Mikroakışkan Akış Chambers Hemostaz ve Trombosit Transfüzyon Model Sulandırılarak Kan kullanma<em&gt; İn Vitro</em

Özet

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

Özet

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Giriş

Hemostaz kısıtlı zamanmekansal bağlamda ¹ hücreleri, proteinler, iyonlar ve dokuların kombine ve düzenlenmiş aktivite gerektirir. Kontrolsüz etkinliği kan pıhtılaşması ile ilgili bozuklukların bir spektrum içinde kanama ve tromboz ve morbidite ve mortaliteye neden olabilir. Bir mikroakışkan akış odası deneyi in vitro hemostazisi taklit zorlu bir tekniktir. Bu yaklaşım, kan trombositlerin için öncü bir role sahip hemostaz katılan süreçlerin karmaşık etkileşimin soruşturma sağlar.

vasküler hasar ardından, trombositler, kan kaybını önlemek için maruz subendotelyal matris (gliko) proteinlere yapışır. Yapışma ardından, trombositler aktive ve yanıt olarak agrega matik ve nihayet bir trombosit ağının oluşumu, fibrin tarafından stabilize ve bir firmaya neden neden parakrin sinyal için, trombüs ² sızdırmazlık yara. Diğer çoğu trombosit fonksiyon testleri, deney aksineAkış odaları ile ments dikkate kan akımının fiziksel parametre ve bu nedenle katılımcı hücreler ve biyomoleküllerin ^3,4 tarihinde reolojinin etkisini alır.

Akış odası deneyleri yapışkan matrisi, reoloji ve akış profilleri, hücresel kompozisyon, toksinler veya ilaç, iyonik kuvvet ve daha birçok varlığı da dahil olmak üzere süreçler hemostatik (alt) etkileyen önemli parametreler değiştirilerek hemostaz ve tromboz dönüm noktası anlayışlar yarattı. Son yirmi yılda, büyük örneklem hacimleri (10-100 ml) gerektiren düşük verim akım odası deneyleri mikroakışkan odaları genellikle küçük paralel plaka odadan oluşan ve kontrollü duvar kesme koşullarında ⁵ de tam kan perfüze için modern teknolojiyi dahil etmek gelişmiştir. donanım kurulum basitleştirilmiş ve daha az (kan) hacmi gereklidir çoğunlukla nedeniyle Microscaling önemli ölçüde deneme daha erişilebilir ve Versati render tahlil verimi arttıle. Örneğin, küçük laboratuar hayvanlarından kan Böylece hayvanlar kurban gerek kalmadan kullanılabilir. Genetiği değiştirilmiş farelerin kan örnekleri böylece hemostaz teşvik veya inhibe anahtar moleküller belirlenmesinde ve yeni temel anlayışlar ⁶ yardımcı olmaktadır.

Özel araştırma laboratuarları çoğu hala yazılım tarafından blueprinted edilebilir Baskılı kalıplara polimerize polidimetilsiloksan (PDMS) ⁷ den, örneğin özel yapılmış akış odaları kullanın. Ortaya çıkan odası, ucuz tek kullanımlık ve kolayca post hoc analizi için demonte edilebilir. Ayrıca, temelde gemiler de dahil olmak üzere bifurkasyonlarında veya keskin dönüşler herhangi bir tasarım komutu üzerine inşa edilebilir. Bu avantaj da standardizasyon zaten akış odası deneyleri ile birincil sorun bu yana olumsuz ve PDMS özel odalar bu destekli değil yaptı. Bu belirli bir sorunun üstüne kaplama (şartlar), floresan probları, antikoagülan, geçici üzerindenumune alma ve analiz arasındaki kısa süreli olarak ve zaman tüm kötü ⁸ standardize edilmiştir. Bu değişkenlerin Standardizasyon zorlu ama yine de laboratuarlar arasında sonuçların karşılaştırılmasına olanak gerekmektedir. Bu konu Biorheology ^9,10 Bilimsel ve Standardizasyon alt komite Tromboz ve hemostaz üzerine International Society önemli bir konudur.

