Spontan Meme Kanseri metastaz Ortotopik Fare Modeli

Özet

Ortotopik meme kanseri primer tümör modeli ve primer tümörün cerrahi olarak çıkarılması açıklanan spontan metastaz oluşturmak için fare ömrünü uzatmak için. tümör büyümesi ve ilerlemesi izlenir ve lusiferaz floresan görüntüleme ile ölçülür.

Özet

Metastatik meme kanseri hastalarının ölüm birincil nedenidir. Meme kanseri metastazı dahil kanser hücre metastazı, altta yatan mekanizma, büyük ölçüde bilinmemektedir ve kanser araştırmalarında bir odak noktasıdır. Çeşitli meme kanseri spontan metastaz fare modelleri kurulmuştur. Burada, ortotopik nakledilen meme kanseri primer tümörün kurmak ve insan meme kanseri metastazı taklit spontan metastaz ve sonuç için basitleştirilmiş bir prosedür rapor. biyolüminesans canlı tümör görüntüleme ile birlikte bu fare modeli tümör büyümesi ve ilerlemesi kinetikleri izlenmesi ve sayısal sağlar. Bu modelde, 4T1-Luc göğüs kanseri hücrelerinin bir düşük doz (1 x 10 ⁴ hücre), bir tüberkülin şırıngası kullanılarak Balb / C fare meme yağ tabanına enjekte edilmiştir. Fareler lusiferin ile enjekte edilmiş ve bir biyolojik olarak ışık veren görüntüleme sistemi kullanılarak, çeşitli zaman noktalarında görüntülenmiştir. primer tümörler yakl (IACUC onaylı protokol gibi boyutu sınırı büyüdüğündeoximately 30 gün), farenin% 2 izofluran ve oksijen sürekli bir akışı altında anestezi uygulanmıştır. tümör alanı% 70 etanol ile sterilize edildi. Tümörün etrafında fare deri steril bir makasla ile çıkarıldı tümörü açığa çıkarıldı. Primer tümör uzaklaştırılması bir ay 4T-1, tümör taşıyan farelerin hayatta kalma uzanır. fareler daha sonra tekrar tekrar uzak organlara yayılma metastatik tümör için görüntülendi. Terapötik ajanlar, bu noktada, tümör metastazı bastırmak için uygulanabilir. Bu model, primer bölgesi uzaktaki organlara ilerlemesi kinetiği meme kanseri hücre büyümesini miktarının basit ve henüz duyarlıdır ve bu nedenle, in vivo olarak anti-metastaz terapötik ve immünoterapötik maddeler test etmek için, meme kanserinin oluşumu ve ilerlemesinin incelenmesi için mükemmel bir modeldir .

Giriş

Amerikan Kanser Derneği'ne göre, meme kanseri ABD'de kadınlarda kanser en sık tanı şeklidir. Son zamanlarda geliştirilen hedefe yönelik tedavilerin birlikte erken teşhis önemli ölçüde son yirmi yılda meme kanseri ölümlerini azalttı. Bununla birlikte, meme kanseri hala Amerika Birleşik Devletleri'nde ¹ kadınlarda kansere bağlı ölümlerin ikinci önde gelen nedenidir. meme kanseri hastalarının ölümlerin büyük çoğunluğu tümör hücresi metastazı kaynaklanmaktadır. Ne yazık ki, çoğu meme kanseri invaziv ve sık sık kemik, akciğer, karaciğer ve beyin de dahil olmak üzere uzak organlara, sonradan lenf nodu metastaz ve. ^1,2 anda metastatik meme kanseri için etkili bir tedavi yoktur. Bu nedenle, kemoterapötik ve immünoterapötik maddelerin geliştirilmesi metastatik meme kanseri büyük önem taşımaktadır bastırmak için.

