Un modelo de ratón ortotópico de cáncer de mama metástasis espontánea

Resumen

Un modelo de tumor primario de cáncer de mama ortotópico y la extirpación quirúrgica del tumor primario para extender la vida del ratón para generar metástasis espontánea se describen. El crecimiento del tumor y la progresión se supervisan y se cuantificaron por imágenes de fluorescencia de la luciferasa.

Resumen

La metástasis es la causa principal de mortalidad de los pacientes de cáncer de mama. El mecanismo que subyace a la metástasis de células de cáncer, incluyendo la metástasis del cáncer de mama, es en gran parte desconocida y es un foco en la investigación del cáncer. Se han establecido varios modelos de cáncer de mama espontáneos metástasis del ratón. Aquí, se presenta un procedimiento simplificado para establecer tumor primario del cáncer de mama y trasplantado ortotópico resultante metástasis espontánea que imitan la metástasis del cáncer de mama humano. En combinación con la formación de imágenes del tumor en vivo bioluminiscencia, este modelo de ratón permite el crecimiento del tumor y la cinética de progresión a controlar y cuantificados. En este modelo, se inyectó una dosis baja (1 x 10 ⁴ células) de las células de cáncer de mama 4T1-Luc en / c de mama de ratón BALB almohadilla de grasa usando una jeringa de tuberculina. Los ratones fueron inyectados con luciferina y la imagen en varios puntos de tiempo utilizando un sistema de imagen bioluminiscente. Cuando los tumores primarios crecieron hasta el límite de tamaño como en el protocolo aprobado por el IACUC (aproximately 30 días), los ratones fueron anestesiados bajo flujo constante de 2% de isoflurano y oxígeno. El área del tumor fue esterilizada con 70% de etanol. La piel del ratón alrededor del tumor se extirpó para exponer el tumor que se retiró con un par de tijeras estériles. La eliminación del tumor primario se extiende la supervivencia de los ratones portadores de tumor 4T-1 durante un mes. Los ratones fueron entonces repetidamente con imagen formada por tumor metastásico propagación a órganos distantes. Los agentes terapéuticos pueden ser administrados para suprimir la metástasis tumoral en este punto. Este modelo es simple y, sin embargo sensible para cuantificar el crecimiento de células de cáncer de mama en el sitio primario y la cinética de la progresión a órganos distantes, y por lo tanto es un excelente modelo para estudiar el crecimiento del cáncer de mama y la progresión, y para el ensayo de agentes anti-metástasis terapéuticos y inmunoterapéuticos in vivo .

Introducción

Según la Sociedad Americana del Cáncer, el cáncer de mama es la forma más frecuentemente diagnosticado de cáncer en mujeres en los Estados Unidos. La detección temprana en combinación con terapias dirigidas se han desarrollado recientemente ha reducido significativamente la mortalidad de cáncer de mama en las dos últimas décadas. Sin embargo, el cáncer de mama sigue siendo la segunda causa principal de muerte por cáncer en mujeres en los Estados Unidos ^1. La mayoría de las muertes de pacientes con cáncer de mama se deben a metástasis de células tumorales. Desafortunadamente, la mayoría de cáncer de mama es invasivo y frecuentemente metástasis en el ganglio linfático y, posteriormente, a órganos distantes, incluyendo el hueso, pulmón, hígado y cerebro. ^1,2 no hay actualmente ningún tratamiento eficaz para el cáncer de mama metastásico. Por lo tanto, el desarrollo de agentes quimioterapéuticos y inmunoterapéuticos para suprimir el cáncer de mama metastásico es de gran importancia.