Trombosit konsantreleri (PC) trombositopeni ve / veya kanamaya neden çeşitli hastalıklardan mustarip hastalarda transfüzyon. Ama PC trombositler özellikle depolama süresinin ¹¹ işlevinde, duyarsız bilinen bir bozulma süreci yaşlanma ve yaygın olarak trombosit saklama lezyon olarak anılacaktır bağlantılı. Bazen bu tür plateletler kez ¹² transfüzyon dolaşımda geri iddia edilmektedir, ancak bunun için kanıt azdır. Ayrıca, bir PC oluşturan trombosit işlevselliği rutin test değil çünkü bu tür tahliller arasındaki ilişkiterapötik ya da profilaktik etkisi açık ^13'tür. Mikroakışkan akış odaları toplama ve ihracı arasındaki manipülasyonlar zincirini optimize etmek için PC trombosit fonksiyonlarını araştırmak için bir araç sunuyoruz. Biz daha önce ^14,15 yayınlanmış ve burada tarif edildiği gibi PC doğrudan (eşli) karşılaştırmalar için güçlü bir araştırma aracıdır.

Protokol

Bu protokol, insan numuneler üzerinde araştırmalar için kurumsal etik kuralları takip ve bilgilendirilmiş onam ilgili tüm vericilerden elde edildi. Burada tarif edilen deneyler için onay Antwerp Üniversitesi Hastanesi kurumsal inceleme kurulu elde edilmiştir.

Not: belirtilmediği sürece Sıcaklık göstergeleri, her zaman oda sıcaklığı vardır.

1. Hazırlık Akış Odası Kurulumu

1. Hazırlama Lanes, Boru ve iğneler
   1. Vorteks kuvvetli bir şekilde kollajen süspansiyonu ve 50 ug / ml'lik bir nihai konsantrasyona kadar sağlayıcı tarafından sağlanan izotonik glikoz çözeltisinde 1/20 seyreltin.
      Not: Biz esas olarak tip I fibriller oluşur, at tendon kollajen kullanın. At kollajen tip I sık sık "Horm" kolajen olarak adlandırılır ve tarihsel yanı sıra biyolojik nedenlerle hem tahlil ⁹ bu tür altın standardı mesafesindedir. İnsan tip III kollajen de kullanılabilir, ancak inci edilebilire daha az kat fibrillerinde ve trombosit cevabı kadar güçlü değildir. Diğer kaplama yüzeyleri de, örneğin von Willebrand Faktörü (vWF), fibrinojen, fibronektin, laminin, vitronektin, trombospondin-1 ya da bu ¹⁶ kombinasyonları için, kullanılabilir.
   2. sağlayıcının kaptan yeni bir atılabilir Bioçip alın. Burada kullanılan bioçipler boyutları mm ³ 0.4 W x 0.1 H x 20L vardır.
   3. Pipetleyin çıkış olarak çip ve işaretinin bir ucunda mikroakışkan Biochip kulvar (lar) 0.8 ul. şerit 1.1.1 hazırlanan kaplama çözeltisi içeren kollajen ile 5 / 6th dolu olduğundan emin olun. hiç hava kabarcığı olmadığından emin olun.
      Not: Kanallar kısmen (tartışma) kanalı girişinde kollajen liflerinin birikmesini önlemek için kaplanır.
   4. nemlendirilmiş ve kapalı bir kap içinde 4 saat veya gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
   5. / H) inek serumu albumin (w bloke edici tampon (% 1.0 pipetleme kaplanmış kanallarını blokediğer ucu ile gösterirken, d,% 0.1 (a / h) glukoz, 10 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES) tamponlu tuzlu su (hacim / hacim) NaCl, pH 7.4% 0.9 (HBA) 'de giriş olarak. şerit tamamen hava kabarcıkları kaçınarak engelleme tamponu ile dolu olduğundan emin olun.
   6. eşit uzunlukta (12 cm) hortumu kesilir. kulvar başına birini kullanın ve bir iğne ile her tüp bağlayın. Örneğin, iki nüsha halinde çalışan iki koşulları karşılaştıran bir deney, dört boru uzanıyor ve dört pim hazırlanacak gerektirecektir.
   7. bir şırınga ve bir 26 G iğne ya da eşlik eden bağlayıcıları kullanılarak saf su ile boru durulayın.
   8. bloklama tamponu ile boru doyurabilecek. 1 saat arasında, en az bir kapalı ve nemli bir kap içinde depolayın.
2. Pompa ve Manifold hazırlama
   1. hava kabarcıklarını çıkarmak, pompayı durulayın ve damıtılmış su ile manifoldu.
   2. çıkışında sabit 10 ul ucunu kullanarak biyoçip şeritli (ler) engelleme tampon aspire. yüzeyini temizleyinhassas silip toz ve denatüre alkol ile Biochip baskılar ve tozunu alın.
   3. otomatik mikroskop sahnede Bioçip sabitleyin. Birden fazla şeritli bir seferde aynı anda kullanılırsa, biyoçip çıkışına sekiz şerit manifoldu ayırıcı bağlanır.
      Not: Sekiz şeritli manifoldu ayırıcı donanım parçasıdır (Şekil S1) pompa ve Biochip bağlı. Bu Bioçip veya operatör tanımlı eden yazılım olabilir şerit kombinasyonuna tüm (sekiz) şerit çalışmasını sağlar.
   4. biochipin girişinde bunları düzeltmek için tüp işaretçilerine kullanın. HBS ile doldurulmuş 1.5 ml konik biçiminde bir test tüpü içinde (PIN olmadan) hortumun diğer ucu yerleştirin. kalan tampon engelleme ve kötü kolajen yapışmış kaldırmak amacıyla, tüm boru ve 1 ml HBS pompa kullanılarak onların bağlı şerit durulayın.

