자발적 유방암 전이의 동소 이식 마우스 모델

요약

동소 유방암 차 종양 모델 원발 종양의 외과 적 제거가 기재되어 자발적 전이를 생성하는 마우스의 수명을 연장한다. 종양 성장 및 진행 모니터링하고 루시퍼 형광 이미징에 의해 정량화된다.

초록

전이 유방암 환자의 사망의 주요 원인이다. 유방암의 전이를 포함한 암 세포 전이, 기본 메커니즘은 크게 알려지지 암 연구의 초점이다. 다양한 유방암 자발적 전이 마우스 모델이 확립되었다. 여기서는 동 소성 이식 유방암 원발 종양을 수립 인간 유방암 전이 모방 자발적 전이를 생성하는 간단한 방법을보고한다. 생물 발광 라이브 종양 영상과 결합,이 마우스 모델은 종양의 성장 및 진행 속도론을 모니터링하고 정량화 할 수 있습니다. 이 모델에서, 4T1-루크 유방암 세포 저용량 (1 × ¹⁰⁴ 세포) 투베르쿨린 주사기를 이용하여 BALB / C 마우스의 유방 지방 패드에 주입했다. 마우스는 주사 루시페린 및 생물 발광 이미징 시스템을 사용하여 다양한 시점에서 이미징 하였다. 차 종양은 appr합니다 (IACUC 승인 프로토콜과 크기 제한으로 성장하는 경우oximately 30 일), 마우스는 2 % 이소 플루 란과 산소의 일정한 흐름 하에서 마취시켰다. 종양 영역을 70 % 에탄올로 소독 하였다. 종양 주위 마우스 피부 멸균 가위로 제거하고 종양을 노출 절제 하였다. 주 종양의 제거를 한 달 동안 4T-1 담암 마우스의 생존을 연장한다. 생쥐는 다음 반복적으로 원격 장기로 확산 전이성 종양에 대한 몇 군데 있었다. 치료제는이 시점에서 종양 전이를 억제하기 위해 투여 될 수있다. 이 모델은 기본 사이트 및 원격 장기로 진행 동역학 유방암 세포의 성장을 정량화 단순하면서도 민감하고, 따라서, 생체 내에서 항 - 전이 치료 및 면역 치료제를 시험 유방암의 성장 및 진행을 연구하기위한 훌륭한 모델 .

서문

미국 암 협회에 따르면, 유방암은 미국 여성 암 중 가장 많이 진단 형태이다. 최근 개발 표적 요법과 조합 조기 발견이 상당히 지난 20 년간 유방암 사망률을 감소시켰다. 그러나 유방암은 여전히 미국의 ^한 여성에서 암 관련 사망의 두 번째 주요 원인이다. 유방암 환자의 사망의 대부분은 종양 세포의 전이 때문이다. 불행하게도, 대부분의 유방암은 침습적이고 자주 뼈, 폐, 간, 뇌를 포함한 원격 장기에이어서 림프절에 전이를합니다. ^{1, 2는} 현재 전이성 유방암에 대한 효과적인 치료가 없습니다. 따라서, 화학 요법 및 면역 치료제의 개발은 전이성 유방암은 큰 의미입니다 억제합니다.

