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요약

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

초록

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

서문

지혈은 제한된 시공간 상황 (1) 세포, 단백질, 이온 및 조직의 결합과 규제 활동을 필요로한다. 제어되지 않은 활동은 혈액 응고 관련 질환의 스펙트럼에 출혈이나 혈전증 및 이환율이나 사망률의 원인이됩니다. 미세 유체 흐름 챔버 실험은 시험관 내에서 지혈을 모방 도전적인 기술이다. 이 방법은 혈소판에 대한 선도적 인 역할과 지혈에 참여 프로세스의 복잡한 상호 작용의 조사를 할 수 있습니다.

혈관 손상에 따라, 혈소판은 혈액 손실을 방지하기 위해 피하 노출 매트릭스 (글리코) 단백질에 부착. 접착 후, 혈소판 활성화 및 답변 집합체 자동 - 최종적 혈소판 네트워크의 형성에 의해 안정화 피브린 및 회사의 결과에 이르게 분비 시그널링 혈전이 밀봉 권취. 대부분 혈소판 기능 검사, 체험관 달리흐름 챔버와 사항이 고려 혈류의 물리적 파라미터 따라서 멀티플 세포 및 생체에 3,4- 레올의 영향을.

흐름 챔버 실험은 접착제 매트릭스, 유동성 및 흐름 프로필, 세포 성분, 독성 물질이나 약물, 이온 강도 및 더 많은 존재 포함되는 프로세스 지혈 (하위)에 영향을 미치는 주요 매개 변수를 변화시켜 지혈과 혈전의 랜드 마크 통찰력을 생성했다. 지난 20 년에 큰 샘플 볼륨 (10 ~ 100 ml)에 요구되는 낮은 처리량 흐름 챔버 실험은 미세 유체 챔버 종종 작은 평행 판 챔버로 구성된 제어 벽 전단 조건 5에서 전체 혈액 관류를 위해 현대 기술을 포함하여 진화했다. 하드웨어 설치가 간단하고 이하 (혈액) 볼륨이 필요한 대부분 때문에 Microscaling 크게 실험이 더 접근하고 versati 렌더링, 분석 처리량을 증가르. 예를 들어, 작은 실험실 동물에서 혈액 해주기 동물을 희생하지 않고도 사용될 수있다. 유전자 변형 생쥐의 혈액 샘플 따라서 지혈을 촉진 또는 억제 키 분자의 식별과 새로운 기본적인 통찰력 6 도움을했습니다.

전문 연구소들은 여전히 소프트웨어에 의해 청사진을 할 수 석판 금형에 중합 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 7에서 예를 들어 사용자 정의 만든 흐름 챔버를 사용합니다. 그 결과 챔버는 저렴한 일회용하고 쉽게 사후 분석을 위해 분해 할 수 있습니다. 또한, 기본적으로 선박을 포함 분기점 또는 날카로운 회전의 디자인은 명령에 구축 할 수 있습니다. 이러한 장점은 표준화가 이미 흐름 챔버 실험과 기본 문제 이후의 단점이며, PDMS 사용자 정의 챔버이 도움하지 않은했다. 이 특정 문제의 위에, 코팅 (조건), 형광 프로브, 항응고제, 온도에샘플링과 분석 사이 erature와 시간이 모두 제대로 팔을 표준화하고 있습니다. 이러한 변수의 표준화에 도전하지만, 그럼에도 불구하고 실험실 간 결과의 비교를 가능하게 할 필요가 있습니다. 이 항목에서는 Biorheology 9,10에 과학 및 표준화 소위원회에서 혈전증 및 지혈에 관한 국제 사회의 주요 주제이다.

혈소판 농축액 (PC)는 혈소판 감소증 및 / 또는 출혈의 원인이 다양한 질병을 앓고있는 환자에 수혈된다. 그러나 PC 혈소판 특히 저장 시간 (11)의 기능에 둔감하도록 공지되어 열화 과정 노화 일반적 혈소판 기억 장애라고 링크. 때때로 혈소판 번 (12) 수혈 혈액 순환에 복원 주장하지만, 이것에 대한 증거는 부족하다. 또한, PC를 구성하는 혈소판의 기능은 통상적으로 시험되지 않기 때문에 이러한 분석법과의 관계치료 또는 예방 효과는 불분명 (13)이다. 미세 유동 챔버 수집 및 발의 조작 사이의 사슬을 최적화하는 PC에서 혈소판 기능을 조사하기위한 수단을 제공한다. 우리가 이전에 14,15을 발표하고 여기에 설명 된 바와 같이 PC의 직접 (쌍) 비교를위한 강력한 연구 도구입니다.

