Um modelo de camundongo ortotópico de câncer de mama espontânea metástase

Resumo

Um modelo de tumor primário do cancro da mama ortotópico e remoção cirúrgica do tumor primário para prolongar a vida do rato para gerar metástase espontânea são descritos. O crescimento do tumor e progressão são monitorados e quantificado por imagens de fluorescência da luciferase.

Resumo

A metástase é a principal causa de mortalidade de pacientes de cancro da mama. O mecanismo subjacente a metástase de células de câncer, incluindo metástase do câncer de mama, é em grande parte desconhecido e é um foco na pesquisa do câncer. Vários modelos de cancro da mama espontâneos rato metástase foram estabelecidas. Aqui, nós relatamos um procedimento simplificado para estabelecer tumor primário do cancro da mama transplantado ortotópico e resultante metástase espontânea que imitam a metástase do câncer de mama humano. Combinado com a imagiologia de tumores bioluminescência vivo, neste modelo de ratinho permite o crescimento do tumor e cinética de progressão para ser monitorizada e quantificada. Neste modelo, uma dose baixa (1 x 10 ⁴ células) de células de cancro da mama 4T1-Luc foi injectada em ratinhos BALB / C mamário de ratinho almofada de gordura utilizando uma seringa de tuberculina. Os ratinhos foram injectados com luciferina e fotografada em vários pontos de tempo, utilizando um sistema de imagiologia bioluminescente. Quando os tumores primários cresceu para o limite de tamanho como no protocolo IACUC-aprovado (aproxoximately 30 dias), os ratinhos foram anestesiados sob um fluxo constante de 2% de isoflurano e oxigénio. A área do tumor foi esterilizada com etanol a 70%. A pele do murganho em torno do tumor foi excisada para expor o tumor, que foi removido com um par de tesouras estéreis. A remoção do tumor primário estende-se a sobrevivência dos ratos portadores de tumor 4T-1, durante um mês. Os ratinhos foram em seguida repetidamente fotografada para propagação de tumores metastáticos para órgãos distantes. Os agentes terapêuticos podem ser administrados para suprimir a metástase do tumor neste ponto. Este modelo é simples e ainda sensível em quantificar o crescimento de células de câncer de mama no sítio primário e cinética progressão para órgãos distantes, e, portanto, é um excelente modelo para o estudo do crescimento e progressão do cancro da mama, e para testar agentes anti-metástase terapêuticos e imunoterápicos in vivo .

Introdução

De acordo com a American Cancer Society, o cancro da mama é a forma mais frequentemente diagnosticado de câncer em mulheres nos Estados Unidos. A detecção precoce em combinação com terapias específicas recentemente desenvolvidos reduziu significativamente a mortalidade do cancro da mama nas últimas duas décadas. No entanto, o câncer de mama ainda é a segunda principal causa de morte relacionada ao câncer em mulheres nos Estados Unidos ^1. A maioria das mortes de pacientes com câncer de mama são devido a metástase das células tumorais. Infelizmente, a maioria do cancro da mama invasivo e é frequentemente metastiza para o nódulo linfático e, subsequentemente, para órgãos distantes, incluindo osso, pulmão, fígado e cérebro. ^1,2 Não existe actualmente nenhuma terapia eficaz para o cancro da mama metastático. Portanto, o desenvolvimento de agentes quimioterapêuticos e imunoterapêuticos para suprimir o cancro da mama metastático é de grande importância.

Vários cancro da mama mouse modelos de metástase espontânea têm been desenvolvidas para estudar os mecanismos moleculares subjacentes a progressão de células de tumor da mama e de metástases e para ser usados ​​como modelos para o desenvolvimento de agentes terapêuticos. ^1,3-5 No entanto, a maioria destes modelos de murganho são modelos de tumor genéticas que, ao mesmo tempo excelentes modelos para mecanicista estudos, não são adequados para testar agentes terapêuticos uma vez que a metástase leva meses a desenvolver-se estes modelos genéticos, exigindo, assim, a administração dispendiosos de longo prazo dos agentes anti-cancro. progressão tumoral ^6,7 Monitorização em ratinhos vivo também é tecnicamente exigente. Em contraste, um modelo de metástases de cancro da mama transplantado tem as vantagens de progressão tumoral termo curto e fácil de seguimento da progressão do tumor em murganhos vivos. O modelo de ratinho 4T1 metástase espontânea ortotópico de cancro da mama é um modelo de tumor transplantado tal. ⁸ Neste modelo, as células de tumor da mama são transplantadas para a almofada de gordura mamaria de estabelecer nódulos de tumor primário. O tumor primáriopode então ser removido cirurgicamente como em pacientes com cancro da mama humano. Células de tumor 4T1 são altamente invasivo. ^{8,9, 3,10} Quase todos os ratinhos desenvolvem metástases em 30 dias após o transplante do tumor para dentro a almofada de gordura mamária portador de tumor. No entanto, os tumores 4T1 crescer agressivamente nos sítios primários e muitas vezes os tamanhos dos tumores exceder os limites que são permitidos na maioria dos protocolos de origem animal. Nesta fase, as metástases são muitas vezes micrometástases. Portanto, é essencial para remover tumores primários para permitir o progresso metástase para testar agentes terapêuticos. Aqui, nós relatamos o estabelecimento de um procedimento simples e ainda sensível do transplante do tumor primário, a remoção cirúrgica do tumor primário e bioluminescência quantificação baseadas em imagiologia do crescimento do tumor 4T1 e progressão in vivo.