다양한 유방암 자발적 전이 마우스 모델 B 조EEN 유방 종양 세포의 진행 및 전이 및 치료제의 개발을위한 모델로서 사용되는 기초가되는 분자 기전을 연구하기 위해 개발 하였다. ^1,3-5 그러나, 이러한 마우스 모델의 대부분은 유전 적 종양 모델임을 반면 기계적 대한 우수한 모델 연구는 전이 이러한 유전 모델 개발 개월 걸리므하여 항암제의 고가의 장기 투여를 요구하는, 치료제를 시험하기에 적합하지 않다. 살아있는 쥐 ^-6,7- 모니터링 종양 진행은 기술적으로 어려운 것이다. 반대로 이식 유방암 전이 모델은 단기간 종양 진행 및 라이브 마우스에서 종양 진행을 쉽게 추적의 장점이있다. 4T1 동소 유방암 자발적 전이 마우스 모델은 이식 종양 모델. ^팔이 모델이며, 유방 종양 세포가 일차 종양 결절을 확립 유방 지방 패드로 이식된다. 차 종양수술 후 인간 유방암 환자에서 제거 될 수있다. 4T1 종양 세포는 매우 침습적이다. ^{8,9, 3,10} 거의 모든 종양 베어링 마우스는 유방 지방 패드로 종양 이식 후 30 일에 전이을 개발한다. 그러나, 4T1 종양은 기본 사이트에서 적극적으로 성장하고 종양의 크기는 종종 대부분의 동물 프로토콜에 허용되는 한도를 초과. 이 단계에서, 전이는 종종 미세 전이된다. 따라서, 치료제를 시험하기위한 전이 진행하도록 주 종양을 제거하는 것이 필수적이다. 여기서는 차 종양 이식 원발 종양 및 생체 내에서 4T1 종양의 성장과 진행 생물 발광 이미징 기반 정량 제거 수술 단순하면서도 중요한 절차의 확립을보고한다.

프로토콜

모든 절차는 조지아 리전트 대학 동물 사용 및 관리위원회의 지침과 승인 된 프로토콜을 따르십시오.

동소 이식 유방암 종양의 1. 설립

1. 실험 하루 전에, 배양은 약 10 ㎖의 RPMI 배지에 10 cm 배양 접시에 2 × ¹⁰⁶ 4T1 룩 종양 세포는 10 % FBS를 함유. 37 ° C에서 CO ₂ 배양기에서 배양 접시를 품어 5 % CO _2.
2. 종양 세포 주사 일에, PBS를 제거 5 ㎖ 멸균 인산 완충 식염수 (PBS), 배양 접시에 pH 7.4의 추가 진공 배양 접시에서 배양 배지를 제거하고 부드럽게 배양 표면을 세척 할 식기를 흔들 진공에 의해.
3. 배양 접시에 2 ml의 트립신 EDTA (0.05 % 트립신 및 0.53 mM의 EDTA)을 추가 5 분 동안 37 ℃에서 _CO2 인큐베이터에서 배양 한. 모든 세포가 배양 접시의 바닥에서 분리되어 있는지 확인하기 위해 거꾸로 현미경에 세포를 확인하십시오.
4. 약 450 XG RT에서 3 분 동안 15 ml의 원추형 원심 분리 튜브에 세포를 8 ml의 혈청 함유 배지, 전사 셀을 첨가함으로써 트립신을 해소.
5. 10 ml의 PBS에 진공에 resuspend 세포의 상층 액을 제거합니다. 원심 분리기 세포에서 약 450 XG에 3 분. 진공에 의해 뜨는을 제거하고, 10 ml의 PBS에서 세포를 재현 탁.
6. 피펫 커버 유리 아래 상 혈구 세포 현탁액 10 μL. 세포 농도를 결정하기 위하여 세포를 카운트. 2 × ¹⁰⁵ 세포 / ㎖의 HBSS의 밀도 PBS에 재현 탁 된 세포. 1.5 ml의 멸균의 microfuge 튜브에 세포를 전송하고 사용할 때까지 얼음에 세포를 유지합니다.
7. 종양 세포 주입 팔주 - 6의 여성 BALB / c 마우스를 사용합니다.
   1. 전자 머리 트리머를 사용하여 유두 # 3를 둘러싼 근처에 머리를 면도. 유선 3 지방 패드에 4T1 세포의 주입 재현성 폐 전이를 생성한다. 70 % 에타에 담근 면봉을 사용하여 면도 영역을 청소엘. 3 회 - microcentrifuge 관 2를 반전시켜 세포를 재현 탁. 조심스럽게 흡인 1/2의 CC 27 G 1/2 투베르쿨린 주사기로 세포 현탁액 50 μL.
   2. Balb / c 마우스 # 3 유방 선 아래 유방 지방 패드에 종양 세포를 주입한다. 깨끗한 새장에 마우스를 놓고 동물의 주거 시설에 새장을 반환합니다. 종양 개발 30 일 - (21)는 약 기다립니다. 종양의 성장은 종양 연구 기관의 정책에 따라 정기적으로 모니터링해야합니다.

