Microfluidic זרימה צ&#39;יימברס שימוש מחדש דם למודל המוסטאסיס ואת טסיות עירוי<em&gt; במבחנה</em

Summary

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

Abstract

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Introduction

המוסטאסיס מחייב פעילות המשולבת ומוסדר של תאים, חלבונים, יונים ורקמות בהקשר spatiotemporal הוגבל ^1. פעילות מבוקרת עלולה להוביל לדימום או פקקת ותחלואה או תמותה בתוך הספקטרום של הפרעות הקשורות לקרישת דם. ניסוי תא זרימת microfluidic הוא טכניקה מאתגרת מחקה המוסטאסיס במבחנה. גישה זו מאפשרת חקירה של יחסי הגומלין המורכבים של תהליכים להשתתף המוסטאסיס עם תפקיד מוביל עבור טסיות דם.

בעקבות פציעה של כלי דם, טסיות לדבוק מטריקס subendothelial החשוף (glyco) חלבונים על מנת למנוע אובדן דם. בעקבות הידבקות, טסיות להפעיל המצרפי בתגובה אוטומטית ואיתות paracrine אשר בסופו של דבר מוביל להיווצרות של רשת טסיות, על מנת לייצב את הפיברין וכתוצאה מכך משרד, פצע איטום פקיק ^2. בניגוד לרוב בדיקות תפקוד טסיות אחרות, התנסותמפעלים עם תאי זרימה לקחת בחשבון את הפרמטר הפיזי של זרימת הדם ולכן השפעת rheology על תאים המשתתפים ביומולקולות ^3,4.

ניסויי תא זרימה יצרו תובנות ציון דרך המוסטאסיס ופקק על ידי שינוי פרמטרים מרכזיים משפיעים (תת) עוצר דמום תהליכים, כולל מטריצה ​​הדבקה, פרופילי rheology וזרימה, הרכב הסלולר, הנוכחות של רעלים או סמים, כוח יוני ועוד רבים. בשני העשורים האחרונים, ניסויי תא זרימה נמוכה תפוקה מחייבת כרכי מדגם גדולים (10-100 מיליליטר) התפתחו תאי microfluidic לעתים קרובות מורכב של תאי לוחות מקבילים קטנים וכוללים טכנולוגיה מודרנית עבור מרוססת דם מלא בתנאי גזירת קיר מבוקרים ^5. Microscaling גדל באופן משמעותי את תפוקת assay בעיקר מפני התקנת החומרה פשטה ופחות נפח (דם) נדרש, טיוח הניסוי לנגיש יותר versatile. למשל, דם בחיות מעבדה קטנות כעת ניתן להשתמש ללא צורך להקריב בעלי חיים. דגימות דם של עכברים מהונדסים גנטית ובכך סייעו בזיהוי מולקולות מפתח קידום או עיכוב המוסטאסיס וב תובנות בסיסיות רומן ^6.

מעבדות מחקר מיוחדים לעתים קרובות עדיין להשתמש בתאי לזרום בהתאמה אישית למשל מ polydimethylsiloxane (PDMS) ⁷ כי polymerizes על תבניות lithographed אשר ניתן blueprinted ידי התוכנה. התא וכתוצאה מכך הוא זול, חד פעמי יכול להיות מפורקים בקלות לניתוח פוסט הוק. יתר על כן, בעצם כל עיצוב של כלי, bifurcations כולל או פניות חדות יכול להיבנות על פי פקודה. יתרון זה הוא גם החסרון שלה מאז סטנדרטיזציה כבר הייתה הבעיה העיקרית עם ניסויי תא זרימה, ו PDMS בהתאמה אישית בתאים לא סייעו זה. נוסף על הנושא המסוים הזה, ציפוי (תנאים), בדיקות ניאון, נוגד קרישה, טמפ 'erature והזמן בין דיגום ואנליזה כולם גרוע טופלו ^8. התקינה של משתנים אלה הוא מאתגר, אבל בכל זאת נדרש להתיר השוואה של התוצאות בין המעבדות. נושא זה הוא הנושא העיקרי של האגודה הבינלאומית על פקקת ו haemostasis ב ועדת משנה מדעי ותקינה על Biorheology ^9,10.