cáncer de mama Varios modelos de metástasis espontánea de ratón han been desarrollado para estudiar los mecanismos moleculares que subyacen a la progresión de las células tumorales de mama y metástasis y para ser utilizados como modelos para el desarrollo de agentes terapéuticos. ^1,3-5 Sin embargo, la mayoría de estos modelos de ratón son modelos de tumores genéticos que, mientras excelentes modelos para mecanicista estudios, no son adecuados para el ensayo de agentes terapéuticos desde la metástasis toma meses para desarrollar en estos modelos genéticos, requiriendo por lo tanto la administración costosa a largo plazo de los agentes anti-cáncer. progresión tumoral ^6,7 Monitoring en ratones vivos también es técnicamente difícil. Por el contrario, un modelo de metástasis de cáncer de mama trasplantado tiene las ventajas de la progresión del tumor a corto plazo y fácil de seguimiento de la progresión tumoral en ratones vivos. El modelo de ratón de metástasis espontánea 4T1 ortotópico de cáncer de mama es un modelo de tumor trasplantado tales. ⁸ En este modelo, las células de tumor de mama se trasplantan en la almohadilla de grasa mamaria de establecer nódulos tumorales primarios. El tumor primarioa continuación, se pueden extirpar quirúrgicamente como en pacientes con cáncer de mama humano. 4T1 células tumorales son altamente invasivos. ^{8,9, 3,10} Casi todos los portadores de tumores desarrollan metástasis en ratones 30 días después del trasplante del tumor en la almohadilla de grasa mamaria. Sin embargo, los tumores 4T1 crecer agresivamente en los sitios primarios y los tamaños de los tumores a menudo exceden los límites que se permiten en la mayoría de los animales protocolos. En esta etapa, las metástasis son a menudo micrometástasis. Por lo tanto, es esencial para eliminar los tumores primarios para permitir el progreso metástasis para el ensayo de agentes terapéuticos. Aquí, se presenta el establecimiento de un procedimiento simple y sin embargo sensible de trasplante de tumor primario, la extirpación quirúrgica del tumor primario y la bioluminiscencia cuantificación basada en imágenes del crecimiento tumoral y la progresión 4T1 in vivo.

Protocolo

Todos los procedimientos siguen las pautas y protocolos aprobados por la Universidad de Georgia Regents Uso de Animales y el Comité de Cuidado.

1. Establecimiento de un tumor ortotópico de cáncer de mama

1. Un día antes del experimento, la cultura de aproximadamente 2 x 10 ⁶ células tumorales 4T1-Luc en una placa de cultivo de 10 cm en 10 ml de medio RPMI que contiene 10% de FBS. Incubar la placa de cultivo en un incubador _{de CO2} a 37 ° C y 5% de _CO2.
2. En el día de la inyección de células tumorales, eliminar medio de cultivo de la placa de cultivo con vacío, añadir 5 ml de fosfato estéril (PBS), pH 7,4 a la placa de cultivo, y agitar suavemente el plato para lavar la superficie de cultivo, eliminar el PBS por el vacío.
3. Añadir 2 ml de tripsina-EDTA (0,05% de tripsina y EDTA 0,53 mM) a la placa de cultivo, se incuba en el incubador de _CO2 a 37 ° C durante aproximadamente 5 min. Consultar las células en un microscopio invertido para asegurarse de que todas las células se separan de la parte inferior de la placa de cultivo.
4. Se inactiva la tripsina mediante la adición de 8 ml de medio que contiene suero, las células de transferencia a un tubo cónico de 15 ml y centrifugar las células a aproximadamente 450 xg durante 3 min a TA.
5. Eliminar el sobrenadante por las células de vacío y volver a suspender en 10 ml de PBS. centrifugar las células a aproximadamente 450 xg durante 3 min. Eliminar el sobrenadante por vacío, y volver a suspender las células en 10 ml de PBS.
6. Pipeta de 10 l de la suspensión celular en un hemocitómetro bajo la cubierta de vidrio. Contar las células para determinar la concentración de células. Resuspender las células en PBS a una densidad de 2 x 10 ⁵ células / ml de HBSS. Transferir las células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril y mantener las células en hielo hasta su uso.
7. Utilice hembra BALB / c ratones de 6 a 8 semanas para inyección de células tumorales.
   1. Afeitarse el vello cerca que rodea el pezón # 3 usando un cortador de pelo electrónico. La inyección de células 4T1 en la almohadilla de grasa mamaria glándula 3 genera de forma reproducible la metástasis de pulmón. Limpiar la zona afeitada utilizando el bastoncillo de algodón humedecido en un 70% etanol. Resuspender las células invirtiendo el tubo de microcentrífuga de 2 - 3 veces. Suavemente aspirado de 50 l de suspensión de células en un CC ½ 27 G 1/2 jeringa de tuberculina.
   2. Inyectar las células tumorales en la almohadilla de grasa mamaria bajo el # 3 de la glándula mamaria de un ratón BALB / c. Coloque el ratón en una jaula limpia y volver a la jaula para instalación de alojamiento de los animales. Espere aproximadamente 21 - 30 días para el desarrollo del tumor. El crecimiento del tumor se debe supervisar de forma regular de acuerdo con las políticas de la institución para estudios de tumores.