Çeşitli meme kanseri spontan metastaz fare modelleri b vareen meme tümör hücresi ilerlemesini ve metastazını ve terapötik maddelerin geliştirilmesi için model olarak kullanılmak üzere altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek için geliştirilmiştir. ^1,3-5 Bununla birlikte, bu fare modellerinin en genetik tümör modelleri olduğu iken mekanik mükemmel modeller çalışmaları, metastaz bu genetik modeller geliştirmek için ay sürer çünkü bu şekilde anti-kanser ajanlar pahalı uzun vadeli olarak uygulanmasını gerektiren, terapötik maddeler test edilmesi için uygun değildir. canlı farelerde ^6,7 izlenmesi tümör ilerlemesi aynı zamanda teknik olarak zordur. Buna karşılık, bir nakledilen meme kanseri metastaz modeli, kısa süreli, tümör ilerlemesi ve canlı farelerde tümör ilerlemesi kolayca izlemenin avantajı vardır. 4T1 ortotopik meme kanseri spontan metastaz fare modeli böyle bir nakledilen tümör modeli. ⁸ Bu modelde ise, göğüs tümör hücreleri primer tümör nodülleri kurmak için meme yağ yastığı nakledilmektedir. primer tümörDaha sonra cerrahi insan göğüs kanseri hastalarında olduğu gibi uzaklaştırılabilir. 4T1 tümör hücreleri son derece invaziv. ^{8,9, 3,10} Hemen hemen tüm tümör taşıyan fareler meme yağ pedine tümör nakli sonrası 30 gün içinde metastaz gelişir. Ancak, 4T1 tümörler birincil sitelerde agresif büyüyecek ve tümör boyutları genellikle en hayvan protokolleri izin verilen sınırları aşan. Bu aşamada, metastazlar genellikle mikrometastazlar vardır. Nedenle, terapötik maddeler test etmek için metastaz gelişimini sağlamak için birincil tümörlerin kaldırmak için gereklidir. Burada, primer tümör nakli, primer tümörün ve in vivo 4T1 tümör büyümesi ve ilerlemesi biyoparlaklık görüntüleme bazlı ölçümü cerrahi olarak çıkarılması basit ve henüz hassas prosedür olduğu rapor edilmektedir.

Protokol

Tüm işlemler Gürcistan Regents Üniversitesi Hayvan Kullanım ve Bakım Komitesi tarafından kurallar ve onaylı protokolleri uygulayın.

Ortotopik Meme Kanseri Tümör 1. kurulması

1. Bir gün önce deney, kültür yaklaşık 10 mi RPMI ortamında 10 cm'lik bir kültür kaplarına 2 x 10 ⁶ 4T1-Luc tümör hücreleri,% 10 FBS ihtiva eden. 37 ° C 'de, bir _CO2 inkübatör kültürü çanak inkübe ve% 5 _CO2.
2. tümör hücre enjeksiyonu gününde, PBS kaldırmak, 5 ml steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), kültür tabağına, pH 7.4 ilave vakum kültür çanak kültür ortamı çıkarın ve yavaşça kültür yüzeyini yıkamak için çanak sallayın vakum ile.
3. Kültür kabı 2 mi tripsin-EDTA (% 0.05 tripsin ve 0.53 mM EDTA) ilave yaklaşık 5 dakika için 37 ° C 'de _CO2 inkübatör içinde inkübe edilir. Tüm hücreler kültür çanak alt kopuk olduğundan emin olmak için ters bir mikroskop hücreleri kontrol edin.
4. yaklaşık 450 x g'de oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 15 ml'lik konik bir tüp ve santrifüj hücreleri 8 ml serum içeren ortam transfer hücreler eklenerek tripsin Quench.
5. 10 ml PBS vakum ve tekrar süspansiyon hücreleri tarafından süpernatantı. Santrifüj hücreleri yaklaşık 450 xg 3 dakika. vakum ile süpernatantı ve 10 ml PBS hücrelerin tekrar süspansiyon.
6. Pipet kapak cam altında bir hemasitometre üzerine hücre süspansiyonu 10 ul. hücre konsantrasyonunu saptamak için hücre sayımı. 2 x 10 ⁵ hücre / ml HBSS yoğunluğunda PBS içinde yeniden süspanse hücreleri. 1.5 ml steril bir mikro santrifüj tüpüne hücreleri aktarın ve kullanılana kadar buz üzerinde hücreleri tutun.
7. tümör hücre enjeksiyonu için, 8 haftalık - 6 dişi BALB / c fareleri kullanın.
   1. elektronik saç düzeltici kullanılarak meme 3. çevreleyen yakın saç tıraş. meme bezi 3 yağ yastığı içine 4T1 hücrenin enjeksiyonu tekrarlanabilir akciğer metastazı oluşturur. % 70 etano batırılarak pamuklu çubukla kullanarak traş alanı temizleyinl. 3 kez - mikrosantrifüj tüpü 2 tersini hücreleri tekrar süspansiyon. Yavaşça aspire ½ CC 27 G 1/2 tüberkülin şırınga içine hücre süspansiyonu 50 ul.
   2. BALB / C fare 3. meme bezi kapsamında memenin yağlı pedine tümör hücrelerinin enjekte edilir. Temiz bir kafes içinde fare yerleştirin ve hayvan konut tesis kafesi dönün. Tümör gelişimi için 30 gün - 21 yaklaşık bekleyin. Tümör büyüme tümör çalışmaları için kurumun politikaları başı olarak düzenli olarak izlenmelidir.

