Ein orthotopen Mausmodell des Spontan Metastasierung von Brustkrebs

Zusammenfassung

Eine orthotope Brustkrebs primären Tumormodell und die operative Entfernung des Primärtumors Maus Lebensdauer zu verlängern spontane Metastasierung zu erzeugen, werden beschrieben. Das Tumorwachstum und Progression werden überwacht und durch Luciferase Fluoreszenzbildgebung quantifiziert.

Zusammenfassung

Metastasierung ist die Hauptursache für die Sterblichkeit von Brustkrebspatientinnen. Der Mechanismus Metastasierung von Krebszellen zugrunde liegen, einschließlich Brustkrebs Metastasen, ist weitgehend unbekannt und ist ein Schwerpunkt in der Krebsforschung. Verschiedene Brustkrebs spontane Metastasierung Mausmodelle etabliert. Hier berichten wir über ein vereinfachtes Verfahren zu etablieren orthotoper transplantiert Brustkrebs Primärtumor und spontane Metastasierung daraus resultierenden, die menschliche Brustkrebs-Metastasen zu imitieren. In Kombination mit der Biolumineszenz lebenden Tumorbildgebung, ermöglicht diese Maus-Modell das Tumorwachstum und Progression Kinetik beobachtet und quantifiziert werden. In diesem Modell wird eine niedrige Dosis (1 x 10 ⁴ Zellen) von 4T1-Luc Zellen Brustkrebs wurde in Balb / c - Maus Brustfettpolster injiziert , um eine Tuberkulin - Spritze. Mäuse wurden mit Luciferin und abgebildet zu verschiedenen Zeitpunkten unter Verwendung eines Biolumineszenz-Bilderzeugungssystem injiziert. Wenn wuchsen die Primärtumoren auf die Größenbeschränkung, wie im IACUC genehmigten Protokoll (ca.oximately 30 Tage), wurden die Mäuse unter konstanten Strom von 2% Isofluran und Sauerstoff anästhesiert. Die Tumorfläche wurde mit 70% Ethanol sterilisiert. Die Maus Haut um wurde der Tumor herausgeschnitten den Tumor aus, die mit einem Paar von sterilen Schere entfernt wurde. Entfernung des Primärtumors erstreckt sich das Überleben der 4T-1 tumortragenden Mäuse für einen Monat. Die Mäuse wurden dann wiederholt für metastasierenden Tumor abgebildet auf andere Organe ausbreiten. Therapeutische Mittel können verabreicht werden, um Tumormetastasierung an diesem Punkt zu unterdrücken. Dieses Modell ist einfach und doch empfindlich bei der Quantifizierung Brustkrebszellwachstum in der primären Standort und Progression Kinetik zu entfernten Organen und somit ist ein ausgezeichnetes Modell Brustkrebs Wachstum und die Progression für das Studium und zur Prüfung von anti-Metastasierungs und Immuntherapeutika in vivo .

Einleitung

Nach Angaben der American Cancer Society ist Brustkrebs die am häufigsten diagnostizierte Form von Krebs bei Frauen in den Vereinigten Staaten. Früherkennung in Kombination mit neu entwickelten zielgerichtete Therapien hat sich deutlich die Mortalität von Brustkrebs in den letzten zwei Jahrzehnten reduziert. Allerdings ist Brustkrebs immer noch die zweithäufigste Ursache für krebsbedingte Todesursache bei Frauen in den Vereinigten Staaten von Amerika ^1. Die Mehrheit der Todesfälle von Brustkrebspatienten sind aufgrund Metastasierung von Tumorzellen. Leider ist den meisten Brustkrebs - invasive und metastasiert häufig zu den Lymphknoten und in der Folge auf andere Organe, einschließlich Knochen, Lunge, Leber und Gehirn. ^1,2 Es gibt derzeit keine wirksame Therapie bei metastasierendem Brustkrebs. Daher ist die Entwicklung von Mitteln, chemotherapeutischen und immun metastasierendem Brustkrebs zu unterdrücken, von großer Bedeutung ist.