2. vivo Ratón La bioluminiscencia de imágenes del crecimiento tumoral

1. ratones imagen cada 3 días después de la inyección de los ratones de transferencia del tumor a la facilidad de formación de imágenes. Inyectar 100 luciferina l (30 mg / ml en PBS) por vía intraperitoneal (ip) a ratones antes de la imagen. Después de aproximadamente 10 min, anestesiar los ratones en una cámara de inducción con 2% O flujo de isoflurano / _2. Utilice las pinzas para tocar la pierna del ratón. No hay respuesta al tacto confirma that el ratón es totalmente inconsciente.
   1. Coloque los ratones en la cámara de formación de imágenes con continua isoflurano 2% y O ₂ a un caudal de 2 L / min. Coloque el ratón de tal manera que el área de interés (es decir, la almohadilla mamaria de la inyección inicial del tumor) se enfrenta a la cámara del sistema de imagen. Asegúrese de que la nariz y la boca del ratón se fijan firmemente dentro del tubo de anestesia. Los animales deben ser anestesiados por las normas veterinarias en la institución.
2. Adquirir imágenes de bioluminiscencia con una variedad de diferentes tiempos de exposición. Por ejemplo, ajustar la exposición a 30, campo de visión (FOV) de 25, altura del objeto a 1,5 cm, y obtener imágenes fotográficas luminiscentes con bajo poder de rayos X. Establecer las unidades de medida de "luminosidad".
   1. Utilice una gama de color lineal automática con un máximo de aproximadamente 10 unidades de 2,4 x ⁷ resplandor. Después de la adquisición de las imágenes iniciales, ajustar la configuración y obtener una imagen optimizada (Figuras 3 y 4).
3. Devolver los ratones para limpiar las jaulas y garanticen los ratones a recuperar la consciencia con la deambulación antes de devolver los animales a las instalaciones de la vivienda.
4. Analizar los datos con el software de imagen de estar asociado con el instrumento de imagen. El uso de un programa de imágenes, trazar una línea cerrada alrededor de la región de interés (ROI). Utilice el software de imagen para determinar la intensidad de la radiación de la ROI. Registrar las intensidades relativas de cada ROI para cada ratón.
   NOTA: radiancia intensidades más altas indican mayores niveles de células luminiscentes, y por lo tanto un mayor crecimiento tumoral.
5. examinar visualmente el ratón cada 3 días para los efectos adversos.
   NOTA: Los ratones se pesaron una vez por semana. Una pérdida de peso de peso corporal 15% se considera efecto adverso y los ratones portadores de tumores se practicó la eutanasia como se describe en el paso también se sometieron a eutanasia 5. Los ratones con tumores ulcerados.

3. extirpación quirúrgica de tumores primarios

NOTE: tijeras, pinzas de autoclave y los clips de la herida y la herida de aplicación de grapas (Figura 1).