Kan Örneklerinin 2. Hazırlık

1. Toplama ve ayırmaSağlıklı bir gönüllüden taze tam kan. ¹⁷
   1. Bir pıhtılaşma önleyici olarak etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ihtiva eden bir tahliye borusu kan ilk mililitre toplamak ve özel olarak otomatik bir hematoloji analiz cihazı ile tam kan sayımı (CBC), bu örnek kullanın.
   2. tahliye tüpler kullanılarak uygun bir antikoagülan kan hacmi toplayın. oluşumunu fibrin çalışma protokolüne ve sodyum sitrat parçası değilken akış odası deneyleri için standart antikoagülan heparin ya da hirudindir vardır.
      Not: Heparin açıklanan tüm deneyler için bir antikoagulan olarak kullanılmıştır.
      Not: kan miktarı yapılacak deneyler sayısına bağlıdır. Yaklaşık 3 şerit 1 borusu (7 mi).
   3. Bir rotator bekleyen kan sulandırma üzerinde tüpler yerleştirin.
      Not: Tahlil Flebotomi 3 saat içinde tamamlanmalıdır.
   4. Trombosit bakımından zengin plazma 250 g'da 15 dakika boyunca santrifüj (PRP). gevşekçe paketlenmiş pelet olumsuz yönde etkilenmemesi için santrifüj mola kullanmayın.
      1. Birden fazla tüp toplandı zaman, tek bir konik santrifüj tüpü içinde kan havuzu.
         Not: Santrifüj PRP verim ve ayırıcı hücre "kontaminasyon" bağlı, daha yavaş ya da daha az uzun yapılabilir tercih.
   5. Çıkarın ve birkaç trombositler ile dolu kırmızı kan hücrelerinin veren PRP ve buffy coat atın.
      Bizim elimizde ortalama ul başına 13 ± 5 x 10 ³ paketlenmiş kırmızı hücre fraksiyonunda trombosit sayısı ise (ortalama ± SD, n = 12): Not.
2. kan Sulandırma
   1. 5 dakika ve 4 ml başına 20 saniye süreyle, 37 ° C'de çözülme kan grubu AB (Rhesus D negatif), plazma.
   2. otomatik bir hematoloji analiz cihazı kullanılarak 2.1.5 hazırlanan paketlenmiş kırmızı kan hücrelerinin hematokriti belirler.
   3. Kan bankasında trombosit konsantrasyonunu belirlemek trombosit konsantresi tha hazırlanmışT, yukarıda kırmızı hücre fraksiyonu tekrar oluşturmak için kullanılır.
   4. 1 ml'lik bir örnek% 40 hematokrit ve 250 x 10³ trombosit / ul verecektir eritrosit, trombosit konsantresi hacmini hesaplar.
      Not: Hücrelerin Diğer hedef titreleri çalışma protokolüne bağlı olarak, keyfi olarak ayarlanabilir.
   5. Transfer kırpılmış bir pipet ucu kullanılarak ve 1 ml lik bir numune hacmi elde edilene kadar trombosit konsantresi ilave taze tüpe kırmızı kan hücreleri ve plazma paketlendi.
      Not: Plazma trombüs oluşumu oranı üzerinde önemli bir etkiye sahip olduğu değişkenler okudu bağlı olarak, plazma fraksiyonu tüm sulandırılmış örneklerde eşit olmalıdır. Örneğin, sonuç etkileyebilir farklı donörden veya farklı antikoagülan alınan donma-çözülme ya da plazma tekrarladı.
   6. yavaşça ters çevirerek yeniden kan karıştırın ve bir CBC gerçekleştirin.
   7. trombosit fraksiyonun hacmi ikame edildiği bir "boş" kontrol numunesi hazırlanması% 0.9 su (kütle / hacim) sodyum klorür, aynı hacimde bir CBC kullanılarak yeniden kan endojen trombosit konsantrasyonu (yani, kan bankası trombositler) belirlemek gerekmektedir.
3. etiketleme
   1. Pipet 1 mi 1 ul 5 mM Calcein AM (5 uM nihai konsantrasyon) ihtiva eden bir test tüpüne kan yeniden.
      Not: Diğer hücre boyalar ¹⁴ kullanılabilir.
   2. ters çevirerek yavaşça karıştırın.
   3. kullanımdan önce, 37 ° C'de 5 dakika süreyle inkübe edilir.