תרכיזים טסיות (PC) הם בעירוי בחולים הסובלים ממחלות שונות הגורמות תרומבוציטופניה ו / או דימום. אבל טסיות PC ידועה להוריד את רמת רגישות, במיוחד פונקציה של זמן אחסון ^11, תהליך הידרדרות צמוד הזדקנות המכונה גם נגע אחסון טסיות. לעתים הוא טען כי טסיות כגון לשחזר במחזור בעירוי פעם ^12, אבל הראיות לכך הוא נדיר. יתר על כן, את הפונקציונליות של טסיות ממציא מחשב אינה נבחנה שיגרתית משום שהיחסים בין מבחנים כאלהיעילות טיפולית או מניעת מחלות היא ¹³ ברור. תאי זרימה microfluidic להציע אמצעי לחקור את תפקוד הטסיות במחשב כדי לייעל את שרשרת מניפולציות בין איסוף המנפיקה. זהו כלי מחקר רב עוצמה עבור השוואה ישירה (זיווג) של המחשב כפי שפרסמנו בעבר ^14,15 והוא מתואר כאן.

Protocol

פרוטוקול זה פועל בהתאם להנחיות אתיות המוסדיות למחקר על דגימות אנושיות והסכמתם התקבלה מכל התורמים מעורבים. אישור הניסויים שתוארו כאן הושג מלוח הסקירה המוסדי של בית החולים האוניברסיטאי אנטוורפן.

הערה: סימנים טמפרטורה הם תמיד בטמפרטורת החדר, אלא אם כן צוין.

1. הגדרה קאמרית הכנת תזרים

1. Lanes הכנה, Tubing סיכות
   1. וורטקס ההשעיה קולגן במרץ לדלל 1/20 בפתרון גלוקוז איזוטוני שקיבלת מספק לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מ"ל.
      הערה: אנו משתמשים קולגן גיד סוסים, בעיקר מורכבים מסוג I סיבים. אני קולגן מסוג הסוס הוא המכונה לעתים קרובות כמו "הורם" קולגן הוא תקן הזהב עבור סוג זה של assay ⁹ הם הסטוריות כמו גם סיבות ביולוגיות. סוג האדם III קולגן יכול לשמש גם, אבל הדואר הסיבים מעיל פחות טוב והתגובה טסיות אינה כה חזקה. משטחים ציפוי אחר יכול לשמש גם, למשל פון Willebrand Factor (VWF), פיברינוגן, פיברונקטין, laminin, vitronectin, thrombospondin-1 או שילובים של אלה ^16.
   2. קח biochip הפנויה חדשה מהמכל של הספק. מידות biochips כאן הם השתמשו 0.4W x 0.1H 20L x במ"מ ^3.
   3. Pipet 0.8 μl לנתיב (ים) של biochip microfluidic על קצה אחד של השבב ולסמן כמו לשקע. ודא כי השביל מלא 5/6 עם קולגן המכיל פתרון ציפוי ערוך 1.1.1. ודא שאין בועות אוויר.
      הערה: ערוצים הם מצופים חלקית כדי למנוע הצטברות של סיבי קולגן בכניסה של הערוץ (ראה דיון).
   4. דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות או לילה במכל humidified והסגור.
   5. חסום את ערוצי מצופה ידי pipetting חסימת חיץ (1.0% (w / v) בסרום שור אלבומיןד 0.1% (w / v) גלוקוז 10 מ"מ 4- (2-hydroxyethyl) חומצה -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) שנאגרו מלוחים (HBS; 0.9% (w / v) NaCl, pH 7.4) בקצה השני ומארק כמו מפרצון. ודא כי השביל מלא לחלוטין עם למאגר חסימת הימנעות בועות אוויר.
   6. חותכים צינורות באריכות שווה (12 ס"מ). השתמש באחת לכל ליין ולהתחבר כל צינורות עם סיכה. לדוגמא, ניסוי השוואת שני תנאים, לרוץ בשני עותקים ידרוש מארבע רצועות צינורות וארבע סיכות כדי להיות מוכנות.
   7. שוטפים את צינורות עם מים מזוקקים באמצעות מזרק ומחט G 26 או המחברים המצורפים.
   8. להרוות את הצינורות עם חסימת חיץ. חנות במיכל סגור humidified למשך תקופה מינימלית של 1 שעה.
2. הכנת שאיבת יריעה
   1. יש לשטוף את המשאבה ואת סעפת עם מים מזוקקים, להסיר בועות אוויר.
   2. לשאוב למאגר החסימה לרדת מנתיב biochip (ים) באמצעות קצה 10 μl קבועים במוצא. נקה את פני השטח שלbiochip עם אבק דיוק חינם לנגב ואלכוהול מפוגל טכנולוגיה להסרת טביעות ואבק.
   3. תקן את biochip על במת מיקרוסקופ אוטומטית. אם יותר נתיב אחד משמש בו זמנית בטווח אחד, לחבר את מפצל סעפת שמונה נתיבים לשקע biochip.
      הערה: מפצל שמונת נתיבי הסעפת הוא חתיכת החומרה (איור S1) מחובר למשאבה ואת biochip. היא מאפשרת הפעלת כל הכניסה (שמונה) הנתיבים על biochip או שילוב של נתיבים אשר יכול להיות מוגדר מפעיל התוכנה הנלווית.
   4. השתמש סיכות בצינור כדי לתקן אותם כניסת biochip. מניחים את הקצה השני של הצינור (ללא פינים) במבחנה חרוטי 1.5 מ"ל מלא HBS. יש לשטוף את כל צינורות נתיבי המחוברים שלהם עם 1 מיליליטר HBS באמצעות המשאבה, כדי להסיר שארית חיץ חסימה גרועה דבקה קולגן.