1. Realizar la cirugía en una campana estéril para mantener una condición estéril para reducir el riesgo de infección. Un día antes de la cirugía, se afeita el área que rodea los tumores de los ratones portadores de tumores con un cortador de pelo eléctrico.
2. Aproximadamente de 2 - 4 horas antes de la cirugía, a alimentar a los ratones tabletas masticables formuladas carprofeno para los ratones a una dosis de 5 mg / kg peso corporal.
3. Poner los ratones en una cámara que contiene 2% de isoflurano en oxígeno de aproximadamente el 30 seg. Continuamente anestesiar el ratón utilizando un aparato de anestesia durante todo el período quirúrgico.
4. Utilice un palillo de algodón estéril para aplicar el ungüento veterinario para los ojos del ratón para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia. Utilice las pinzas para tocar la pierna del ratón. No hay respuesta al tacto confirma que el ratón es totalmente inconsciente.
5. Desinfectar el área de la piel alrededor del sitio del tumor con tres alternatoallitas de un exfoliante jabón desinfectante. Limpie el área quirúrgica con un 70% de alcohol limpie.
6. Utilice un bisturí esterilizado (Figura 1) para cortar una pequeña incisión cerca del tumor.
7. Inserte la punta de un par de tijeras esterilizadas a la incisión para cortar la piel alrededor del tumor para exponer el nódulo tumoral (Figura 2A). Mantenga el tumor con pinzas estériles y utilizar las tijeras para separar el tumor de la piel (figura 2B). Guardar la muestra de tumor por congelación en un congelador a -80ºC o mediante la fijación en solución de formalina al 10% para uso futuro.
8. Cerrar el sitio quirúrgico con 9 mm clips de la herida utilizando el aplicador de auto-clip (Figura 1). Devolver el ratón a una jaula limpia con ropa de cama en autoclave. Los animales deben ser controlados por las directrices institucionales.
   NOTA: El ratón usualmente recupera la conciencia suficiente y comienza a moverse en la jaula de aproximadamente el 10 - 30 minutos después de la cirugía.
9. Administrar carprofeno alos ratones de nuevo 24 horas después de la cirugía. El carprofeno es para la analgesia post-cirugía y la prescripción de la analgesia post-cirugía debe ser verificada mediante la consulta directa con el personal veterinario de la institución. Retire los clips de la herida después de la herida se cura (por lo general dentro de los 5 - 7 días después de la cirugía). Retire los clips de la herida utilizando el removedor de auto-clip.

4. vivo Ratón La bioluminiscencia de imágenes de la metástasis tumoral

1. ratones imagen cada 3 días después de la cirugía tal como se describe en el paso 2.

5. Validación de metástasis pulmonares con tinta china La inflación de los pulmones portadores del tumor

NOTA: Para validar los resultados de las imágenes en vivo de tumores luciferasa, realice la India la inflación de la tinta de los pulmones del ratón portador de un tumor para cuantificar los nódulos tumorales. Células 4T1 también metástasis a otros órganos y tejidos (Figura 5) y por lo tanto, el examen histológico de estos órganos para validar la metástasis del tumor debe realizarse si es necesario. Este uso del protocolo LUNg metástasis como un ejemplo.