종양의 성장 2. 라이브 마우스 생물 발광 영상

1. 3 일마다 촬상 시설 종양 주입 전송 마우스 후의 이미지 마우스. 종래 촬상 생쥐에 100 μL 루시페린 (PBS에 30 ㎎ / ㎖)의 복강 (IP)을 주입한다. 이후 약 10 분, 2 % 이소 플루 란 / O ₂ 흐름 유도 챔버 마우스 마취. 마우스의 다리를 터치하기 위해 집게를 사용합니다. 터치에 대한 응답은 그쪽을 확인하지마우스 t를 완전히 의식이다.
   1. 2 L / min의 유량으로 지속적으로 2 % 이소 플루 란과 O ₂ 촬상 챔버 내의 마우스 놓는다. 관심 영역 (즉, 초기 종양 주입 유방 패드) 이미징 시스템의 카메라를 향하고있는 마우스 등 놓는다. 코를 확인하고 마우스의 입을 단단히 마취 튜브 내에서 설정됩니다. 동물은 기관에서 수의학 기준에 따라 마취해야합니다.
2. 다양한 노출 시간의 배열 생물 발광 영상을 획득. 예를 들어, 1.5 cm로, 25, 30 개체의 높이를 시야 (FOV)를 노출을 설정하고, 저전력 X 레이와 발광 사진 이미지를 얻을 수 있습니다. 에 측정 단위 설정 "광채."
   1. 약 2.4 × 10 ⁷ 복사 휘도 단위의 최대 자동 선형 색상 범위를 사용합니다. 초기 이미지를 획득 한 후 (그림 설정을 조정하고 최적화 된 이미지를 얻을 수의 3, 4).
3. 새장을 청소하고 마우스 주택 시설에 동물을 반환하기 전에 보행과 의식을 되 찾을 수 있도록하기 위해 마우스를 돌려줍니다.
4. 상기 영상 기기와 연결된 생체 이미징 소프트웨어와 데이터를 분석한다. 이미징 프로그램을 사용하여, 관심 (ROI)의 영역 주위에 둘러싸인 선을 그립니다. 투자 수익 (ROI)의 발광 강도를 결정하기 위해 이미징 소프트웨어를 사용합니다. 각 마우스의 각 ROI의 상대 강도를 기록한다.
   참고 : 높은 발광 강도가 발광 세포의 높은 수준, 따라서 더 큰 종양의 성장을 나타냅니다.
5. 시각적으로 마우스에게 부작용에 ​​대한 3 일마다 검사합니다.
   참고 : 마우스는 일주일에 한 번 무게됩니다. 15 % 체중의 체중 감소는 역효과 간주되며 궤양 종양 제 생쥐도 안락사 될 스텝에 기재된 바와 같이 종양 - 함유 마우스를 안락사된다.

차 종양의 3 외과 제거

아니TE : 오토 클레이브 가위, 집게 상처 클립과 상처 클립 적용자 (그림 1).

