במודל עכבר orthotopic של שד ספונטני סרטן גרור

Summary

מודל גידול ראשוני orthotopic סרטן השד סר כירורגית של גידול ראשוני כדי להאריך את חיי עכבר כדי ליצור גרורות ספונטניות מתוארים. גידול הגידול ולהתפתחותו מנוטר לכמת ידי דימות פלואורסצנטי בלוציפראז.

Abstract

גרורה היא הגורם העיקרי לתמותה של חולות סרטן השד. המנגנון שבבסיס גרור של תאים סרטניים, כולל גרורות סרטן השד, הוא ידוע בעיקר ומהווה מוקד בחקר הסרטן. שוני סרטן השד הוקמו ספונטניים במודלים של עכברים גרורים. כאן אנו מדווחים על הליך פשוט להקים גידול ראשוני מושתל orthotopic סרטן השד כתוצאת גרורות ספונטניות מחקי גרורות סרטן השד אנושיים. בשילוב עם הדמיה לחיות גידול פליטת אור, במודל עכבר זה מאפשר את התפתחות הגידול קינטיקה התקדמות להיות פיקוח לכמת. במודל זה, מינון נמוך (1 x 10 ⁴ תאים) של תאים סרטניים בשד 4T1-לוק הוזרק כרית שומן חלב עכבר BALB / ג באמצעות מזרק טוברקולין. עכברים הוזרקו luciferin הדמיה בנקודות זמן שונות באמצעות מערכת הדמיה bioluminescent. כאשר הגידולים הראשוניים גדלו עד קצה גבול היכולת הגודל כמו בפרוטוקול שאושר IACUC (approximately 30 ימים), העכברים היו מורדמים תחת זרם בלתי פוסק של isoflurane וחמצן 2%. אזור הגידול מעוקר עם 70% אתנול. עור העכבר סביב הגידול נכרת לחשוף את הגידול שהוסר עם זוג מספרי סטרילית. הסרת הגידול הראשוני מרחיבה את ההישרדות של העכברים 4T-1 גידול הנושא למשך חודש ימים. העכברים אז הם צילמו שוב ושוב עבור גידול גרורתי התפשטות לאיברים מרוחקים. סוכנים טיפוליים יכולים להינתן דיכוי גרור של גידולים בשלב זה. מודל זה הוא פשוט עדיין רגיש בכימות צמיחת תאי סרטן שד האתר הראשי קינטיקה התקדמות לאיברים מרוחקים, ובכך הוא מודל מצוין לחקר גידול סרטן השד והתקדמות, ולבדיקת סוכנים טיפוליים אנטי גרור ואת חיסוני in vivo .

Introduction

על פי האגודה האמריקנית לסרטן, סרטן השד הוא הצורה המאובחנת בתדירות הגבוהה ביותר של הסרטן אצל נשים בארצות הברית. גילוי מוקדם בשילוב עם טיפולים ממוקדים שפותחו לאחרונה צמצם באופן משמעותי את התמותה מסרטן השד בשני העשורים האחרונים. עם זאת, סרטן השד הוא עדיין הגורם המוביל השני למוות מסרטן בקרב נשים בארצות הברית ^1. רוב מקרי המוות של חולי סרטן שד מתקיימות בשל גרורות תאים סרטניים. למרבה הצער, רוב סרטן השד הוא פולשני גרור לעתים קרובות את הלימפה ובהמשך לאיברים מרוחקים, כוללים עצם, ריאות, בכבד ובמוח. ^1,2 אין כרגע טיפול יעיל לסרטן שד גרורתי. לכן, פיתוח של תרופות כימותרפיות לבין חיסוני לדכא סרטן שד גרורתי הוא בעל משמעות רבה.