2. הכנת דגימות דם

1. אוסף והפרדהדם מלא טרי מן מתנדב בריא. ¹⁷
   1. אסוף את מיליליטר דם הראשון בצינור פוניו המכיל חומצת Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) כפי קרישה ובאופן בלעדי להשתמש מדגם זה עבור ספירת דם מלאה (CBC) עם נתח המטולוגיה אוטומטית.
   2. אסוף נפח של דם בתוך קרישה מתאימה באמצעות צינורות פונו. תרופות נגד קרישת דם סטנדרט לניסויי תא זרימה הם הפרין או הירודין כאשר הפיברין היווצרות אינו חלק מפרוטוקול הניסוי ו נתרן ציטרט כאשר הוא.
      הערה: הפרין שמש נוגד קרישה לכל הניסויים שתוארו בתוצאות.
      הערה: כמות הדם תלויה במספר ניסויים להתבצע. כ 1 צינור (7 מ"ל) במשך 3 נתיבים.
   3. מניח את הצינורות על כינון מחדש דם ממתינים מסובב.
      הערה: assay אמור להסתיים בתוך 3 שעות של phlebotomy.
   4. צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 250 גרם להכין פלזמה עשירה בטסיות (PRP). אין להשתמש ההפסקה צנטריפוגות כדי למנוע הפרעה של הגלולה הארוזה בצורה רופפת.
      1. כאשר יותר מ צינור אחד נאסף, לרכז את הדם בתוך שפופרת צנטריפוגה חרוטי יחיד.
         הערה: צנטריפוגה יכול להיעשות לאט יותר או פחות זמן, בהתאם לתשואות PRP ו דיפרנציאלי תא "זיהום" עדיף.
   5. סר וזורק את PRP ומעייל באפי מניב תאי דם אדומים ארוזים עם כמה טסיות.
      הערה: ספירת הטסיות בשבריר התא האדום הארוז היא 13 ± 5 x 10 ³ לכל μl (ממוצע ± סטיית התקן, n = 12) בממוצע בידינו.
2. כינון דם
   1. קבוצת דם ההפשרה AB (רזוס D שלילי) פלזמה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ו -20 שניות לעמוד 4 מ"ל.
   2. קבע את ההמטוקריט של כדוריות הדם האדומות הארוזות ערוכות 2.1.5 באמצעות מנתח המטולוגיה אוטומטית.
   3. קבע את הריכוז של טסיות דם בבנק הדם מוכן tha תרכיז הטסיותt ישמש כדי לשקם את שבר התא האדום לעיל.
   4. חשב את נפח תאי הדם האדומים ארוז ותרכיז טסיות שיניבו 40 המטוקריט% ו -250 x 10³ טסיות / μl במדגם 1 מ"ל.
      הערה: כותרות יעד אחרות של תאים ניתן להגדיר באופן שרירותי, בהתאם לפרוטוקול המחקר.
   5. העברת ארוז כדוריות דם אדומות ופלזמה לתוך צינור טרי באמצעות קצה pipet מקוטע ולהוסיף תרכיז הטסיות עד נפח דגימה של 1 מיליליטר הוא הגיע.
      הערה: בהתאם המשתנים שנבחנו, חלק פלזמה צריך להיות שווה בכל דגימות מחדש כי יש פלזמה השפעה משמעותית על קצב היווצרות פקיק. למשל, חזר הפשרה הקפאה או פלזמה שנלקחו מתורמים שונים או על תרופות נגד קרישת דם שונים עשויים להשפיע על התוצאה.
   6. מערבבים את הדם מחדש בעדינות על ידי היפוך ולבצע CBC.
   7. כן מדגם שליטה "ריק", שבו היקף חלק טסיות מוחלףעל ידי אותו נפח של 0.9% (m / v) נתרן כלורי במים כדי לקבוע את הריכוז של טסיות אנדוגני (כלומר טסיות בנקאית בלתי דם) בדם מחדש באמצעות CBC.
3. תִיוּג
   1. Pipet 1 מ"ל מחדש דם במבחנה המכילה 1 μl 5 מ"מ Calcein AM (5 מיקרומטר הריכוז הסופי).
      הערה: צבעי תאים אחרים יכולים לשמש ^14.
   2. מערבבים בעדינות על ידי היפוך.
   3. דגירה במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.