Verschiedene Brustkrebs spontane Metastasierung Mausmodelle haben been entwickelt , um die molekularen Mechanismen zu studieren , Brusttumorzellprogression und Metastasierung zugrunde liegen und als Modell für die Entwicklung von Therapeutika eingesetzt werden. ^1,3-5 jedoch die meisten dieser Mausmodelle genetischen Tumormodelle sind , dass, während eine ausgezeichnete Modelle für mechanistische Studien zum testen therapeutischer Mittel nicht geeignet , da die Metastasierung Monate in dieser genetischen Modellen zu entwickeln , nimmt, wodurch es erforderlich teure Mittel langfristige Verabreichung der Anti-Krebs. ^6,7 Überwachung der Tumorprogression in lebenden Mäusen ist auch technisch anspruchsvoll . Im Gegensatz dazu hat ein transplantiertes Brustkrebsmetastase Modell die Vorteile der kurzfristigen Tumorprogression und einfache Verfolgung der Tumorprogression in lebenden Mäusen. Die 4T1 orthotoper Brustkrebs spontane Metastasierung Maus - Modell ist ein solcher transplantierten Tumormodell. ⁸ In diesem Modell werden die Brusttumorzellen in das Brustfettpolster transplantiert primären Tumorknoten aufzubauen. Der Primärtumorkann dann chirurgisch als in menschlichen Brustkrebspatienten entfernt werden. 4T1 - Tumorzellen sind sehr invasiv. ^{8,9, 3,10} Fast alle tumortragenden Mäuse Metastasen in 30 Tage nach der Tumortransplantation in das Brustfettpolster entwickeln. Allerdings wachsen 4T1 Tumore aggressiv in den primären Standorten und die Tumorgrößen überschreiten oft die Grenzen, die in den meisten Tier Protokolle sind erlaubt. In diesem Stadium sind die Metastasen oft Mikrometastasen. Daher ist es wesentlich, Primärtumoren zu entfernen Metastasierung Fortschritt zum Testen therapeutischer Mittel zu ermöglichen. Hier berichten wir über die Einrichtung eines einfachen und doch empfindliches Verfahren der primären Tumortransplantation, chirurgische Entfernung des Primärtumors und Biolumineszenz - Bildgebung basierenden Quantifizierung des 4T1 Tumorwachstum und Progression in vivo.

Protokoll

Alle Verfahren folgen Richtlinien und genehmigten Protokollen von Georgia Regents Universität Tier Benutzung und Pflege Committee.

1. Einrichtung Orthotopische Brustkrebs-Tumor

1. Einen Tag vor dem Experiment Kultur etwa 2 x 10 ⁶ 4T1-Luc Tumorzellen in einer 10 cm Kulturschale in 10 ml RPMI - Medium mit 10% FBS. Inkubieren der Kulturschale in einem CO ₂ -Inkubator bei 37 ° C und 5% CO _2.
2. Am Tag der Injektion Zelltumor, Kulturmedium aus der Kulturschale mit Vakuum, 5 ml steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), pH 7,4, in die Kulturschale entfernen und sanft die Schale schütteln Sie die Kulturoberfläche zu waschen, entfernen Sie die PBS durch Vakuum.
3. 2 ml Trypsin-EDTA (0,05% Trypsin und 0,53 mM EDTA) in die Kulturschale, inkubieren es in den CO ₂ -Inkubator bei 37 ° C für ca. 5 min. Überprüfen Sie Zellen auf einem inversen Mikroskop, um sicherzustellen, dass alle Zellen vom Boden der Kulturschale abgelöst werden.
4. Quenche die Trypsin durch Zugabe von 8 ml serumhaltigem Medium, Übertragungszellen in ein 15-ml konischen Röhrchen und zentrifugiere die Zellen bei etwa 450 × g für 3 min bei RT.
5. Entfernen Sie den Überstand durch Vakuum und resuspendieren Zellen in 10 ml PBS. Centrifuge Zellen bei etwa 450 × g für 3 min. Entfernen Sie den Überstand durch Vakuum und resuspendieren Zellen in 10 ml PBS.
6. Je 10 ul der Zellsuspension auf einem Hämozytometer unter dem Deckglas. Zählen Sie die Zellen, die die Zellkonzentration zu bestimmen. Die Zellen in PBS in einer Dichte von 2 x 10 ⁵ Zellen / ml HBSS. Übertragungszellen in ein 1,5 ml sterile Mikrozentrifugenröhrchen und halten Zellen auf Eis bis zur Verwendung.
7. Verwenden weibliche BALB / c-Mäusen von 6 - 8 Woche, der Tumorzellinjektion.
   1. Shave Haar in der Nähe von umliegenden Nippel # 3 mit Hilfe eines elektronischen Haarschneider. Die Injektion von 4T1-Zelle in der Brustdrüse 3 Fettpolster erzeugt reproduzierbar Lungenmetastasen. Reinigen Sie die rasierte Fläche durch den Wattestäbchen eingetaucht in 70% Ethanobrückenl. Resuspendieren Zellen durch das Reaktionsgefäß 2 Umkehren - 3 mal. Vorsichtig absaugen 50 ul Zellsuspension in eine ½ CC 27 G 1/2 Tuberculinspritze.
   2. Injizieren der Tumorzellen in das Brustfettpolster unter # 3 Brustdrüse einer BALB / c-Maus. Platzieren Sie die Maus in einem sauberen Käfig und zurück um den Käfig zu Tierhaltungsmöglichkeiten. Warten Sie ca. 21 - 30 Tage Tumorentwicklung. Das Tumorwachstum sollte pro Institution der Politik für die Tumorstudien in regelmäßigen Abständen überwacht werden.