Tümör Büyümesi 2. Canlı Fare Biyoparlaklık Görüntüleme

1. her 3 günde görüntüleme tesisine tümör enjeksiyon Transferi fareler sonra görüntü fareler. önce görüntüleme farelere 100 ul luciferase (PBS içerisinde 30 mg / ml) intraperitoneal (ip) enjekte edilir. Yaklaşık 10 dakika,% 2 izofluran / O ₂ akışı ile indüksiyon odasında fareler uyutmak. fare bacak dokunmak için forseps kullanabilir. dokunma yanıt yok tha teyitFare t tamamen bilinçsiz.
   1. 2 L / dakikalık bir akış hızında, sürekli% 2 izofluran ve O ₂ görüntüleme odasında fareler yerleştirin. Ilgi alanı (yani, ilk tümör enjeksiyon meme ped) görüntüleme sistemi kamera karşı karşıya olduğu fare gibi yerleştirin. burun sağlamak ve fare ağız sıkıca anestezik boru içinde ayarlanır. Hayvanlar kurumda veteriner standartlarına göre anestezi gerekir.
2. çeşitli pozlama süresi bir dizi ile biyoparlaklık görüntüleme kazanır. Örneğin, 1.5 cm, 25, 30 nesne yüksekliği görüş alanını (FOV) pozu ayarlamak, ve düşük güç X-ray ile ışıldayan fotoğrafik görüntüleri elde edebilir. ölçü birimlerini ayarla "parlaklık".
   1. Yaklaşık 2.4 x 10 ⁷ parlaklık birimlerinin maksimum otomatik doğrusal bir renk aralığını kullanın. İlk görüntüleri aldıktan sonra, (Şekil ayarlarını ve optimize-görüntü eldes, 3'tür ve 4).
3. kafesleri temizlemek ve fareler konut tesisine hayvanları dönmeden önce ambulasyon ile bilinç yeniden sağlamak için farelerin dönün.
4. görüntüleme cihazı ile ilişkili yaşam görüntüleme yazılımı ile verileri analiz edin. bir görüntüleme programı kullanarak, faiz (ROI) bölge etrafında kapalı bir çizgi çizin. ROI nuru yoğunluğunu belirlemek için görüntüleme yazılımı kullanın. Her fare için her ROI göreli yoğunluklarını kaydedin.
   NOT: Yüksek parlaklık yoğunlukları ışıldayan hücrelerin daha yüksek seviyelerde, ve böylece daha büyük tümör büyümesini gösterir.
5. Görme fareye olumsuz etkileri için her 3 günde bir inceleyin.
   NOT: Fareler haftada bir kez tartılır olacaktır. % 15 vücut ağırlığının bir kilo kaybı advers etki olarak kabul edilecektir ve ülsere tümörlerde 5. Fare da ötenazi olacaktır adımda açıklandığı gibi tümör taşıyan farelere ötenazi yapılacaktır.

İlköğretim Tümörlerin 3. Cerrahi Kaldırma

YOK HAYIRTE: Otoklav makas, forseps ve yara klipleri ve yara klip uygulayıcı (Şekil 1).

1. enfeksiyon riskini azaltmak için steril bir durumda muhafaza edilmesi için bir steril bir muhafaza içinde ameliyat. ameliyattan bir gün önce, bir elektrikli saç düzeltici ile tümör taşıyan farelerin tümörlerini çevredeki tıraş.
2. Yaklaşık 2 - ameliyattan önce 4 saat, 5 mg / kg vücut ağırlığı bir dozda fareler için formüle farenin çiğnenebilir karprofen tabletler beslenir.
3. yaklaşık 30 saniye boyunca oksijen içinde% 2 izofluran içeren bir bölme fareler koyun. Sürekli tüm cerrahi döneminde bir anestezi cihazı kullanarak fare uyutmak.
4. anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için fare gözlerine veteriner merhem uygulamak için steril bir pamuklu çubuk kullanın. fare bacak dokunmak için forseps kullanabilir. dokunma yanıt yok fare tamamen bilinçsiz olduğunu doğrular.
5. Üç alternatif tümör site çevresinde cilt alanı dezenfekteBir sabun dezenfektan bodur mendil. % 70 alkol silin cerrahi bölgeyi silin.
6. Tümör yakın küçük bir kesi kesmek için steril bir neşter (Şekil 1) kullanın.
7. Tümör nodül (Şekil 2A) maruz tümörün etrafındaki deriyi kesmek için kesi sterilize bir makasın ucu yerleştirin. Steril forseps ile tümörü tutun ve derinin (Şekil 2B) tümörün ayırmak için makas kullanın. -80 ° C derin dondurucuda dondurularak veya ileride kullanılmak üzere% 10 formalin çözeltisi içinde sabitleme tarafından tümör örneği kaydedin.
8. Otomatik klip uygulayıcı (Şekil 1) kullanılarak 9 mm yara klipleri ile cerrahi siteyi kapatın. otoklavlanmış yatak ile temiz bir kafes fare dönün. hayvanlar kurumsal kurallarına göre izlenmelidir.
   NOT: Fare genellikle yeterli bilinç kavuşur ve kafes içinde yaklaşık 10 hareket etmeye başlar - ameliyattan sonra 30 dakika.
9. için Birleşik Devletlerde köpekler yönetmeameliyat sonrası fareler yeniden 24 saat. Carprofen ameliyat sonrası analjezi için ve ameliyat sonrası analjezi reçete kurumun veteriner kadrosu ile doğrudan istişare yoluyla kontrol edilmelidir. (- 7 gün ameliyat sonrası genelde içinde 5) yara iyileşene sonra yara klipleri çıkarın. Otomatik klip sökücü kullanılarak yara klipleri çıkarın.