3. Assay זלוף

1. פוקוס האובייקטיבי על סיבי הקולגן הדבקים בתחתית הנתיבים. באופן אידיאלי, להשתמש שלב בניגוד או התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) הגדרות עבור האסטרטגיה מתמקד הפעם. בחר 'גדר Z הנוכחי עבור אזורי אריח נבחרים' בתוכנת הניסוי כדי לתקן את העמדות-Z שנבחרו באופן דיגיטלי.
2. בחר אזור של עניין (ROI) בנתיב (XY) בתוכנת הניסוי של מ 'icroscope שיירשמו במהלך הניסוי.
   הערה: ROI יכול להיות כל שטח הפנים נבחר באופן שרירותי בתוך סמטה זלוף. רצוי לא לנתח היווצרות פקיק קרוב in- ו לשקע של נתיב כך כדי למנוע תופעות לוואי של פרופיל הזרימה משתנה באזור זה, גם אם זה קטן יחסית. שטח הפנים ROI צריך להכיל מספר לא מבוטל של טסיות או thrombi לאפשר פילוס של האות. בפרוטוקול זה ההחזר על ההשקעה הוא המצרפי תפור דיגיטלית של שלוש תמונות שוות בגודלן Side-by-side וכתוצאה מכך 0.62 מ"מ ² באמצע השביל 2 ס"מ.
3. מערבב את הדגימות בעדינות על ידי היפוך ולמקם הבאים אלה אל biochip על הבמה האוטומטית.
4. מניח את הצינורות שמחוברים כשהמפרצון של biochip ב המבחנות המכילות דגימות הדם מחדש.
5. הפעל את משאבת סנטימטר / 50 דיין ² (או מדגיש גזירה אחר כרצונך) לערוצים צמודים בקבוקוניםהמכיל את דגימות הדם מחדש באמצעות התוכנה של המשאבה.
   הערה: מאמצי גזירה אחרים יכולים לשמש.
6. תמונות שיא כל 15 שניות למשך 5 דקות בזמן אמת באמצעות תוכנת הרכישה ולהתנסות של המיקרוסקופ.
   הערה: סדרות עתיות אחרות יכולות לשמש תלוי ניסוי ההגדרה.
   הערה: אנו משתמשים בדרך כלל בהגדלת 100X (אובייקטיבי 10X ו 10X עדשות), אך גבוהה (או נמוכה) גדלה יכולה לשמש בקלות כחלופה.

4. יש לשטוף היטב את

1. יש לשטוף היטב את כל הצינורות מחוברים לשקע ומחובר הסעפת הרבה או משאבת שימוש במים מזוקקים, ואחריו חומצת נתרן (אקונומיקה) 0.5% (v / v) ולבסוף 0.1 M NaOH במים. מחק את הצינורות מוצמדים כניסת biochip כפסולת מסוכנת.