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프로토콜

이 프로토콜은 인간의 샘플에 대한 연구에 대한 기관 윤리 지침을 다음과 동의서가 포함 된 모든 기증자로부터 얻은 것입니다. 여기에 설명 된 실험에 대한 승인은 앤트워프 대학 병원의 임상 시험 심사 보드에서 얻었다.

주 : 지정하지 않는 온도 표시는 항상 실온이다.

1. 준비 유량 용기 설치

  1. 준비 레인, 튜브와 핀
    1. 격렬하게 소용돌이 콜라겐 현탁액를 50㎍ / ㎖의 최종 농도 제공자에 의해 공급되는 등장 글루코스 용액 1/20 희석.
      참고 : 우리는 주로 유형 I 피 브릴의 구성, 말 건 콜라겐을 사용합니다. 말의 콜라겐 타입 I은 종종 "HORM"콜라겐로하고, 과거뿐만 아니라 생물학적 분석 이유 모두 9 이러한 유형의 황금 표준이다. 인간 타입 III 콜라겐도 사용되지만, 일 수있다E는 덜 코트 브릴 및 혈소판 반응은 강하지 않다. 기타 코팅 표면은 예 폰 빌레 브란트 인자 (VWF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 라미닌, 비트로 넥틴, 트롬 보스 폰딘 -1 (16) 또는 이들의 조합을 위해 사용될 수있다.
    2. 공급자의 컨테이너에서 새로운 일회용 바이오칩을 가져 가라. 여기에 사용되는 바이오칩의 크기는 mm 3 0.4W X 0.1H의 X 20L입니다.
    3. 피펫 출구로 칩과 마크의 한쪽 끝에서 미세 유체 바이오 칩의 레인 (들)에 0.8 μL. 차선은 1.1.1에서 제조 된 코팅 용액을 포함하는 콜라겐과 5 / 6를 충전되어 있는지 확인합니다. 기포가 없는지 확인합니다.
      주 : 채널은 부분적으로 (논의를 참조)의 채널의 입구에서 콜라겐 섬유의 축적을 방지하기 위해 도포된다.
    4. 가습 및 밀폐 용기에 4 시간 또는 밤새 4 ° C에서 품어.
    5. / v)의 소 혈청은 알부민 승 (버퍼를 차단 (1.0 % 피펫 팅으로 코팅 된 채널을 차단타단 마크에서, D는 0.1 % (w / v) 글루코오스 된 10 mM 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES) 완충 된 염수 (/ v)의 염화나트륨, pH 7.4의 0.9 % w (HBS)에서 입구로. 차선이 완전히 공기 방울을 방지 차단 버퍼 충전되어 있는지 확인합니다.
    6. 동일한 길이 (12cm)에서 튜브를 잘라. 레인 당 하나를 사용하여 핀 각 튜브를 연결합니다. 예를 들어, 중복에서 실행되는 두 가지 조건을 비교 실험는 4 개의 튜브 뻗어과 4 개의 핀을 준비 할 필요합니다.
    7. 주사기 및 26 G 바늘 또는 첨부 커넥터를 사용하여 증류수로 튜브를 씻어.
    8. 버퍼를 차단와 튜브를 포화. 1 시간의 최소 폐쇄 및 가습 용기에 보관할 것.
  2. 펌프 및 매니 폴드 준비
    1. 기포를 제거 펌프 린스 증류수 매니 폴드.
    2. 출구에서의 고정 된 10 ㎕의 팁을 사용하여 바이오칩 레인 (들)에서 차단 완충액 대기음. 의 표면을 청소정밀 무료로 닦아 먼지와 변성 알코올로 바이오 칩은 지문과 먼지를 제거합니다.
    3. 자동화 된 현미경 무대에 바이오칩을 수정합니다. 하나 이상의 레인 하나의 실행에서 동시에 사용되는 경우, 바이오칩 콘센트 8 레인 매니 스플리터를 연결한다.
      참고 : 8 레인 매니 폴드 스플리터는 하드웨어의 조각 (그림 S1)는 펌프와 바이오칩에 연결. 그것은 바이오칩 또는 운영자 정의 첨부 된 소프트웨어에있을 수 레인의 조합에 사용 가능한 모든 (팔) 레인의 작업을 할 수 있습니다.
    4. 바이오칩 입구에서 그들을 해결하기 위해 튜브에 핀을 사용합니다. HBS 가득 1.5 ML 원뿔 테스트 튜브 (핀없이) 튜브의 다른 쪽 끝을 놓습니다. 나머지는 버퍼를 차단하고 제대로 콜라겐을 준수 제거하기 위해, 모든 튜브 1 ML의 HBS는 펌프를 사용하여와의 연결 차선을 씻어.