Protocolo

Todos os procedimentos seguem as diretrizes e protocolos aprovados por Georgia Regents Universidade Uso de Animais e do Comité Care.

1. Estabelecimento de Tumor cancro da mama ortotópico

1. Um dia antes da experiência, a cultura de aproximadamente 2 x 10 ⁶ células de tumor 4T1-Luc em uma placa de cultura de 10 cm em 10 ml de meio RPMI contendo 10% de FBS. Incubar a placa de cultura numa incubadora com CO ₂ a 37 ° C e 5% de CO _2.
2. No dia da injecção de células tumorais, remover o meio de cultura da placa de cultura com vácuo, adicionam-se 5 ml de fosfato estéril salina tamponada (PBS), pH 7,4 para o prato de cultura, e agitar suavemente o prato para lavar a superfície de cultura, remover o PBS por vácuo.
3. Adicionar 2 ml de tripsina-EDTA (tripsina a 0,05% e EDTA 0,53 mM) para o prato de cultura, incubam-lo na incubadora de CO ₂ a 37 ° C durante cerca de 5 min. Verificar as células em um microscópio invertido para certificar-se de que todas as células são destacadas do fundo do prato de cultura.
4. Extingue-se a tripsina por adição de 8 ml de meio contendo soro, as células de transferência para um tubo cónico de 15 ml e centrifugar as células a aproximadamente 450 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente.
5. Remover o sobrenadante pelas células de vácuo e ressuspender em 10 ml de PBS. centrifugar células a aproximadamente 450 xg durante 3 min. Remover o sobrenadante por aspiração, e ressuspender as células em 10 ml de PBS.
6. Pipetar 10 ul da suspensão de células para um hemocitómetro sob a tampa de vidro. Contar as células para determinar a concentração de células. Ressuspender as células em PBS a uma densidade de 2 x 10 ⁵ células / ml de HBSS. Transferir as células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril e manter as células em gelo até à sua utilização.
7. Use fêmea BALB / c machos de 6 - 8 semanas para a injecção de células tumorais.
   1. Raspar o cabelo próximo ao redor do mamilo # 3 usando um aparador de pêlos eletrônico. A injeção de 4T1 celular na glândula mamária 3 almofada de gordura gera reproducibly metástase pulmonar. Limpar a área raspada, usando o cotonete embebido em 70% etanoeu. Ressuspender as células invertendo o tubo de microcentrífuga de 2 - 3 vezes. Delicadamente aspirado de 50 ul de suspensão de células para um CC ½ 27 L 02/01 seringa de tuberculina.
   2. Injetar as células tumorais para a almofada de gordura mamária sob o nº 3 glândula mamária de um rato BALB / c. Coloque o rato em uma gaiola limpa e voltar a gaiola para instalação de alojamento animal. Aguarde cerca de 21 - 30 dias para o desenvolvimento do tumor. O crescimento do tumor deve ser monitorado em uma base regular de acordo com as políticas da instituição para estudos tumorais.