ניתוח 5. נתונים

1. לקבוע קינטיקה צמיחה פקיק עם תוכנת ניתוח התמונה. הפקודות הבאות הן ספציפיות עבור ZEN2012.
   1. פתח את ניתוח תמונת תוסף כדי לקבוע את כיסוי השטח של טסיות.
   2. הגדר את סף הקרינה על כרטיסיית ניתוח אינטראקטיבית כדי להגדיר את עוצמת פיקסל כי בקורלציה עם איתות חיובית, כלומר טסיות דבקה או טסיות דבקות.
   3. השתמש צור שולחנות ליצור גיליון אלקטרוני באופן אוטומטי שיכיל את פני שטחים הנפרדים (ב מיקרומטר ²⁾ של אלה "אובייקטים" המכילים פיקסלים עם אות בין הספים שנבחרו. זה מבוצע עבור כל נקודת זמן.
      הערה: לאחר ספי קרינה כבר בחרו, תוכנת הניתוח מזהה אוטומטית 'חפצים' בשדה הנוף אשר עונים על הקריטריונים. אובייקטים אלה הם thrombi, אגרגטים טסיות קטנים או טסיות אחת ולכסות מספר פיקסלים. כל אובייקט מופיע בגיליון האלקטרוני בנפרד.
   4. שמור לגיליונות אלו בפורמט XML ולפתוח אותם בתוכנית גיליון אלקטרוניעבור חישובים נוספים.
   5. תחומים סה"כ השטח של האובייקטים שנבחרו על ידי סיכום ולחלק את התוצאה על ידי השטח הכולל של השדה המדיד (מיקרומטר ^2). זה יניב את כיסוי שטח היחסי (%). האם כך עבור כל נקודת זמן.
   6. מגרש כיסויי משטח אלה בתפקוד של זמן זלוף לחשב את השיפוע על ידי רגרסיה ליניארית, מניב את הקינטית הצמיחה פקיק של מצב מסוים.

תוצאות

כדי להדגים וריאצית תוך assay, שלוש דגימות דם כולו זהות מחדש היו perfused זמנית מעל משטחים מצופים קולגן (איור 1). זה הביא מקדם השונה של 8.7%. נתון זה מצביע על וריאצית תוך assay מקובל intralaboratory המתיר השוואה מהימנה בין דגימות קשורות.

Discussion

ניסויי תא זרימת microfluidic הם כלים מצוינים כדי לחקור את תפקוד הטסיות ב זורם דם משמשים כדי להעריך המוסטאסיס במבחנה בהקשרי ניסיוני. למרות סטנדרטיזציה עני מעבדתיות ^9, אנו מראים כי בתוך המעבדה שלנו וריאצית ניסיוני מקובל. זה מאפשר להשוות באופן מהימן (זיווג) דגימות ב...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD vacutainer tube with EDTA	Becton, Dickinson and Company	368856
BD vacutainer tube with Heparin	Becton, Dickinson and Company	368480
BD vacutainer tube with Sodium Citrate	Becton, Dickinson and Company	366575
Hirudin Blood tube	Roche	6675751 001
BD vacutainer Eclipse	Becton, Dickinson and Company	368650	Blood collection needle with preattached holder
Pipette tips 100-1,000	Greiner bio-one	740290
Pipette tips 2-200	Greiner bio-one	739280
Pipette tips 1-10	Eppendorf	A08928
Tube 5 ml	Simport	11691380
Conical tube 15 ml	Greiner bio-one	1888271
Conical tube 50 ml	Greiner bio-one	227261
10 ml Syringe	BD	309604
Precision wipes	Kimtech	5511
Vena8 Fluoro+ Biochips	Cellix	188V8CF-400-100-02P10	Named in Figure S1 A as 'Biochip'
Vena8 Tubing	Cellix	TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F	Named in Figure S1 B as 'Disposable tubing'
Vena8 Needles	Cellix	SS-P-B1IC-B1OC-PACK200	Named in Figure S1 B as 'Pin'
Connectors for single inlet cables of biochips	Cellix	CONNECTORS-B1IC-PACK100
Multiflow8 connect	Cellix	MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS	Named in Figure S1 B as 'Reusable tubing' and 'Splitter'
Humidified box	Cellix	HUMID-BOX
Software microfluidic pump	Cellix	N/A	Venaflux Assay
Horm Collagen	Takeda/Nycomed	1130630	Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented
HEPES buffered saline (HBS)	in house preparation	in house preparation	10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4)
Blocking buffer	in house preparation	in house preparation	1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS
Calcein AM	Molecular probes	C1430
Bleach 10%	in house preparation	in house preparation
0.1 M NaOH	in house preparation	in house preparation
Denaturated alcohol	Fiers	T0011.5
Mirus Evo Nanopump	Cellix	188-MIRUS-PUMP-EVO	with Multiflow8. Named in Figure S1 A as 'Pump' and 'Manifold'
Microscope	Zeiss	Axio Observer Z1	equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera
Software microscope	Zeiss	N/A	ZEN 2012
Hematology analyzer	Sysmex	N/A
Table Top Centrifuge	Eppendorf	521-0095
Platelet incubater	Helmer	PF-48i
Incubation water bath	GFL	1013
Pipette	Brand	A03429
Tube Roller	Ratek	BTR5-12V
Sterile docking device	Terumo BCT	TSCD
Tubing Sealer	Terumo BCT	AC-155
Vortex	VWR	58816-121