מודלי עכבר גרור ספונטני שונה סרטן השד been פותח כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס התקדמות תא שד גידול וגרור וכדי לשמש כמודלים לפיתוח של תרופות. ^1,3-5 עם זאת, רוב דגמי עכבר אלה דגמי גידול גנטיים, בעוד מודלים מצוינים מכניסטית מחקרים, אינם מתאימים לבדיקת סוכני טיפולית מאז גרורות לוקח חודשים כדי לפתח מודלים גנטיים אלה, ובכך הדורשים שימוש ארוך יותר יקר של תרופות אנטי-סרטניות. ^6,7 ניטור התקדמות הגידול בעכברים חיים הוא גם מאתגר מבחינה טכנית. לעומת זאת, מודל גרורות סרטן שד מושתל יש את היתרונות של התקדמות גידול בטווח קצרה מעקב קל של התקדמות גידול בעכברים חיים. 4T1 במודל עכבר הגרורות ספונטניות orthotopic סרטן השד הוא מודל גידול כגון מושתלים. ⁸ במודל זה, התאים הסרטניים בשד מושתלים לתוך כרית שומן החלב להקים גושי גידול ראשוניים. הגידול הראשונילאחר מכן ניתן להסיר בניתוח כמו חולי סרטן אנושיים השד. 4T1 תאים סרטניים הם מאוד פולשני. ^{8,9, 3,10} כמעט כל גידול נושאות עכברים לפתח גרורות ב -30 ימים לאחר השתלת גידול לתוך כרית שומן החלב. עם זאת, גידולי 4T1 לגדול באגרסיביויות האתרים העיקריים ואת גדלי הגידול לעתים קרובות עולים על המגבלות שמורשות ברוב הפרוטוקולים חיים. בשלב זה, הגרורות הן לעתים קרובות micrometastases. לכן, זה הכרחי כדי להסיר גידולים ראשוניים כדי לאפשר התקדמות גרורה לבדיקת סוכנים טיפוליים. כאן אנו מדווחים על הקמת הליך פשוט ועם זאת רגיש של השתלת הגידול הראשוני, הסרה כירורגית של הגידול הראשוני וכימות מבוססי הדמיה פליטת אור של צמיחת הגידול 4T1 והתקדמות in vivo.

Protocol

כל הנהלים עומדים בכללים ופרוטוקולים אושרו על ידי ג'ורג'יה העוצר אונ' Animal שימוש וטיפול ועדה.

1. הקמת הגידול בסרטן השד Orthotopic

1. יום אחד לפני הניסוי, תרבות כ 2 x 10 תאים ⁶ 4T1-לוק הגידול בצלחת תרבות 10 ס"מ 10 מ"ל בינוני RPMI המכיל 10% FBS. דגירת תרבות הצלחת בתוך CO ₂ באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
2. ביום הזרקת תאים סרטניים, להסיר בינוני תרבות מצלחת התרבות עם ואקום, להוסיף 5 מ"ל בופר פוספט סטרילית (PBS), pH 7.4 כדי בצלחת תרבות, ובעדינות לנער את צלחת לשטוף את המשטח תרבות, להסיר את PBS על ידי ואקום.
3. הוסף 2 מ"ל טריפסין-EDTA (0.05% טריפסין 0.53 mM EDTA) כדי בצלחת תרבות, דגירה אותו ב CO ₂ באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך כ -5 דקות. בדקו תאים על מיקרוסקופ הפוכה כדי לוודא כי כל התאים מנותקים מהחלק התחתון של מנת התרבות.
4. להרוות את טריפסין על ידי הוספת 8 מ"ל בינוני סרום המכיל, התאים והעברת צינור צנטריפוגות חרוטי 15 מ"ל התאים ב כ 450 XG 3 דקות ב RT.
5. הסר את supernatant על ידי תאי ואקום resuspend ב 10 מ"ל PBS. תאי צנטריפוגה ב כ 450 XG במשך 3 דקות. הסר את supernatant ידי ואקום, ואת resuspend התאים 10 מ"ל PBS.
6. פיפטה 10 μl של השעיה התא על גבי hemocytometer תחת כיסוי זכוכית. ספירת התאים כדי לקבוע את ריכוז התאים. תאים Resuspend ב PBS בצפיפות של 2 x 10 ⁵ תאים / מ"ל HBSS. העבר התאים לצינור microfuge 1.5 מ"ל סטרילי לשמור על התאים על הקרח עד לשימוש.
7. השתמש נקבת עכברי BALB / ג של 6 - 8 שבוע להזרקת תאים סרטניים.
   1. לגלח את השיער ליד שמסביב לפטמת # 3 באמצעות גוזם שיער אלקטרוני. הזרקת 4T1 תאים לתוך כרית שומן בלוטת 3 חלב מייצרת reproducibly גרורה ריאה. נקו את האזור המגולח באמצעות מקלון צמר גפן טבול לתוך 70% ethanol. Resuspend תאים על ידי היפוך הצינור microcentrifuge 2 - 3 פעמים. לשאוב בעדינות 50 μl של השעיה התא לתוך CC ½ 27 G 1/2 מזרק טוברקולין.
   2. להזריק את התאים הסרטניים לתוך כרית שומן החלב תחת בלוטת החלב # 3 של עכבר BALB / ג. מניחים את העכבר בכלוב נקי להחזיר את הכלוב למתקן דיור בעלי חיים. יש להמתין כ 21 - 30 ימים עבור התפתחות גידולים. צמיחת גידול צריך להיות פיקוח על בסיס קבוע בהתאם לתקנון של מוסד ללימודי גידול.