혈액 샘플 2. 준비

  1. 수집 및 분리건강한 지원자에서 신선한 전혈. (17)
    1. 항응고제로 에틸렌 디아민 산 (EDTA)를 포함하는 진공 튜브에 혈액의 첫 번째 밀리리터를 수집하고 독점적으로 자동 혈액 분석기 전체 혈액 카운트 (CBC)이 샘플을 사용합니다.
    2. 대피 튜브를 사용하여 적절한 항 응고 혈액의 부피를 수집합니다. 피브린을 형성하는 연구 프로토콜과는 구연산 나트륨의 일부가 아닌 경우 유동 챔버 실험 표준 항응고제 헤파린 또는 히 루딘이다.
      주 : 헤파린 결과에 기재된 모든 실험에서 항응고제로 사용되었다.
      주 : 혈액의 양이 수행되는 실험의 수에 의존한다. 약 3 차선 1 튜브 (7 ㎖).
    3. 회 전자 출원중인 혈액 재구성에 튜브를 놓습니다.
      참고 : 분석은 정맥 절개의 3 시간 이내에 완료해야합니다.
    4. 혈소판 풍부 혈장을 제조 250 g에서 15 분 동안 원심 분리기 (PR피). 느슨하게 포장 된 펠릿의 교란을 방지하기 위해 원심 브레이크를 사용하지 마십시오.
      1. 하나 이상의 튜브가 수집 될 때, 하나의 원추형 원심 분리 튜브 내의 혈액 풀링.
        참고 : 원심 분리가 PRP 수율 및 차등 셀 "오염"에 따라, 더 느리게 이하 긴 수행 할 수 있습니다 바람직하다.
    5. 제거하고 몇 혈소판 가득 적혈구를 맺는 PRP과 버피 코트를 폐기합니다.
      우리의 손에 평균 μL 당 13 ± 5 × 10 (3) 포장 붉은 세포 분획의 혈소판이 (SD ± 의미, N = 12) : 참고.
  2. 혈액에서 재구성
    1. 5 분 4 ml의 당 20 초 동안 37 ° C에서 해동 혈액형 AB (히말라야 D 음) 플라즈마.
    2. 자동 혈액 분석기를 사용 2.1.5에서 제조 한 포장 적혈구 용적률을 결정한다.
    3. 혈액 은행에서 혈소판 농도를 결정 혈소판 농축 그쪽 제조t 위 적혈구 분획을 재구성하는데 사용된다.
    4. 1 mL의 샘플을 40 %의 적혈구 용적 및 250 × 10³ 혈소판 / μl를 산출 할 것이다 충전 적혈구 및 혈소판 농축 물의 양을 계산한다.
      주의 : 다른 타겟 셀의 역가가 연구 프로토콜에 따라 임의로 설정할 수있다.
    5. 전송은 클리핑 된 피펫 팁을 사용하고, 1 mL의 샘플 볼륨에 도달 할 때까지 혈소판 농축 물을 추가 새로운 튜브로 적혈구와 혈장을 포장.
      주 : 플라즈마 혈전 형성 비율에 큰 영향이 있기 때문에 변수 연구에 따라, 혈장 분획 모든 재구성 된 샘플에서 동일해야한다. 예를 들어, 결과에 영향을 미칠 수있는 다른 도너 또는 다른 항응고제 촬영 동결 해동 또는 플라즈마를 반복했다.
    6. 부드럽게 반전에 의해 재구성 된 혈액을 혼합하고 CBC를 수행합니다.
    7. 혈소판 부분의 볼륨이 교체되는 "빈"제어 샘플을 준비0.9 % 물 (m / v)의 염화나트륨 같은 볼륨하여 CBC를 사용하여 재구성 된 혈액 내인성 혈소판의 농도 (즉, 비 - 혈액 은행 혈소판)을 결정한다.
  3. 라벨링
    1. 1 mL를 정확하게 취하여 1 ㎕의 5 mM의 칼 세인 AM (5 μM 최종 농도)를 함유하는 시험관에 혈액을 재구성.
      주의 : 다른 세포 염료 (14)를 사용할 수있다.
    2. 반전에 의해 부드럽게 섞는다.
    3. 사용하기 전에 37 ℃에서 5 분 동안 인큐베이션.