1. 감염의 위험을 최소화하기 위해 무균 상태를 유지하기 위해 무균 후드에서 수술을 수행한다. 수술 전 어느 날, 전기 헤어 트리머와 종양 베어링 마우스의 종양 주변 지역을 면도.
2. 약 2 - 수술 전 4 시간은 5 mg / kg 체중의 투여 량으로 쥐 제형 생쥐 카프로 펜 츄어블 정제 사료.
3. 약 30 초 동안 산소 2 % 이소 플루 란을 포함하는 챔버에서 마우스를 넣어. 연속적으로 수술 전 기간 동안 마취 장치를 사용하여 마우스를 마취.
4. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈에 수의사 연고를 적용 멸균 면봉을 사용합니다. 마우스의 다리를 터치하기 위해 집게를 사용합니다. 터치에 대한 응답은 마우스가 완전히 의식이 있음을 확인합니다.
5. 세 개의 교대로 종양 부위 주위의 피부 영역을 소독비누 살균제 스크럽의 정리합니다. 70 % 알코올 닦아에게로 수술 부위를 닦아주십시오.
6. 종양 근처의 작은 절개를 잘라 살균 메스 (그림 1)를 사용합니다.
7. 종양 결절 (그림 2A)를 노출하는 종양 주위의 피부를 잘라 절개로 멸균 가위의 끝을 삽입합니다. 멸균 집게로 종양을 잡고 피부 (그림 2B)에서 종양을 구분하기 위해 가위를 사용합니다. -80 ° C에 냉동 냉장고 또는 장래의 사용을 10 % 포르말린 용액에 고정하여 종양 샘플을 저장한다.
8. 자동 클립 적용자 (그림 1)를 사용하여 9mm 상처 클립 수술 부위를 닫습니다. 멸균 침구와 깨끗한 케이지에 마우스를 돌려줍니다. 동물은 기관의 가이드 라인에 따라 모니터링해야합니다.
   참고 : 마우스가 충분 의식을 회복하고 새장에 약 10 움직이기 시작 - 수술 후 30 분.
9. 에 카프로 펜을 관리수술 후 마우스 다시 24 시간. 카프로 펜은 수술 후 진통제 용이며 수술 후 진통제로 처방하는 기관의 수의 직원과 직접 상담하여 확인해야합니다. (- 칠일 수술 후 보통 내 5) 상처 치유 후 상처 클립을 제거합니다. 자동 클립 제거제를 사용하여 상처 클립을 제거합니다.

종양의 전이 4. 라이브 마우스 생물 발광 영상

1. 수술 후 이미지 마우스 3 일마다 2 단계에 설명 된대로.

종양 베어링 폐의 인도 잉크 인플레이션를 사용하여 검증 폐 전이 (5)

참고 : 루시퍼 라제 라이브 종양 이미징 결과를 확인 종양 결절을 정량화하는 종양 베어링 마우스 폐의 인도 잉크 인플레이션을 수행합니다. 4T1 세포는 다른 장기와 조직 (그림 5) 필요에 따라서, 종양 전이를 확인하기 위해 이들 기관의 조직 학적 검사가 수행되어야로 전이. 이 프로토콜을 사용 LUN예로서 g 전이.