2. Live-Maus-Biolumineszenz-Bildgebung des Tumorwachstums

1. Bild Mäuse alle 3 Tage nach der Tumorinjektion Übertragung Mäuse auf die Abbildungsmöglichkeiten. Injizieren von 100 ul Luciferin (30 mg / ml in PBS) intraperitoneal (ip) an Mäuse vor der Bebilderung. Nach ca. 10 min, betäuben Mäuse in einer Induktionskammer mit 2% Isofluran / O ₂ fließen. Verwenden Sie die Zange um das Bein der Maus zu berühren. Keine Antwort auf die Note bestätigt that der Maus ist vollständig bewusstlos.
   1. Platzieren Sie die Mäuse in der Abbildungskammer mit kontinuierlichem 2% Isofluran und O ₂ mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 L / min. Platzieren Sie die Maus so , dass der Bereich von Interesse (dh das Brustkissen der anfänglichen Tumorinjektion) -Flächen der Kamera des Bilderzeugungssystems. Achten Sie darauf, die Nase und den Mund der Maus innerhalb des Narkoseschlauches fest eingestellt. Die Tiere sollten in der Einrichtung pro Veterinärnormen narkotisiert werden.
2. Erwerben Biolumineszenz-Bildgebung mit einer Reihe von verschiedenen Belichtungszeit. Zum Beispiel die Belichtung einzustellen bis 30, Sichtfeld (FOV) bis 25, Objekthöhe bis 1,5 cm und Leuchtfotografische Bilder mit geringer Leistung Röntgen erhalten. Stellen Sie die Maßeinheiten auf "Ausstrahlung."
   1. Verwenden Sie eine automatische lineare Farbbereich mit einem Maximum von etwa 2,4 x 10 ⁷ Glanz - Einheiten. Nach dem anfänglichen Erfassen von Bildern, Einstellungen anpassen und erhalten eine optimierte Bild (Abbildungs 3 & 4).
3. Zurück Mäuse Käfige zu reinigen und zu gewährleisten Mäuse Bewusstsein mit Gehfähigkeit wieder vor, die Tiere zu dem Gehäuse Anlage zurück.
4. Analysieren von Daten mit dem lebenden Imaging-Software mit dem Abbildungsinstrument verbunden. Mit einem Bildbearbeitungsprogramm, ziehen eine geschlossene Linie um die Region von Interesse (ROI). Verwenden Sie die Bildbearbeitungssoftware die Ausstrahlung Intensität des ROI zu bestimmen. Notieren Sie sich die relativen Intensitäten der einzelnen ROI für jede Maus.
   Hinweis: Eine höhere Leuchtkraft Intensitäten ein höheres Maß an Leucht Zellen zeigen und damit eine höhere Tumorwachstum.
5. Optisch prüfen Sie die Maus alle 3 Tage für Nebenwirkungen.
   HINWEIS: Die Mäuse werden einmal wöchentlich gewogen werden. Ein Gewichtsverlust von 15% des Körpergewichts wird nachteilige Wirkung und die tumortragenden Mäuse, wie in Schritt 5 Mäuse mit Tumoren ulzerierten auch euthanasiert werden beschrieben euthanasiert werden berücksichtigt werden.

3. Chirurgische Entfernung des Primärtumors

NEINTE: Autoklav Scheren, Zangen und die Wundklammern und Wundklammeranlegevorrichtung (Abbildung 1).