2. הדמית פליטת אור עכבר החי של גידול

1. עכברי תמונה כל 3 ימים לאחר עכברי העברת הזרקת גידול למתקן ההדמיה. להזריק 100 luciferin μl (30 מ"ג / מ"ל ​​ב PBS) intraperitoneally (IP) לעכברים לפני הדמיה. לאחר כ -10 דקות, להרדים עכברים בתא אינדוקציה עם 2% isoflurane / O ₂ זרימה. השתמש מלקחיים לגעת ברגלו של העכבר. אין תגובה למגע מאשרת that העכבר הוא מודע באופן מלא.
   1. מניח את העכברים בחדר ההדמיה עם isoflurane 2% רציפים O ₂ בקצב זרימה של 2 ליטר / דקה. מניח את העכבר כך השטח של עניין (כלומר, כרית החלב של זריקת גידול הראשונית) במסרטה של מערכת ההדמיה. ודא האף והפה של העכבר נקבעים בתקיפות בתוך צינורות הרדמה. בעלי חיים צריכים להיות מורדם לפי סטנדרטים וטרינרי במוסד.
2. רוכשת הדמית פליטת אור עם מערך של זמן חשיפה שונה. לדוגמא, גדר חשיפת 30, שדה הראייה (FOV) עד 25, גובה עצם עד 1.5 סנטימטר, ולקבל צילומים זורחים עם רנטגן צריכת חשמל נמוך. הגדר את יחידות המדידה "זוהר."
   1. השתמש מגוון ליניארי אוטומטי עם מקסימום של כ 2.4 x 10 ⁷ יחידות זוהרות. לאחר רכישת תמונות ראשוניות, ולהתאים את הגדרות ולקבל דימוי אופטימיזציה (איורים 3 ו -4).
3. חזור עכברים לנקות כלובים ולהבטיח עכברים להכרתו עם ambulation לפני חזרת בעלי החיים למתקן הדיור.
4. ניתוח נתונים באמצעות תוכנת הדמית חיים קשורה מכשיר ההדמיה. באמצעות תכנית הדמיה, לצייר קו סגור סביב האזור של (ROI) ריבית. השתמש בתוכנת ההדמיה כדי לקבוע את עוצמת הקרינה של ROI. רשום את העוצמות היחסיות של כל החזר על השקעה עבור כל עכבר.
   הערה: עוצמות קרינה גבוהות מצביעות רמות גבוהות יותר של תאים זורחים, ובכך צמיחת גידול גדולה.
5. מבחינה ויזואלית לבחון את העכבר כל 3 ימים לתופעות לוואי.
   הערה: עכברים יישקלו פעם בשבוע. ירידה במשקל של משקל גוף 15% תיחשב השפעה שלילית ועכברי נושאות הגידול יהיו מורדמים כמתואר בשלב 5. עכברים עם גידולי כיבים יהיו גם מורדם.

3. הסרה כירורגית של גידולים ראשוניים

לאTE: מספרי חיטוי, מלקחיים קליפים פצע פצע applier קליפ (איור 1).