3. Perfüzyon Testi

1. şerit dibinde yapıştırılır kollajen lifleri üzerinde nesnel odaklanın. İdeal olarak, bu odaklanma stratejisi için faz-kontrast veya diferansiyel girişim kontrast (DIC) ayarlarını kullanın. dijital seçilen Z-pozisyonları düzeltmek için deneme yazılımı 'seçilen çini bölgeler için ayarlayın akım Z' seçeneğini seçin.
2. m deney yazılımı şeritli (xy) ilgi (ROI) bir bölge seçinDeney sırasında kaydedilir icroscope.
   Not: ROI keyfi bir perfüzyon şeritte içinde seçilen herhangi bir yüzey alanı olabilir. Nedenle bu göreceli olarak küçük olsa da, bu bölgede değişken akış profilinin yan etkilerden kaçınmak için yakın bir şeritli giriş ve çıkışına trombüs oluşumunu analiz için tavsiye edilir. YG yüzey alanı trombositlerin önemli sayıda içeren ya da sinyal tesviye izin trombüs gerekir. Bu protokolde YG 2 cm uzunluğundaki Lane ortasında 0.62 mm ^2'de elde edilen üç eşit yan tarafında bir görüntü dijital olarak dikilmiş toplamıdır.
3. yavaşça tersini örnekleri karıştırın ve otomatik sahnede Biochip bu sonraki yerleştirin.
4. sulandırılmış kan örnekleri içeren test tüplerinde Biochip girişi ile bağlantılı olan boru yerleştirin.
5. Test tüplerine bağlı olan kanallar için (istediğiniz gibi ya da diğer kesme stresleri) 50 din / ^cm2 pompayı başlatınpompa yazılımı kullanılarak yeniden kan örnekleri ihtiva etmektedir.
   Not: Diğer kayma gerilmeleri kullanılabilir.
6. Tutanak görüntüleri mikroskop edinimi ve deney yazılımı kullanarak gerçek zamanlı olarak 5 dakika boyunca her 15 sn.
   Not: Diğer zaman serisi deneysel set-up bağlı kullanılabilir.
   Not: Genellikle 100X büyütme (10X objektif ve 10X lens) kullanır, ancak daha yüksek (veya daha düşük) büyütme kolayca bir alternatif olarak kullanılabilir.

4. Yıkama Out

1. sodyum hipoklorit (çamaşır suyu)% 0.5, ardından her tüp çıkışına bağlı ve damıtılmış su kullanılarak çok kanallı manifoldu veya pompaya bağlı yıkayın (h / h) ve su son olarak 0.1 M NaOH. tehlikeli atık olarak biyoçip girişine tutturulmuş boru atın.

5. Veri Analizi

1. görüntü analiz yazılımı ile trombüs büyüme kinetikleri belirleyin. aşağıdaki komutlar ZEN2012 özgüdür.
   1. Trombositlerin yüzey kapsama belirlemek için eklenti Görüntü Analizi açın.
   2. Olumlu bir sinyal ile ilişkilidir piksel yoğunluğunu belirlemek için İnteraktif sekmesini Analiz, yani bir yapışık trombosit ya da yapışan trombositler floresan eşiğini ayarlayın.
   3. Otomatik olarak seçilen eşik arasında bir sinyal ile pikselleri ihtiva eden "nesnelerin" nin (mikron ²⁾ ayrı yüzey alanlarını içerecek bir elektronik tablo oluşturmak için Tablolar oluşturma kullanın. Bu, her bir zaman noktası için gerçekleştirilir.
      Not: floresan eşikleri seçti edildikten sonra, analiz yazılımı otomatik olarak kriterleri yerine görünüm alanına 'nesneleri' olarak algılar. Bu nesneler trombüsler, küçük trombosit agrega veya tek trombositler ve piksel sayısını kapsamaktadır. Her nesne ayrı ayrı e-tabloda listelenir.
   4. xml formatında bu elektronik tabloları kaydedin ve bir elektronik tablo programı bunları açıksonraki hesaplamalar için.
   5. Toplamı ile seçilen nesnelerin toplam yüzey alanları ve ölçüm alanına (mikron ²⁾ toplam alanın tarafından sonucu bölün. Bu göreceli yüzey kaplama (%) verecektir. Her zaman noktası için bunu.
   6. Perfüzyon, zamanın bir fonksiyonu olarak, bu yüzey Kapsamlı Konu ve söz konusu durumun trombüs büyümesi kinetiğini sonuçta, doğrusal regresyon ile eğimi hesaplanır.

