto, il software di analisi rileva automaticamente "oggetti" nel campo che soddisfano i criteri. Questi oggetti sono trombi, piccoli aggregati piastrinici o piastrine singole e coprono un numero di pixel. Ogni oggetto è elencata nel foglio di calcolo a parte.
   4. Salvare questi fogli di calcolo in formato XML e aprirli in un programma di foglio di calcoloper ulteriori calcoli.
   5. Totale aree della superficie degli oggetti selezionati per sommatoria e dividere il risultato per la superficie totale del campo di misura (micron ^2). Questo produrrà la copertura della superficie relativa (%). Farlo per ogni punto di tempo.
   6. Tracciare queste coperture superficiali in funzione del tempo di perfusione e calcolare la pendenza mediante regressione lineare, ottiene il cinetica di crescita trombo di quella particolare condizione.

Risultati

Per dimostrare la variazione intra-saggio, tre identici campioni di sangue intero sono stati ricostituiti perfusi simultaneamente su superfici di collagene rivestito (Figura 1). Ciò ha determinato un coefficiente di variazione del 8,7%. Questa statistica suggerisce accettabile intra-saggio e la variazione intralaboratorio permettendo il confronto affidabile tra i campioni relativi.

L'entrata della camera ...

Discussione

Esperimenti camera di flusso microfluidici sono un ottimo strumento per studiare la funzione delle piastrine nel sangue che scorre e sono utilizzate per valutare l'emostasi in vitro in diversi contesti sperimentali. Nonostante scarsa standardizzazione interlaboratorio ^9, dimostriamo che all'interno del nostro laboratorio la variazione sperimentale è accettabile. Questo permette di confrontare in modo affidabile campioni (appaiati) all'interno di un determinato studio. Questo è stato con...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD vacutainer tube with EDTA	Becton, Dickinson and Company	368856
BD vacutainer tube with Heparin	Becton, Dickinson and Company	368480
BD vacutainer tube with Sodium Citrate	Becton, Dickinson and Company	366575
Hirudin Blood tube	Roche	6675751 001
BD vacutainer Eclipse	Becton, Dickinson and Company	368650	Blood collection needle with preattached holder
Pipette tips 100-1,000	Greiner bio-one	740290
Pipette tips 2-200	Greiner bio-one	739280
Pipette tips 1-10	Eppendorf	A08928
Tube 5 ml	Simport	11691380
Conical tube 15 ml	Greiner bio-one	1888271
Conical tube 50 ml	Greiner bio-one	227261
10 ml Syringe	BD	309604
Precision wipes	Kimtech	5511
Vena8 Fluoro+ Biochips	Cellix	188V8CF-400-100-02P10	Named in Figure S1 A as 'Biochip'
Vena8 Tubing	Cellix	TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F	Named in Figure S1 B as 'Disposable tubing'
Vena8 Needles	Cellix	SS-P-B1IC-B1OC-PACK200	Named in Figure S1 B as 'Pin'
Connectors for single inlet cables of biochips	Cellix	CONNECTORS-B1IC-PACK100
Multiflow8 connect	Cellix	MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS	Named in Figure S1 B as 'Reusable tubing' and 'Splitter'
Humidified box	Cellix	HUMID-BOX
Software microfluidic pump	Cellix	N/A	Venaflux Assay
Horm Collagen	Takeda/Nycomed	1130630	Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented
HEPES buffered saline (HBS)	in house preparation	in house preparation	10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4)
Blocking buffer	in house preparation	in house preparation	1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS
Calcein AM	Molecular probes	C1430
Bleach 10%	in house preparation	in house preparation
0.1 M NaOH	in house preparation	in house preparation
Denaturated alcohol	Fiers	T0011.5
Mirus Evo Nanopump	Cellix	188-MIRUS-PUMP-EVO	with Multiflow8. Named in Figure S1 A as 'Pump' and 'Manifold'
Microscope	Zeiss	Axio Observer Z1	equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera
Software microscope	Zeiss	N/A	ZEN 2012
Hematology analyzer	Sysmex	N/A
Table Top Centrifuge	Eppendorf	521-0095
Platelet incubater	Helmer	PF-48i
Incubation water bath	GFL	1013
Pipette	Brand	A03429
Tube Roller	Ratek	BTR5-12V
Sterile docking device	Terumo BCT	TSCD
Tubing Sealer	Terumo BCT	AC-155
Vortex	VWR	58816-121