1. לבצע את הניתוח במנדף סטרילי כדי לשמור על מצב סטרילי כדי להפחית את הסיכון של זיהום. יום אחד לפני הניתוח, לגלח את האזור שסביב הגידולים של בעכברים נושאי-הסרטניים עם גוזם שיער חשמלי.
2. כ 2 - 4 שעות לפני הניתוח, להאכיל את טבליות לעיסה carprofen עכברים ניסח עבור עכברים במינון של 5 מ"ג / ק"ג משקל גוף.
3. שם העכברים בתא המכיל 2% isoflurane חמצן למשך כ -30 שניות. ברציפות להרדים את העכבר באמצעות מנגנון הרדמה בתקופת הכירורגי כולו.
4. השתמש במקל צמר גפן סטרילי כדי להחיל משחת וטרינר כדי בעין בעכבר כדי למנוע יובש לאחר הרדמה. השתמש מלקחיים לגעת ברגלו של העכבר. אין תגובה למגע מאשרת כי העכבר הוא מודע באופן מלא.
5. לחטא את אזור העור סביב לאזור הגידול עם שלושה לסירוגיןמגבונים של לשפשף חיטוי סבון. נגב את אזור הניתוח עם אלכוהול 70% לנגב.
6. השתמש אזמל מעוקר (איור 1) לחתוך חתך קטן ליד הגידול.
7. הכנס את קצה זוג מספריים מעוקרים כדי החתך לחתוך את העור סביב הגידול לחשוף גולה הגידול (איור 2 א). החזק את הגידול עם מלקחיים סטרילית להשתמש במספריים כדי להפריד את הגידול מן העור (איור 2 ב). שמור מדגם הגידול על ידי הקפאת -80 ° C במקפיא או על ידי תיקון בתמיסת פורמלין 10% לשימוש עתידי.
8. לסגור את האתר כירורגית עם 9 קליפים מ"מ פצע באמצעות applier האוטומטי קליפ (איור 1). החזר את העכבר לכלוב נקי עם מצעים autoclaved. החיות צריכות להיות במעקב בהתאם להנחיות מוסדיות.
   הערה: העכבר בדרך כלל להכרתו מספיק ומתחיל לנוע בכלוב כ 10 - 30 דקות לאחר הניתוח.
9. נהל carprofen כדיעכברים שוב 24 שעות לאחר הניתוח. Carprofen הוא על שיכוך כאבים שלאחר ניתוח וכן קבע של שיכוך כאבים שלאחר ניתוח צריך להיות מאומת על ידי התייעצות הישירה עם צוות הווטרינרים של המוסד. הסר קליפים הפצע לאחר מרפא הפצע (בדרך כלל תוך 5 - 7 ימים לאחר הניתוח). הסר קליפים הפצע באמצעות מסיר אוטומטית קליפ.

4. הדמית פליטת אור עכבר החי של גרורות של גידולים

1. עכברים תמונה כל 3 ימים לאחר הניתוח כמתואר בשלב 2.

5. אימות של גרורות סרטניות בריאות באמצעות אינפלציה בהודו דיו של ריאות נושאי גידול

הערה: כדי לאמת את תוצאות הדמית גידול החיות בלוציפראז, לבצע אינפלציה דיו הודו של ריאות עכבר גידול נושא לכמת גושים סרטניים. 4T1 תאים גם גרורים לאיברים ורקמות אחרים (איור 5) ולכן, בדיקה היסטולוגית של איברים אלה כדי לאמת גרורות של גידולים צריכה להתבצע במידת הצורך. לון שימוש בפרוטוקול זהגרורות גרם כדוגמה.