Sonuçlar

Analiz içi varyasyon göstermek için, üç aynı yeniden tam kan numuneleri kollajen kaplı yüzeylerin (Şekil 1) üzerinde eşzamanlı olarak perfüze edildi. Bu% 8.7 bir farklılaşma katsayısı ile sonuçlanmıştır. Bu istatistik ile ilgili örnekler arasında kıyas izin kabul edilebilir içi tahlil ve laboratuvarda varyasyon göstermektedir.

Burada tarif ticari akış odasının giriş ölçüm göz...

Tartışmalar

Mikroakışkan akış odası deneyleri kan akan trombosit fonksiyonlarını araştırmak için mükemmel bir araçtır ve deneysel bağlamlarda farklı in vitro hemostaz değerlendirmek için kullanılır. Fakir laboratuvarlar arası standardizasyonun ⁹ rağmen bizim laboratuvar içinde deneysel varyasyon kabul edilebilir olduğunu göstermektedir. Bu güvenilir, belirli bir çalışma içinde (eşli) örnekleri karşılaştırmak için izin verir. Bu kan bankası koşullarında ¹¹ trombos...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD vacutainer tube with EDTA	Becton, Dickinson and Company	368856
BD vacutainer tube with Heparin	Becton, Dickinson and Company	368480
BD vacutainer tube with Sodium Citrate	Becton, Dickinson and Company	366575
Hirudin Blood tube	Roche	6675751 001
BD vacutainer Eclipse	Becton, Dickinson and Company	368650	Blood collection needle with preattached holder
Pipette tips 100-1,000	Greiner bio-one	740290
Pipette tips 2-200	Greiner bio-one	739280
Pipette tips 1-10	Eppendorf	A08928
Tube 5 ml	Simport	11691380
Conical tube 15 ml	Greiner bio-one	1888271
Conical tube 50 ml	Greiner bio-one	227261
10 ml Syringe	BD	309604
Precision wipes	Kimtech	5511
Vena8 Fluoro+ Biochips	Cellix	188V8CF-400-100-02P10	Named in Figure S1 A as 'Biochip'
Vena8 Tubing	Cellix	TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F	Named in Figure S1 B as 'Disposable tubing'
Vena8 Needles	Cellix	SS-P-B1IC-B1OC-PACK200	Named in Figure S1 B as 'Pin'
Connectors for single inlet cables of biochips	Cellix	CONNECTORS-B1IC-PACK100
Multiflow8 connect	Cellix	MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS	Named in Figure S1 B as 'Reusable tubing' and 'Splitter'
Humidified box	Cellix	HUMID-BOX
Software microfluidic pump	Cellix	N/A	Venaflux Assay
Horm Collagen	Takeda/Nycomed	1130630	Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented
HEPES buffered saline (HBS)	in house preparation	in house preparation	10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4)
Blocking buffer	in house preparation	in house preparation	1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS
Calcein AM	Molecular probes	C1430
Bleach 10%	in house preparation	in house preparation
0.1 M NaOH	in house preparation	in house preparation
Denaturated alcohol	Fiers	T0011.5
Mirus Evo Nanopump	Cellix	188-MIRUS-PUMP-EVO	with Multiflow8. Named in Figure S1 A as 'Pump' and 'Manifold'
Microscope	Zeiss	Axio Observer Z1	equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera
Software microscope	Zeiss	N/A	ZEN 2012
Hematology analyzer	Sysmex	N/A
Table Top Centrifuge	Eppendorf	521-0095
Platelet incubater	Helmer	PF-48i
Incubation water bath	GFL	1013
Pipette	Brand	A03429
Tube Roller	Ratek	BTR5-12V
Sterile docking device	Terumo BCT	TSCD
Tubing Sealer	Terumo BCT	AC-155
Vortex	VWR	58816-121