2. Ao vivo mouse Bioluminescência Imagem do crescimento do tumor

1. camundongos imagem a cada 3 dias após a injecção de tumor ratos transferência para a unidade de imagem. Injectar 100 ul de luciferina (30 mg / ml em PBS) por via intraperitoneal (IP) a ratos antes da imagiologia. Após aproximadamente 10 min, anestesiar os ratos numa câmara de indução com 2% de isoflurano / O ₂ de fluxo. Use a pinça para tocar a perna do mouse. Sem resposta ao toque confirma that o mouse é totalmente inconsciente.
   1. Colocar os ratinhos na câmara de imagem com contínuo isoflurano a 2% e O ₂ a uma taxa de fluxo de 2 L / min. Colocar o rato de tal modo que a área de interesse (ou seja, a almofada mamária da injecção inicial do tumor) voltado para a câmara do sistema de imagem. Assegurar o nariz ea boca do mouse estão firmemente estabelecidos dentro do tubo anestésico. Os animais devem ser anestesiados por normas veterinárias na instituição.
2. Adquirir imagem de bioluminescência com uma variedade de diferentes tempo de exposição. Por exemplo, definir a exposição a 30, campo de visão (FOV) de 25, altura do objeto de 1,5 cm, e obter imagens fotográficas luminescentes com baixo consumo de energia de raios-X. Defina as unidades de medida a "luminosidade".
   1. Utilize uma gama de cores linear automática com um máximo de cerca de unidades de 2,4 x 10 ⁷ de radiância. Depois de adquirir imagens iniciais, ajustar as configurações e obter uma imagem otimizada-(FiguraS 3 & 4).
3. Voltar ratos para limpar gaiolas e garantir ratos recuperar a consciência com a deambulação antes de retornar os animais para a instalação de habitação.
4. Analisar os dados com o software de imagem estar associada ao instrumento de imagem. Usando um programa de imagem, desenhe uma linha fechada em torno da região de interesse (ROI). Use o software de imagem para determinar a intensidade esplendor do ROI. Grave as intensidades relativas de cada ROI para cada ratinho.
   NOTA: intensidades de radiância mais altos indicam maiores níveis de células luminescentes, e, portanto, maior o crescimento do tumor.
5. Visualmente examine o mouse a cada 3 dias para efeitos adversos.
   NOTA: Os ratos serão pesados ​​uma vez por semana. Uma perda de peso de 15% de peso corporal serão considerados efeito adverso e os ratinhos portadores de tumor serão sacrificados tal como descrito no passo 5. Os ratinhos com tumores ulcerados também serão sacrificados.

3. A remoção cirúrgica dos tumores primários

NÃOTE: tesouras autoclave, pinça e os grampos de sutura e aplicador de clipes de feridas (Figura 1).

1. Realizar a cirurgia num hote estéril para manter uma condição esterilizada para reduzir o risco de infecção. Um dia antes da cirurgia, raspar a área em torno dos tumores dos ratos portadores de tumor com um aparador de cabelo elétrico.
2. Aproximadamente 2-4 horas antes da cirurgia, os ratos alimentam comprimidos mastigáveis ​​carprofeno formulados para ratos a uma dose de 5 mg / kg de peso corporal.
3. Colocar os ratos numa câmara contendo 2% de isoflurano em oxigénio durante cerca de 30 seg. Continuamente anestesiar o rato usando um aparelho de anestesia durante todo o período cirúrgica.
4. Use uma vara de algodão estéril para aplicar vet pomada para os olhos do mouse para evitar a secura e sob anestesia. Use a pinça para tocar a perna do mouse. Sem resposta ao toque confirma que o mouse é totalmente inconsciente.
5. Desinfectar a área da pele ao redor do local do tumor com três alternadatoalhetes de um matagal sabão desinfetante. Limpe a área cirúrgica com álcool a 70% wipe.
6. Usar um bisturi esterilizado (Figura 1) para cortar uma pequena incisão próximo do tumor.
7. Insira a ponta de um par de tesouras esterilizados para a incisão para cortar a pele em torno do tumor para expor o nódulo de tumor (Figura 2A). Segurar o tumor com fórceps estéreis e usar a tesoura para separar o tumor a partir da pele (Figura 2B). Guardar a amostra de tumor por congelação de -80 ° C ou congelador através da fixação em solução de formalina a 10% para uso futuro.
8. Fechar o local cirúrgico com clipes para feridas de 9 mm, usando o aplicador auto-grampo (Figura 1). Devolver o mouse para a gaiola limpa com roupa de cama autoclavado. Os animais devem ser monitorados por diretrizes institucionais.
   NOTA: O rato geralmente recupera a consciência suficiente e começa a mover-se na gaiola de aproximadamente 10 - 30 min após a cirurgia.
9. Administrar carprofen pararatinhos novamente 24 horas após a cirurgia. Carprofeno é para analgesia pós-cirurgia e prescrição da analgesia pós-operatória deve ser verificada por meio de consulta directa com o pessoal veterinário da instituição. Remova os clipes ferida após a ferida cicatriza (geralmente dentro de 5 - 7 dias após a cirurgia). Remova os clipes de feridas usando o removedor de auto-clip.

4. Ao vivo mouse bioluminescência imagem de metástase de tumor

1. ratinhos imagem a cada 3 dias após a cirurgia tal como descrito no passo 2.