1. שמור עכברים בכלוב הבתים הקיימים שלהם להמתת חסד. כאשר שוכן עם בעלי חיים אחרים, להעביר עכברים אלה לא להיות מורדמים לכלוב אחר.
2. סר העליון כלוב מסנן ולהחליף העליון המסנן ₂ CO. הפעל את בלון גז דחוס CO ₂ (100%), שמחובר אל ראש המסנן ₂ CO. הגדר את קצב הזרימה ב 2 ליטר / דקה ולשמור CO ₂ במשך 10 דקות לפחות. אם העכברים עדיין נושמים בסוף 10 דקות, לעזוב את CO ₂ עד 1 דקות לפחות אחרי עכברים להפסיק לנשום. בטל מלא גליל CO ₂ ואת מד הזרימה. חכה 3 דקות יותר ולהסיר העליון המסנן.
3. מניחים את העכבר הקריב על גבו על לוח קלקר. הצמד את הרגליים כדי להבטיח גישה בלא הפרעה אל קנה הנשימה. תרסיס העכברים עם אתנול 70%.
4. בעזרת זוג מספריים, לחתוך לאורך קו האמצע של הבטן האמצע של העכבר דרך בית החזה ומעלה לכיוון saliלהשתנות בלוטות. שים את קנה הנשימה. שימוש במלקחיים כדי להסיר רקמות סביב קנה הנשימה כדי לחשוף את קנה הנשימה.
5. מפרסם קצה פיפטה מתחת קנה הנשימה. החזקת הקצה ביד אחת, בעדינות להרים את קנה הנשימה מעלה מהגוף.
6. סובב את הפלטפורמה מחזיקה את העכבר 180 °. השתמש ½ CC 27 G 1/2 מזרק טוברקולין להזריק דיו הודו (10% דיו הודו 0.1% אמוניום הידרוקסיד) לריאות דרך קנה הנשימה. לגמרי לנפח את הריאות עם הדיו, אלא הוא חש התנגדות חזקה.
7. השתמש זוג מספריים כדי לחתוך את קנה הנשימה. שימוש במלקחיים כדי להחזיק את העכבר וכנס קבוצה נוספת של מלקחיים תחת הריאות ולמשוך את האונה של הריאות מן העכבר. שוטפים את בקצרה הריאות בתוך מים המכילים מבחנה.
8. במנדף כימי, להעביר את הריאות כדי בקבוקון הנצנץ זכוכית המכיל 3 מ"ל של הפתרון של פקטה (אתנול 50%, 6% פורמלדהיד, וחומצה אצטית קרחונית 3%). כיסוי או בקבוקון כדי למנוע את הפתרון מן מתאדים.
   הערהניתן לאחסן רקמות בתמיסה של פקטה ללא הגבלת זמן:.
9. אחרי כמה דקות, להתבונן גושים סרטניים כמו נקודות לבנות על הריאות השחורות (איור 5). גולה הגידול הלבן גלוי על ידי עיניים. מעבירים את הריאות לצלחת במנדף ולספור את מספר כתמים לבנים. כל כתם לבן מייצג גולה גידול גרורתי יחיד.

תוצאות

הקמת מודל סרטן שד עכבר Orthotopic
4T1 היא שורת תאים אגרסיבית חלב קרצינומה. הזרקה של מעט ככל 1 x 10 ⁴ תאים לתוך כרית שומן החלב יכולה להוביל להקמת גולת גידול יחידה באתר ההזרקה (איור 2 א). לכן, הגידול מחק קרצינומה חלב ראשונית אדם. כמע?...

Discussion

סוגים רבים של דגמי עכבר מהונדסים של גרורות סרטן השד פותחו. ¹ אלה עכברים מהונדסים יש שכיחות גבוהה גידול בין 60 ל 100%. עם זאת, השכיחות הגרורות של עכברים טרנסגניים אלה הן נמוכות בהרבה מאשר שכיחות הגידול (14 - 100%). תאים סרטניים מתפשטים LN וריאות ברוב המכריע של מודלי עכבר המ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ami-X Imaging System	Spectral Instruments Imaging Inc. Tucson, AZ
IsoTec SurgiVet	Anesthesia Service & Equipment , Inc., Atlanta, GA
AutoClip Physicians Kit	Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD	427638
9 MM AutoClip Applier	Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD	427630
9 MM AutoClip Remover	Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD	427637
9 MM AutoClip Wound Clip	Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD	427631
Sharp-Pointed Dissecting Scissors	Fisher	8940
Dissecting Fine-Pointed Forceps	Fisher	8875
1/2 CC 27G1/2 tuberculin syringe	Becton Dickinson and Co. NJ	305620
RPMI 1640 medium	Mediatech Inc	10-040-CV
PBS	Mediatech Inc	21-040-CV
70% Ethanol	Ultrapure-usa.com
Trypsin-EDTA	Mediatech Inc	25-040-CI