1. Führen die Operation in einer sterilen Haube mit einer sterilen Zustand zu halten Infektionsrisiko zu verringern. Einen Tag vor der Operation, rasieren die Gegend rund um die Tumoren der tumortragenden Mäuse mit einem elektrischen Haarschneider.
2. Etwa 2 bis 4 Stunden vor der Operation, füttern die Mäuse chewable Carprofen Tabletten für Mäuse bei einer Dosis von 5 mg / kg Körpergewicht formuliert.
3. Stellen die Mäuse in einer Kammer, die 2% Isofluran in Sauerstoff für ungefähr 30 sec. Kontinuierlich betäuben die Maus, um ein Narkosegerät während des gesamten chirurgischen Zeit nicht verwendet.
4. Verwenden Sie eine sterile Wattestäbchen vet Salbe zu den Augen der Maus anwenden Trockenheit zu verhindern, während der Narkose. Verwenden Sie die Zange um das Bein der Maus zu berühren. Keine Antwort auf die Berührung bestätigt, dass die Maus vollständig bewusstlos ist.
5. Desinfizieren Sie die Haut Bereich um die Tumorstelle mit drei Wechselwischt einer Seife Desinfektionsmittels scheuert. Wischen Sie den OP-Bereich mit 70% Alkoholtupfer.
6. Verwenden Sie ein sterilisiertes Skalpell (Abbildung 1) einen kleinen Schnitt in der Nähe des Tumors zu schneiden.
7. Legen Sie die Spitze eines Paares sterilisierte Schere zu den Einschnitt in die Haut um den Tumor zu schneiden die Tumorknoten (2A) zu belichten. Halten Sie den Tumor mit einer sterilen Pinzette und die Schere , um den Tumor von der Haut (2B) zu trennen. Speichern Sie die Tumorprobe durch in einem -80 ° C Gefrierschrank einfrieren oder für eine spätere Verwendung in 10% Formalin-Lösung fixiert.
8. Schließen der Operationsstelle mit 9 mm Wundklammern mit dem Auto-Clip - Anbringvorrichtung (Abbildung 1). Bringen Sie die Maus an einen sauberen Käfig mit autoklaviert Betten. Die Tiere sollten pro institutionellen Richtlinien überwacht werden.
   HINWEIS: Die Maus in der Regel ausreichend, das Bewusstsein wiedererlangt und beginnt in den Käfig ca. 10 zu bewegen - nach der Operation 30 min.
9. Verwalte Carprofen zuMäuse wieder 24 Stunden nach der Operation. Carprofen ist für postoperative Analgesie und Verschreibung von postoperativen Analgesie sollte durch direkte Abstimmung mit der Institution Veterinärpersonal überprüft werden. Entfernen Wundklammern, nachdem die Wunde heilt (in der Regel innerhalb von 5 bis 7 Tage nach der Operation). Entfernen Wundklammern die Auto-Clip-Entferner.

4. Live-Maus-Biolumineszenz-Bildgebung von Tumormetastasierung

1. Bild Mäuse alle 3 Tage nach der Operation, wie in Schritt 2 beschrieben.

Mit India Ink Inflation von tumortragenden Lungs 5. Validierung von Lungenmetastasen

HINWEIS: Um die Luciferase lebenden Tumorbildgebungsergebnisse zu validieren, führen Tusch Inflation von tumortragenden Maus Lunge Tumorknoten zu quantifizieren. 4T1 - Zellen auch auf andere Organe und Gewebe (5) metastasieren und daher histologische Untersuchung dieser Organe Tumormetastasierung zur Validierung sollte bei Bedarf durchgeführt werden. Dieses Protokoll Verwendung lung Metastasierung als Beispiel.