5. Validação de metástases pulmonares Usando India Ink inflação dos Pulmões portadores de tumor

NOTA: Para validar os resultados de imagem tumor vivo luciferase, execute a inflação nanquim dos pulmões do rato portador de tumor de quantificar nódulos tumorais. Células 4T1 também metástase para outros órgãos e tecidos (Figura 5) e, por conseguinte, o exame histológico destes órgãos para validar a metástase do tumor deve ser realizada, se necessário. Este lun uso de protocolog metástase como um exemplo.

1. Manter os ratos em sua gaiola casa existente para a eutanásia. Quando alojados com outros animais, mudar esses ratos não sendo sacrificados a uma gaiola diferente.
2. Remover a parte superior do filtro gaiola e substitua com a parte superior do filtro CO _2. Ligue o cilindro comprimido _CO2 gasoso (100%), que está ligado à parte superior do filtro de CO _2. Definir a taxa de fluxo de 2 L / min e mantê-CO ₂ por pelo menos 10 min. Se os ratos são ainda respiração no final de 10 min, deixar o _CO2 em até pelo menos 1 min após ratinhos parar de respirar. Desligue CO ₂ controle do cilindro e do medidor de vazão. Espere por mais 3 minutos e retire a parte superior do filtro.
3. Coloque o rato sacrificado em sua parte traseira em uma placa de poliestireno. Pin as pernas para garantir acesso livre à traqueia. Pulverize os ratos com 70% de etanol.
4. Usando uma tesoura, corte ao longo da linha média do mid-abdómen do rato através da caixa torácica e para cima em direção ao salivariar glândulas. Observe a traqueia. Use fórceps para remover tecidos que circundam a traqueia para expor a traqueia.
5. Passe uma ponta de pipeta debaixo da traqueia. Segurando a ponta com uma mão, levante com cuidado a traqueia para cima e longe do corpo.
6. Rodar a plataforma segurando o mouse 180 °. Use um CC ½ 27 G 1/2 seringa de tuberculina a injectar India Ink (10% nanquim e 0,1% de hidróxido de amónio) para os pulmões através da traqueia. Completamente inflar os pulmões com tinta até que uma forte resistência é sentida.
7. Use uma tesoura para cortar a traqueia. Use uma pinça para segurar o mouse e inserir um outro conjunto de fórceps sob os pulmões e puxe os lobos pulmonares para fora do mouse. Lavar brevemente pulmões em um copo contendo água.
8. Em uma coifa química, transferir os pulmões para um frasco de cintilação de vidro contendo 3 ml de solução de Fekete (etanol a 50%, 6% de formaldeído, e 3% de ácido acético glacial). Tapar o frasco para evitar a evaporação da solução.
   NOTA: Os tecidos podem ser armazenados em solução de Fekete indefinidamente.
9. Após alguns minutos, observa nódulos tumorais como pontos brancos sobre os pulmões pretas (Figura 5). O nódulo tumoral branco é visível por olhos. Transferir os pulmões para um prato numa hotte e contar o número de manchas brancas. Cada mancha branca representa um único nódulo tumoral metastático.

Resultados

Estabelecimento de Ortotópico Breast Cancer Modelo rato
4T1 é uma linha de células de carcinoma da mama agressivo. A injecção de tão pouco como 1 x 10 ⁴ células para a almofada de gordura mamária pode levar à criação de um único nódulo de tumor no local da injecção (Figura 2A). Portanto, o tumor primário imita carcinoma mamário humano. Quase 100% ratinhos desenvolvem o tumor ortotópico. O tamanho do tumor pode ser quan...

Discussão

Muitos tipos de modelos de ratinhos transgénicos de metástases de cancro da mama têm sido desenvolvidos. ¹ Estes ratinhos transgénicos têm uma incidência elevada de tumor variando entre 60 a 100%. No entanto, a incidência de metástases destes ratinhos transgénicos é muito menor do que a incidência de tumores (14 - 100%). As células de tumor metastizar para LN e pulmões na maioria destes modelos de ratinho transgénicos de metástases de cancro da mama. A latência metástase varia de modelo para ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ami-X Imaging System	Spectral Instruments Imaging Inc. Tucson, AZ
IsoTec SurgiVet	Anesthesia Service & Equipment , Inc., Atlanta, GA
AutoClip Physicians Kit	Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD	427638
9 MM AutoClip Applier	Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD	427630
9 MM AutoClip Remover	Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD	427637
9 MM AutoClip Wound Clip	Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD	427631
Sharp-Pointed Dissecting Scissors	Fisher	8940
Dissecting Fine-Pointed Forceps	Fisher	8875
1/2 CC 27G1/2 tuberculin syringe	Becton Dickinson and Co. NJ	305620
RPMI 1640 medium	Mediatech Inc	10-040-CV
PBS	Mediatech Inc	21-040-CV
70% Ethanol	Ultrapure-usa.com
Trypsin-EDTA	Mediatech Inc	25-040-CI