Un modello murino ortotopico di spontanea Breast Cancer metastasi

Riepilogo

Un modello di tumore primario del cancro al seno ortotopica e la rimozione chirurgica del tumore primario di estendere la vita del mouse per generare metastasi spontanee sono descritti. La crescita del tumore e la progressione sono monitorati e quantificati mediante imaging di fluorescenza luciferasi.

Abstract

Metastasi è la prima causa di mortalità dei pazienti affetti da cancro al seno. Il meccanismo alla base di metastasi delle cellule tumorali, tra cui metastasi del cancro al seno, è in gran parte sconosciuto e è un focus nella ricerca sul cancro. Vari modelli di cancro al seno spontanei metastasi di topo sono state stabilite. Qui, riportiamo una procedura semplificata per stabilire ortotopico trapiantato tumore primario cancro al seno e conseguente metastasi spontanea che imitano metastasi del cancro al seno umano. In combinazione con l'immagine del tumore dal vivo bioluminescenza, questo modello di topo permette la crescita del tumore e la cinetica di progressione di essere monitorati e quantificati. In questo modello, una dose bassa (1 x 10 ⁴ cellule) delle cellule del cancro al seno 4T1-Luc è stato iniettato in / c cuscinetto di grasso del mouse mammaria BALB utilizzando una siringa da tubercolina. I topi sono stati iniettati con luciferina e ripreso in vari momenti che utilizzano un sistema di imaging bioluminescente. Quando i tumori primari sono cresciuti per il limite di dimensione, come nel protocollo IACUC approvato (approximately 30 giorni), i topi sono stati anestetizzati sotto costante flusso di 2% isoflurano e ossigeno. L'area del tumore è stata sterilizzata con il 70% di etanolo. La pelle del mouse attorno al tumore è stato asportato per esporre il tumore che è stato rimosso con un paio di forbici sterili. La rimozione del tumore primario prolunga la sopravvivenza dei topi 4T-1 tumorale portante per un mese. I topi sono stati poi più volte ripreso per tumore metastatico diffusione agli organi distanti. agenti terapeutici possono essere somministrati per sopprimere la metastasi tumorale a questo punto. Questo modello è semplice e tuttavia sensibile per quantificare la crescita delle cellule del cancro al seno nel sito primario e la cinetica di progressione in organi distanti, e quindi è un ottimo modello per studiare la crescita del cancro al seno e la progressione, e per testare agenti anti-metastasi terapeutici e di immunoterapia in vivo .

Introduzione

Secondo l'American Cancer Society, il cancro al seno è la forma più frequentemente diagnosticata di cancro nelle donne negli Stati Uniti. La diagnosi precoce in combinazione con terapie mirate recentemente sviluppati ha ridotto significativamente la mortalità di cancro al seno negli ultimi due decenni. Tuttavia, il cancro al seno è ancora la seconda causa di morte per cancro nelle donne negli Stati Uniti ^1. La maggior parte dei decessi di pazienti affetti da cancro al seno sono dovute a metastasi delle cellule tumorali. Purtroppo, la maggior cancro al seno è invasivo e spesso metastatizza al linfonodo e successivamente in organi distanti, tra cui ossa, polmoni, fegato e cervello. ^1,2 al momento non c'è una terapia efficace per il carcinoma mammario metastatico. Pertanto, lo sviluppo di agenti chemioterapici e immunoterapia per sopprimere carcinoma mammario metastatico è di grande importanza.