1. Halten Sie Mäuse in ihre bestehenden Heimkäfig für Euthanasie. Wenn mit anderen Tieren untergebracht ist, verlagern diese Mäuse nicht in einen anderen Käfig eingeschläfert werden.
2. Entfernen Sie den Käfig Filter oben und ersetzen mit dem CO ₂ Filter oben. Schalten Sie das komprimierte CO ₂ Gaszylinder (100%), die mit dem CO ₂ Filterober verbunden ist. Stellen Sie die Durchflussmenge bei 2 l / min und halten CO ₂ auf mindestens 10 min. Wenn die Mäuse am Ende der 10 Minuten noch atmen, lassen Sie das CO ₂ auf , bis mindestens 1 min nach Mäuse aufhören zu atmen. Schalten Sie CO ₂ Zylindersteuerung und den Durchflussmesser. Warten Sie 3 Minuten und entfernen Sie den Filter oben.
3. Legen Sie die geopfert-Maus auf dem Rücken auf einer Polystyrolplatte. Stecken Sie die Beine ungehinderten Zugang zur Luftröhre zu gewährleisten. Besprühen die Mäuse mit 70% Ethanol.
4. Verwendung einer Schere, geschnitten entlang der Mittellinie des mittleren Bauch der Maus durch den Brustkorb und bis zu der SalIvariieren Drüsen. Beachten Sie die Luftröhre. Verwenden einer Pinzette Gewebe zu entfernen und die Luftröhre rund um die Luftröhre zu belichten.
5. Gewinde einer Pipettenspitze unterhalb der Trachea. die Spitze mit einer Hand halten, heben Sie vorsichtig die Luftröhre aus dem Körper nach oben und weg.
6. Drehen Sie die Plattform, um die Maus um 180 ° zu halten. Verwenden Sie eine ½ CC 27 G 1/2 Tuberculinspritze India Ink (10% Indien Tinte und 0,1% Ammoniumhydroxid) in die Lunge über die Luftröhre zu injizieren. aufblasen vollständig in die Lunge mit Tinte, bis ein starker Widerstand zu spüren ist.
7. Verwenden Sie eine Schere in die Luftröhre zu schneiden. Verwenden einer Pinzette, um die Maus zu halten und eine andere Gruppe von Zange unter die Lunge ein und die Lungenlappen aus der Maus ziehen. Spülen Sie die Lungen kurz in ein Becherglas mit Wasser.
8. In einem Abzug chemischen, übertragen Sie die Lungen zu einem Glasszintillationsröhrchen mit 3 ml Fekete-Lösung (50% Ethanol, 6% Formaldehyd und 3% Eisessig). Verschließen Sie die Fläschchen, die Lösung nicht verflüchtigt.
   HINWEIS: Kann das Gewebe auf unbestimmte Zeit in Fekete-Lösung gelagert werden.
9. Nach ein paar Minuten, Tumorknötchen als weiße Punkte auf den schwarzen Lungen (Figur 5) einzuhalten. Der weiße Tumorknoten ist sichtbar durch die Augen. Übertragen Sie die Lungen, um ein Gericht in einem Abzug und zählen die Anzahl der weißen Flecken. Jeder weiße Fleck stellt einen einzelnen metastasierten Tumorknoten.

Ergebnisse

Gründung der Orthotopische Brustkrebs Mausmodell
4T1 ist eine aggressive Mammakarzinom-Zelllinie. Die Injektion von so wenig wie 1 x 10 ⁴ Zellen in das Brustfettpolster kann in der Injektionsstelle (2A) zur Schaffung eines einheitlichen Tumorknoten führen. Daher ahmt der Tumor primären humanen Mammakarzinom. Fast 100% Mäuse entwickeln die orthotoper Tumor. Die Tumorgröße kann unter Verwendung eines digitalen Sattels oder durch Liv...

Diskussion

Viele Arten von transgenen Mausmodellen von Brustkrebs - Metastasen entwickelt. ¹ Diese transgenen Mäuse von 60 bis 100% reichen hohe Tumorinzidenz aufweisen. Jedoch ist die Metastasierung Inzidenz dieser transgenen Mäuse viel niedriger als die Tumorinzidenz (14-100%). Tumorzellen metastasieren bis LN und Lungen in den meisten dieser transgenen Mausmodellen von Brustkrebs-Metastasen. Die Metastasierung Latenz variiert von Modell zu Modell und im Bereich von 2 bis 8 Monate. ^6,11-16 Diese transgene...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ami-X Imaging System	Spectral Instruments Imaging Inc. Tucson, AZ
IsoTec SurgiVet	Anesthesia Service & Equipment , Inc., Atlanta, GA
AutoClip Physicians Kit	Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD	427638
9 MM AutoClip Applier	Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD	427630
9 MM AutoClip Remover	Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD	427637
9 MM AutoClip Wound Clip	Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD	427631
Sharp-Pointed Dissecting Scissors	Fisher	8940
Dissecting Fine-Pointed Forceps	Fisher	8875
1/2 CC 27G1/2 tuberculin syringe	Becton Dickinson and Co. NJ	305620
RPMI 1640 medium	Mediatech Inc	10-040-CV
PBS	Mediatech Inc	21-040-CV
70% Ethanol	Ultrapure-usa.com
Trypsin-EDTA	Mediatech Inc	25-040-CI