3. 관류 분석

  1. 차선의 하단에 부착 된 콜라겐 섬유에 대물 초점. 이상적으로,이 집중 전략 위상차 또는 차등 간섭 대비 (DIC) 설정을 사용합니다. 디지털 선택된 Z-위치를 해결하기 위해 실험 소프트웨어 '를 선택 타일 영역에 대한 설정 현재 Z'를 선택합니다.
  2. 제 m의 실험 소프트웨어 차선 (XY)에서의 ROI를 선택실험 기간 동안 기록됩니다 icroscope.
    참고 : ROI가 임의로 관류 차선 내에서 선택하는 표면적이 될 수 있습니다. 너무이 비교적 작은 경우에도, 그 영역에서 가변 유동 프로파일의 부작용을 방지하기 위해 근접 차선의 유입구들 및 배출구 혈전 형성을 분석 할 수없는 것이 바람직하다. 관심 영역의 표면적은 혈소판의 상당수를 포함하거나, 신호의 수평 있도록 혈전한다. 이 프로토콜에서, ROI는 2 ㎝ 길이 차선의 중앙에 0.62 mm 2의 결과로 동일한 크기의 세 개의 나란히 이미지의 디지털 스티치 집합체이다.
  3. 부드럽게 반전 샘플을 혼합하고 자동화 된 단계에있는 바이오 칩에이 옆에 위치.
  4. 재구성 된 혈액 샘플을 함유하는 시험관에 바이오칩의 입구와 연결되어 튜브를 놓는다.
  5. 튜브를 테스트하기 위해 연결하는 채널 (필요에 따라 또는 다른 전단 응력) 50 다인 / ㎝ 2에서 펌프를 실행펌프의 소프트웨어를 사용하여 재구성 된 혈액 시료를 포함.
    참고 : 다른 전단 응력 사용할 수 있습니다.
  6. 이미지를 기록 현미경의 수집 및 실험 소프트웨어를 사용하여 실시간으로 5 분 동안 매 15 초.
    주의 : 다른 시계열 실험적 셋업에 따라 사용될 수있다.
    참고 : 우리는 일반적으로 100 배의 배율 (10 배 대물 렌즈 10 배)를 사용하지만, 더 높은 (또는 낮은) 배율 쉽게 대체 할 수있다.

4. 워시 아웃

  1. 차아 염소산 나트륨 (표백제) 0.5 %이어서 모든 튜브 출구에 부착 된 증류수를 사용하여 멀티 매니 폴드 또는 펌프에 연결을 세척 (v / v)의 물에 마지막으로 0.1 M의 NaOH. 유해 폐기물로 바이오 칩 입구에 고정 튜브를 폐기하십시오.

5. 데이터 분석

  1. 이미지 분석 소프트웨어 혈전 성장 반응 속도를 결정한다. 다음 명령은 ZEN2012에 대한 구체적인이다.
    1. 혈소판의 표면 적용 범위를 결정하기 위해 플러그인 이미지 분석을 엽니 다.
    2. ㄱ 긍정적 인 신호와 상관 픽셀 강도를 정의하는 대화 형 분석 탭, 즉 부착 식 혈소판 또는 부착 혈소판의 형광 임계 값을 설정합니다.
    3. 자동으로 선택한 임계 값 사이의 신호로 픽셀을 포함하는 "객체"의 (μm의 2) 별도의 표면 영역을 포함하는 스프레드 시트를 생성 할 테이블을 작성합니다. 이는 각각의 시점에 대해 수행된다.
      참고 : 형광 임계 값이 선택되고 나면, 분석 소프트웨어가 자동으로 기준을 충족보기 필드에서 '개체'를 검색합니다. 이러한 개체는 혈전 작은 혈소판 응집 또는 단일 혈소판되며 다수의 픽셀을 커버한다. 모든 개체는 별도 스프레드 시트에 나열됩니다.
    4. XML 형식으로 이러한 스프레드 시트를 저장하고 스프레드 시트 프로그램에서 열더 계산.
    5. 합산하여 선택된 객체의 전체 표면적과 측정 영역 (μm의 2)의 합계 면적 결과를 나눈다. 이것은 상대적 흡착율 (%)을 수득한다. 각 시점에 대해 그렇게.
    6. 재관류 시간 함수 이러한 표면 커버리지를 플롯 및 특정 조건의 혈전 성장 동역학을 수득 선형 회귀에 의해 기울기를 계산한다.