modelli di metastasi spontanea del mouse Vari cancro al seno abbiano ieen sviluppato per studiare i meccanismi molecolari alla base la progressione delle cellule tumorali della mammella e metastasi e da utilizzare come modelli per lo sviluppo di agenti terapeutici. ^1,3-5 Tuttavia, la maggior parte di questi modelli di topo sono modelli tumorali genetiche che, mentre gli ottimi modelli per meccanicistica studi, non sono adatti per testare agenti terapeutici in quanto la metastasi vogliono mesi per sviluppare in questi modelli genetici, richiedendo in tal modo l'amministrazione costosi a lungo termine degli agenti anti-cancro. ^6,7 di monitoraggio progressione del tumore nei topi dal vivo è anche tecnicamente impegnativo. Al contrario, un seno modello di metastasi del cancro trapiantato ha i vantaggi della progressione tumorale termine breve e facile il monitoraggio della progressione del tumore nei topi vivi. Il modello murino di metastasi spontanea 4T1 ortotopico tumore al seno è un tale modello di tumore trapiantato. ⁸ In questo modello, le cellule del tumore al seno sono trapiantate nel cuscinetto di grasso mammaria per stabilire noduli tumorali primarie. Il tumore primariopossono poi essere rimosso chirurgicamente come nei pazienti con cancro mammario umano. 4T1 cellule tumorali sono altamente invasiva. ^{8,9, 3,10} Quasi tutti i tumori-cuscinetto topi sviluppano metastasi in 30 giorni dopo il trapianto del tumore nel cuscinetto adiposo mammario. Tuttavia, i tumori 4T1 crescono in modo aggressivo nei siti primari e le dimensioni del tumore spesso superano i limiti a cui è consentito nella maggior parte dei protocolli di animali. In questa fase, le metastasi sono spesso micrometastasi. Pertanto, è essenziale per rimuovere i tumori primari di consentire il progresso metastasi per testare agenti terapeutici. Qui, si segnala l'istituzione di una procedura semplice e tuttavia sensibile del trapianto di tumore primario, la rimozione chirurgica del tumore primario e bioluminescenza quantificazione di imaging-based della crescita tumorale 4T1 e la progressione in vivo.

Protocollo

Tutte le procedure seguono linee guida e protocolli approvati da parte della Georgia Regents dell'Università degli animali e del Comitato Usa Care.

1. Istituzione di ortotopico tumore cancro al seno

1. Un giorno prima dell'esperimento, la cultura di circa 2 x 10 ⁶ cellule tumorali 4T1-Luc in un piatto di coltura di 10 cm in 10 ml RPMI mezzo contenente 10% FBS. Incubare la piastra di coltura in un incubatore CO ₂ a 37 ° C e 5% CO _2.
2. Il giorno di iniezione delle cellule tumorali, togliere terreno di coltura dalla piastra di coltura con il vuoto, aggiungere 5 ml di fosfato sterile salina tamponata (PBS), pH 7,4 al piatto cultura, e scuotere delicatamente il piatto per lavare la superficie della cultura, rimuovere il PBS sotto vuoto.
3. Aggiungere 2 ml di tripsina-EDTA (0,05% tripsina e 0,53 mM EDTA) al piatto di coltura, incubare nell'incubatore CO ₂ a 37 ° C per circa 5 min. Controllare cellule su un microscopio invertito per assicurarsi che tutte le cellule sono staccate dal fondo del piatto cultura.
4. Quench tripsina aggiungendo 8 ml medie siero contenenti celle di trasferimento ad un tubo conico da 15 ml e centrifugare le cellule a circa 450 xg per 3 min a RT.
5. Rimuovere il surnatante dalle cellule del vuoto e risospendere in 10 ml di PBS. cellule centrifugare a circa 450 xg per 3 min. Rimuovere il surnatante dal vuoto, e risospendere le cellule in 10 ml di PBS.
6. Pipettare 10 ml di sospensione cellulare in un emocitometro sotto il vetro di copertura. Contare le cellule per determinare la concentrazione cellulare. Risospendere le cellule in PBS ad una densità di 2 x 10 ⁵ cellule / ml HBSS. Trasferire le cellule ad un 1,5 ml provetta da microcentrifuga sterile e mantenere le cellule in ghiaccio fino al momento dell'uso.
7. Utilizzare femmina BALB / c topi di 6-8 settimane per l'iniezione delle cellule tumorali.
   1. Radere capelli vicino circostante capezzolo # 3 utilizzando un trimmer capelli elettronica. L'iniezione di cellule 4T1 nel mammaria cuscinetto adiposo ghiandola 3 genera riproducibile metastasi polmonari. Pulire la zona rasata utilizzando il bastoncino di cotone imbevuto nel 70% ethanol. Risospendere le cellule invertendo la provetta 2 - 3 volte. Delicatamente aspirato 50 ml di sospensione cellulare in un ½ CC 27 G 1/2 tubercolina siringa.
   2. Iniettare le cellule tumorali nel cuscinetto di grasso mammaria sotto # 3 ghiandola mammaria di un topo BALB / c. Posizionare il mouse in una gabbia pulita e riportare la gabbia per impianto di stabulazione degli animali. Attendere circa 21 - 30 giorni per lo sviluppo del tumore. La crescita del tumore deve essere monitorata in maniera regolare secondo le norme dell'istituto per gli studi tumorali.