1. 안락사에 대한 기존의 홈 케이지에 마우스를 유지합니다. 다른 동물들과 함께 보관하면, 다른 케이지에 안락사되지 않고 그 쥐를 변경합니다.
2. 케이지 필터 상단을 제거하고 CO ₂ 필터 상단으로 교체합니다. _{이산화탄소} 필터 상단에 연결되어있는 압축 CO ₂ 가스 실린더 (100 %)를 켭니다. 2 L / 분의 유량을 설정하고 적어도 10 분 동안의 CO _2를 유지한다. 생쥐는 여전히 10 분의 끝에서 호흡하면 쥐 호흡을 중단 한 후, 적어도 1 분까지의 CO _2를 떠난다. CO ₂ 실린더 제어 및 유량계의 전원을 끄십시오. 3 분 이상 기다린 필터 상단을 제거합니다.
3. 폴리스티렌 보드의 뒷면에 희생 마우스를 놓습니다. 기도에 방해받지 않는 접근을 보장하기 위해 다리를 핀. 70 % 에탄올로 쥐를 분무.
4. 가위를 사용하여, SalI을 향해 흉곽 통해 마우스의 중앙 복부 정중선을 따라 잘라땀샘을 다릅니다. 기관을 준수하십시오. 기관을 노출하는 기관을 주위 조직을 제거하는 집게를 사용합니다.
5. 기관 아래에 피펫 팁 스레드. 한 손으로 끝을 잡고 부드럽게 떨어져 몸에서기도를 올립니다.
6. 마우스를 180 °를 들고 플랫폼을 돌립니다. 기도를 통해 폐로 인도 잉크 (10 % 인도 잉크와 0.1 % 암모늄 수산화물)을 주입하는 ½의 CC 27 G 1/2 투베르쿨린 주사기를 사용합니다. 강한 저항이 느껴질 때까지 잉크로 완전히 폐 팽창.
7. 기관을 잘라 가위를 사용합니다. 마우스를 잡고 집게를 사용하여 폐 아래 포셉의 다른 세트를 삽입하고 마우스에서 폐 로브를 당깁니다. 비커에 들어있는 물에 폐 간단히 씻어.
8. 화학 퓸 후드에서, Fekete의 용액 (50 % 에탄올, 6 % 포름 알데히드, 3 % 빙초산) 3 ㎖을 함유하는 유리 섬광 바이알로 폐를 옮긴다. 증발 용액을 방지하기 위해 유리 병 모자.
   노트: 조직 무기한 Fekete의 용액에 저장 될 수있다.
9. 몇 분 후, 검은 폐 (그림 5)에 하얀 점으로 종양 결절을 관찰합니다. 흰색 종양 결절은 눈으로 볼 수 있습니다. 흄 후드에서 접시에 폐를 전송하고 흰 반점의 수를 계산합니다. 각각의 백색 반점은 하나의 전이성 종양 결절을 나타냅니다.

결과

동소 이식 유방 암 마우스 모델 구축
4T1는 공격적인 유방 암 세포주이다. 유방 지방 패드에 적은 ⁴ 10 × 1과 세포의 주입 주입 (그림 2A)의 사이트에서 하나의 종양 결절의 설립으로 이어질 수 있습니다. 따라서, 종양은 사람 유방 암종 주 모방. 거의 100 %의 마우스는 종양의 동 소성을 개발한다. 종양 크기는 디지털 캘리퍼스 또는 살아?...

토론

유방암 전이 트랜스 제닉 마우스 모델의 많은 종류가 개발되었다. ^하나 이들 트랜스 제닉 마우스는 60 내지 100 % 범위의 높은 종양 발생을 갖는다. (- 14 100 %) 그러나, 이들 트랜스 제닉 마우스의 전이 발생률은 종양 발생 빈도보다 낮다. 종양 세포는 유방암 전이 이들 트랜스 제닉 마우스 모델에서 대부분의 LN 및 폐 전이. 전이 대기 시간은 모델에 따라 다르며 2 ~ 8 개월의 범위. 유방암 전이 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ami-X Imaging System	Spectral Instruments Imaging Inc. Tucson, AZ
IsoTec SurgiVet	Anesthesia Service & Equipment , Inc., Atlanta, GA
AutoClip Physicians Kit	Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD	427638
9 mm AutoClip Applier	Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD	427630
9 mm AutoClip Remover	Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD	427637
9 mm AutoClip Wound Clip	Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD	427631
Sharp-Pointed Dissecting Scissors	Fisher	8940
Dissecting Fine-Pointed Forceps	Fisher	8875
1/2 CC 27 G 1/2 tuberculin syringe	Becton Dickinson and Co. NJ	305620
RPMI 1640 medium	Mediatech Inc	10-040-CV
PBS	Mediatech Inc	21-040-CV
70% Ethanol	Ultrapure-usa.com
Trypsin-EDTA	Mediatech Inc	25-040-CI