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결과

내부 분석 변화를 설명하기 위해, 3 개의 동일한 복원 된 전혈 시료를 콜라겐 코팅 된 표면 (도 1)를 통해 동시에 관류 하였다. 이는 8.7 %의 변동 계수가 발생했습니다. 이 통계는 관련 샘플 간의 신뢰성있는 비교를 허용 허용 내 분석 및 intralaboratory 변화를 의미한다.

우리는 여기 설명 상업적 유동 챔버의 입구는 상...

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토론

미세 유체 흐름 챔버 실험은 혈액을 흐르는 혈소판 기능을 조사하는 훌륭한 도구입니다 실험 상황 변화에 체외에서 지혈을 평가하는 데 사용됩니다. 가난한 실험실 간 표준화 (9)에도 불구하고, 우리는 우리의 실험실에서 실험 변동이 허용되는 것을 보여줍니다. 이것은 확실하게 주어진 연구에서 (쌍) 샘플을 비교할 수 있습니다. 이것은 혈액 은행 조건 11 혈소판 저장 해로?...

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공개

The authors have nothing to disclose.

감사의 말

The authors have no acknowledgements.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
BD vacutainer tube with EDTA Becton, Dickinson and Company368856
BD vacutainer tube with HeparinBecton, Dickinson and Company368480
BD vacutainer tube with Sodium CitrateBecton, Dickinson and Company366575
Hirudin Blood tubeRoche6675751 001
BD vacutainer EclipseBecton, Dickinson and Company368650Blood collection needle with preattached holder
Pipette tips 100-1,000Greiner bio-one740290
Pipette tips 2-200Greiner bio-one739280
Pipette tips 1-10EppendorfA08928
Tube 5 mlSimport11691380
Conical tube 15 mlGreiner bio-one1888271
Conical tube 50 mlGreiner bio-one227261
10 ml SyringeBD309604
Precision wipesKimtech5511
Vena8 Fluoro+ BiochipsCellix188V8CF-400-100-02P10Named in Figure S1 A as 'Biochip'
Vena8 TubingCellixTUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100FNamed in Figure S1 B as 'Disposable tubing'
Vena8 NeedlesCellixSS-P-B1IC-B1OC-PACK200Named in Figure S1 B as 'Pin'
Connectors for single inlet cables of biochipsCellixCONNECTORS-B1IC-PACK100
Multiflow8 connectCellixMF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSISNamed in Figure S1 B as 'Reusable tubing' and 'Splitter'
Humidified boxCellixHUMID-BOX
Software microfluidic pumpCellixN/AVenaflux Assay
Horm CollagenTakeda/Nycomed1130630Native equine tendon collagen (type I)
Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented
HEPES buffered saline (HBS)in house preparationin house preparation10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4)
Blocking bufferin house preparationin house preparation1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS
Calcein AMMolecular probesC1430
Bleach 10%in house preparationin house preparation
0.1 M NaOHin house preparationin house preparation
Denaturated alcoholFiersT0011.5
Mirus Evo NanopumpCellix188-MIRUS-PUMP-EVOwith Multiflow8. Named in Figure S1 A as 'Pump' and 'Manifold'
MicroscopeZeissAxio Observer Z1equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera
Software microscope ZeissN/AZEN 2012
Hematology analyzerSysmexN/A
Table Top CentrifugeEppendorf521-0095
Platelet incubaterHelmerPF-48i
Incubation water bathGFL1013
PipetteBrandA03429
Tube RollerRatekBTR5-12V
Sterile docking deviceTerumo BCTTSCD
Tubing SealerTerumo BCTAC-155
VortexVWR58816-121

참고문헌

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