2. vivo mouse bioluminescenza Imaging di crescita tumorale

1. topi immagine ogni 3 giorni dopo i topi di trasferimento di iniezione del tumore alla struttura di imaging. Iniettare 100 luciferina microlitri (30 mg / ml in PBS) per via intraperitoneale (ip) a topi prima imaging. Dopo circa 10 minuti, anestetizzare topi in una camera di induzione con O ₂ / flusso isoflurano 2%. Utilizzare le pinze per toccare la gamba del mouse. Nessuna reazione al tatto conferma that il mouse è completamente privo di sensi.
   1. Posizionare i topi in camera di imaging con continuo 2% isoflurano e O ₂ ad un flusso di 2 L / min. Posizionare il mouse tale che l'area di interesse (cioè, il pad mammaria dell'iniezione tumore iniziale) di fronte alla telecamera del sistema di imaging. Assicurarsi che il naso e la bocca del mouse sono saldamente fissato all'interno del tubo di anestetico. Gli animali devono essere anestetizzati per norme veterinarie presso l'istituto.
2. Acquisire l'imaging bioluminescenza con una serie di vari tempi di esposizione. Ad esempio, impostare l'esposizione a 30, campo visivo (FOV) a 25, altezza dell'oggetto da 1,5 cm, e di ottenere immagini fotografiche luminescenti con i raggi X a bassa potenza. Impostare le unità di misura per "splendore".
   1. Utilizzare una gamma colore automatica lineare con un massimo di circa 2,4 unità x 10 ⁷ radianza. Dopo aver acquisito le immagini iniziali, regolare le impostazioni e ottenere un immagine ottimizzata (Figuras 3 e 4).
3. topi per pulire le gabbie e assicurano topi riacquistano coscienza con la deambulazione, prima di tornare gli animali alla struttura alloggiativa tornare.
4. Analizzare i dati con il software di imaging di vita associata allo strumento di imaging. Utilizzando un programma di imaging, tracciare una linea chiusa intorno alla regione di interesse (ROI). Utilizzare il software di imaging per determinare l'intensità splendore del ROI. Registrare le intensità relative di ogni ROI per ogni mouse.
   NOTA: elevate intensità di radianza indicano maggiori livelli di cellule luminescenti, e così una maggiore crescita del tumore.
5. Esaminare visivamente il mouse ogni 3 giorni per gli effetti avversi.
   NOTA: I topi saranno pesati una volta alla settimana. Una perdita di peso del peso corporeo del 15% sarà considerato effetto negativo e topi portatori di tumore sarà eutanasia come descritto nella fase saranno sacrificati 5. I topi con tumori ulcerate.

3. La rimozione chirurgica dei tumori primari

NOTE: forbici Autoclave, pinze e le clip ferita e ferita clip di applicatore (Figura 1).