1. Mantener los ratones en sus jaulas existentes para la eutanasia. Cuando alojados con otros animales, reubicar los ratones no ser sacrificados a una jaula diferente.
2. Retire la tapa del filtro y vuelva a colocar la jaula con la parte superior del filtro _{de CO2.} Encienda el cilindro comprimido CO ₂ de gas (100%) que está conectado a la parte superior del filtro CO _2. Ajuste el caudal a 2 l / min y mantener CO ₂ durante al menos 10 minutos. Si los ratones siguen respirando al final de 10 minutos, dejar el CO ₂ de hasta por lo menos 1 minuto después de los ratones dejan de respirar. Desactivar el control de cilindros _{de CO2} y el medidor de flujo. Esperar 3 minutos más y retirar la tapa del filtro.
3. Coloque el ratón sacrificado en su parte posterior en una placa de poliestireno. Fijar las piernas para garantizar el acceso sin obstáculos a la tráquea. Rociar los ratones con 70% de etanol.
4. Con un par de tijeras, corte a lo largo de la línea media de la mitad del abdomen del ratón a través de la caja torácica y arriba hacia la salivariar glándulas. Observar la tráquea. El uso de fórceps para retirar tejidos que rodean la tráquea para exponer la tráquea.
5. Enhebrar una punta de la pipeta por debajo de la tráquea. Sujetando la punta con una mano, levante suavemente la tráquea hacia arriba y lejos del cuerpo.
6. Girar la plataforma que sostiene el ratón 180 °. Utilice un CC ½ 27 G 1/2 jeringa de tuberculina para inyectar tinta de la India (10% tinta china y 0,1% hidróxido de amonio) a los pulmones a través de la tráquea. Completamente inflar los pulmones con tinta hasta que se sintió una fuerte resistencia.
7. Use un par de tijeras para cortar la tráquea. El uso de fórceps para sostener el ratón e insertar otro juego de pinzas debajo de los pulmones y tirar de los lóbulos del pulmón de ratón. Enjuague el breve pulmones en un vaso que contiene agua.
8. En una campana de humos química, la transferencia de los pulmones a un vial de centelleo de vidrio que contiene 3 ml de solución de Fekete (50% de etanol, 6% de formaldehído y ácido acético glacial 3%). Se tapa el vial para evitar que la solución se evapore.
   NOTA: Los tejidos se pueden almacenar en la solución de Fekete indefinidamente.
9. Después de unos minutos, observar nódulos tumorales como puntos blancos en los pulmones negros (Figura 5). El nódulo tumoral blanco es visible por los ojos. La transferencia de los pulmones a un plato en una campana de humos y contar el número de manchas blancas. Cada mancha blanca representa un solo nódulo tumoral metastásico.

Resultados

Establecimiento de mama Cáncer de ratón modelo ortotópico
4T1 es una línea celular de carcinoma de mama agresivo. La inyección de tan poco como 1 x 10 ⁴ células en la almohadilla de grasa mamaria puede conducir a la creación de un solo nódulo tumoral en el sitio de la inyección (Figura 2A). Por lo tanto, el tumor imita carcinoma de mama primario humano. Casi el 100% ratones desarrollan el tumor ortotópico. El tamaño del tumor...

Discusión

Se han desarrollado muchos tipos de modelos de ratones transgénicos de la metástasis del cáncer de mama. ¹ Estos ratones transgénicos tienen alta incidencia de tumor que van desde 60 a 100%. Sin embargo, la incidencia de metástasis de estos ratones transgénicos es mucho menor que la incidencia de tumores (14-100%). Las células tumorales metastatizan a LN y los pulmones en la mayoría de estos modelos de ratones transgénicos de la metástasis del cáncer de mama. La latencia metástasis varía de un mo...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ami-X Imaging System	Spectral Instruments Imaging Inc. Tucson, AZ
IsoTec SurgiVet	Anesthesia Service & Equipment , Inc., Atlanta, GA
AutoClip Physicians Kit	Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD	427638
9 mm AutoClip Applier	Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD	427630
9 mm AutoClip Remover	Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD	427637
9 mm AutoClip Wound Clip	Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD	427631
Sharp-Pointed Dissecting Scissors	Fisher	8940
Dissecting Fine-Pointed Forceps	Fisher	8875
1/2 CC 27 G 1/2 tuberculin syringe	Becton Dickinson and Co. NJ	305620
RPMI 1640 medium	Mediatech Inc	10-040-CV
PBS	Mediatech Inc	21-040-CV
70% Ethanol	Ultrapure-usa.com
Trypsin-EDTA	Mediatech Inc	25-040-CI