1. Eseguire l'intervento in una cappa sterile per mantenere una condizione sterile per ridurre il rischio di infezione. Un giorno prima dell'intervento chirurgico, radere l'area che circonda i tumori dei topi portatori di tumore con un trimmer capelli elettrici.
2. Circa 2 - 4 ore prima dell'intervento chirurgico, alimentare i topi compresse masticabili carprofen formulati per topi ad una dose di 5 mg / kg di peso corporeo.
3. Mettere i topi in una camera contenente 2% isoflurano in ossigeno per circa 30 sec. Continuamente anestetizzare il mouse utilizzando un'apparecchiatura anestesia durante l'intero periodo chirurgica.
4. Usare un bastoncino di cotone sterile per applicare veterinario unguento per gli occhi del mouse per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. Utilizzare le pinze per toccare la gamba del mouse. Nessuna reazione al tatto conferma che il mouse è completamente privo di sensi.
5. Disinfettare l'area pelle intorno al sito del tumore con tre alternatasalviette di uno scrub sapone disinfettante. Pulire l'area chirurgica con un alcool al 70% pulire.
6. Utilizzare un bisturi sterilizzato (Figura 1) per tagliare una piccola incisione vicino al tumore.
7. Inserire la punta di un paio di forbici sterilizzati per l'incisione per tagliare la pelle attorno al tumore per esporre il nodulo tumorale (Figura 2A). Tenere il tumore con pinze sterili e utilizzare le forbici per separare il tumore della pelle (Figura 2B). Salvare il campione del tumore congelando in un -80 ° C congelatore o fissando in formalina al 10% per un uso futuro.
8. Chiudere il sito chirurgico con clip ferita da 9 mm utilizzando l'applicatore automatico-clip (Figura 1). Ritorna il mouse in una gabbia pulita con biancheria da letto in autoclave. Gli animali devono essere monitorati secondo le linee guida istituzionali.
   NOTA: Il mouse di solito riprende conoscenza sufficiente e inizia a muoversi nella gabbia di circa 10 - 30 min dopo l'intervento chirurgico.
9. Somministrare Carprofen atopi nuovamente 24 ore dopo l'intervento chirurgico. Carprofen è per post-operatorio analgesia e la prescrizione di post-operatorio analgesia vanno verificate mediante consultazione diretta con il personale veterinario dell'istituzione. Rimuovere clip ferita dopo la ferita guarisce (di solito entro 5 - 7 giorni dopo l'intervento). Rimuovere clip ferita utilizzando il dispositivo di rimozione auto-clip.

4. vivo mouse bioluminescenza Imaging di tumore metastasi

1. topi Immagine ogni 3 giorni dopo l'intervento, come descritto al punto 2.

5. La convalida del polmone metastasi Utilizzando inflazione India inchiostro di polmoni tumore-cuscinetto

NOTA: Per convalidare i luciferasi in tempo reale risultati di imaging del tumore, eseguire l'India l'inflazione inchiostro dei polmoni del mouse tumore-cuscinetto per quantificare noduli tumorali. Cellule 4T1 metastatizzano anche ad altri organi e tessuti (Figura 5) e che, quindi, l'esame istologico di tali organi per convalidare metastasi tumorali dovrebbe essere eseguita se necessario. Questo uso del protocollo lung metastasi come un esempio.

1. Mantenere i topi nella loro gabbia casa esistente per l'eutanasia. Quando ospitato con altri animali, spostare quei topi non sottoposti a eutanasia di una gabbia diversa.
2. Togliere la parte superiore del filtro gabbia e sostituirlo con la parte superiore del filtro di CO _2. Accendere cilindro compresso gas CO ₂ (100%) che è collegato alla parte superiore del filtro CO _2. Impostare la velocità di flusso a 2 L / min e mantenere CO ₂ per almeno 10 min. Se i topi sono respiravano ancora alla fine di 10 min, lasciare la CO ₂ fino almeno 1 min dopo topi interrompere la respirazione. Spegnere CO ₂ di controllo del cilindro e il misuratore di portata. Attendere altri 3 minuti e rimuovere la parte superiore del filtro.
3. Posizionare il mouse sacrificato sulla sua schiena su una tavola di polistirolo. Pin le gambe per garantire l'accesso senza ostacoli alla trachea. Spruzzare i topi con il 70% di etanolo.
4. Utilizzando un paio di forbici, tagliare lungo la linea mediana della metà addome del mouse attraverso la gabbia toracica e verso il salivariare ghiandole. Osservare la trachea. Usare pinze per rimuovere tessuti circostanti la trachea per esporre la trachea.
5. Infilare un puntale sotto la trachea. Tenendo la punta con una mano, sollevare delicatamente la trachea alto e lontano dal corpo.
6. Ruotare la piattaforma tenendo premuto il mouse 180 °. Utilizzare un ½ CC 27 G 1/2 tubercolina siringa per iniettare l'India inchiostro (10% inchiostro di china e lo 0,1% di idrossido di ammonio) nei polmoni attraverso la trachea. Completamente gonfiare i polmoni con inchiostro finché non si avverte una forte resistenza.
7. Utilizzare un paio di forbici per tagliare la trachea. Utilizzare pinze per tenere il mouse e inserire un altro set di pinze sotto i polmoni e tirare i lobi polmonari fuori dal mouse. Risciacquare brevemente i polmoni in un bicchiere contenente acqua.
8. In cappa, trasferire i polmoni in una fiala di vetro scintillazione contenente 3 ml di soluzione di Fekete (50% etanolo, 6% formaldeide e 3% di acido acetico glaciale). Chiudere la fiala per evitare che la soluzione evaporazione.
   NOTA: I tessuti possono essere conservati in soluzione di Fekete indefinitamente.
9. Dopo alcuni minuti, osservare noduli tumorali come punti bianchi sui polmoni neri (Figura 5). Il nodulo tumorale bianco è visibile agli occhi. Trasferire i polmoni di un piatto in una cappa aspirante e contare il numero di punti bianchi. Ogni macchia bianca rappresenta un singolo nodulo tumorale metastatico.

Risultati

Istituzione di ortotopico seno modello di cancro del mouse
4T1 è una linea di cellule di carcinoma mammario aggressivo. L'iniezione di un minimo di 1 x 10 ⁴ cellule nel cuscinetto di grasso mammaria può portare alla creazione di un singolo nodulo tumorale nel sito di iniezione (Figura 2A). Pertanto, il tumore imita carcinoma mammario primario umana. Quasi 100 i topi% sviluppano il tumore ortotopico. La dimensione del tumore può e...

Discussione

Sono stati sviluppati molti tipi di modelli di topi transgenici di metastasi del cancro al seno. ¹ Questi topi transgenici hanno un'alta incidenza di tumore che vanno da 60 a 100%. Tuttavia, l'incidenza di metastasi di questi topi transgenici è molto inferiore rispetto all'incidenza del tumore (14 - 100%). Le cellule tumorali metastatizzano a LN e polmoni nella maggior parte di questi modelli di topi transgenici di metastasi del cancro al seno. La latenza metastasi varia da modello a modello e va...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ami-X Imaging System	Spectral Instruments Imaging Inc. Tucson, AZ
IsoTec SurgiVet	Anesthesia Service & Equipment , Inc., Atlanta, GA
AutoClip Physicians Kit	Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD	427638
9 mm AutoClip Applier	Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD	427630
9 mm AutoClip Remover	Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD	427637
9 mm AutoClip Wound Clip	Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD	427631
Sharp-Pointed Dissecting Scissors	Fisher	8940
Dissecting Fine-Pointed Forceps	Fisher	8875
1/2 CC 27 G 1/2 tuberculin syringe	Becton Dickinson and Co. NJ	305620
RPMI 1640 medium	Mediatech Inc	10-040-CV
PBS	Mediatech Inc	21-040-CV
70% Ethanol	Ultrapure-usa.com
Trypsin-EDTA	Mediatech Inc	25-040-CI