Tümör metastaz 4. Canlı Fare Biyoparlaklık Görüntüleme

1. ameliyat sonrası görüntü farenin her 3 günde bir aşama 2'de tarif edildiği gibi.

Tümör taşıyan Akciğerler Hindistan Mürekkep Enflasyonu kullanma Doğrulama Akciğer Metastazlarının 5.

NOT: lusiferaz canlı tümör görüntüleme sonuçlarını doğrulamak tümör nodülleri ölçmek için tümör taşıyan fare akciğerlerin Hindistan mürekkep enflasyon gerçekleştirmek için. 4T1 hücreleri, başka organ ve dokularda (Şekil 5) ve gerekirse, bu nedenle, tümör metastazı doğrulamak için bu organların histolojik muayene yapılmalıdır metastaz. Bu protokol kullanım lunBir örnek olarak gr metastazı.

1. Ötenazi için kendi mevcut ev kafeste fareler tutun. diğer hayvanlarla birlikte yer zaman, farklı bir kafese ötenazi olmamak bu fareler taşınmaya.
2. Kafes filtre üst çıkarın ve CO ₂ filtre üst ile değiştirin. _CO2 filtre en bağlı basınçlı _CO2 gaz silindiri (% 100) açar. 2 L / dk akış hızını ayarlayın ve en az 10 dakika süreyle ilgili _CO2 tutun. Fareler hala 10 dakika sonunda nefes varsa fareler nefes durdurmak sonra, en az 1 dakika kadar devam CO ₂ bırakın. CO ₂ silindir kontrol ve debimetre kapatın. 3 dakika daha bekleyin ve filtre üst çıkarın.
3. polistiren gemide sırtında kurban-fare yerleştirin. trakea engelsiz erişim sağlamak için bacaklarını Pin. % 70 etanol ile fareler püskürtün.
4. makas kullanarak, sali doğru yukarı göğüs kafesi üzerinden fare orta karın orta hat boyunca kesilmiş vebezleri değişir. trakea gözlemleyin. trakea maruz trakea çevre dokulara çıkarmak için forseps kullanın.
5. trakea altında bir pipet geçirin. tek elle ucu Holding, yavaşça yukarı ve vücuttan uzak trakea kaldırın.
6. fareyi 180 ° tutan bir platform döndürün. trakea yoluyla ciğerlerine Hindistan Mürekkep (% 10 çini mürekkebi ve% 0.1 Amonyum Hidroksit) enjekte etmek için bir ½ CC 27 G 1/2 tüberkülin şırınga kullanın. güçlü bir direnç hissedilir kadar tamamen mürekkeple akciğerleri şişirmek.
7. trakea kesmek için bir makas kullanın. fare tutmak için forseps kullanabilir ve akciğerlerin altında forseps başka bir set yerleştirin ve fare dışında akciğer lobları çekin. Bir bardak içeren su içinde akciğer kısaca durulayın.
8. Kimyasal bir davlumbaz olarak, Fekete solüsyonu (% 50 etanol,% 6 formaldehit ve% 3 buzlu asetik asit), 3 ml ihtiva eden bir cam sintilasyon şişesine akciğerlere aktarın. buharlaşan çözüm önlemek için şişeyi Cap.
   NOT: Dokular süresiz Fekete çözeltisi saklanabilir.
9. Birkaç dakika sonra, siyah akciğerler (Şekil 5) üzerinde beyaz noktalar olarak tümör nodülleri gözlemlemek. beyaz tümör nodülü gözleri ile görülebilir. Davlumbaz bir çanak akciğerlere aktarın ve beyaz noktaların sayısını saymak. Her beyaz nokta, tek bir metastatik tümör nodülü temsil eder.

Sonuçlar

Ortotopik Meme Kanseri Fare Modeli Kurulması
4T1 agresif meme karsinoma hücre hattıdır. Memenin yağlı pedine az ⁴ ila 10 x 1 ile hücrelerin enjeksiyonu da (Şekil 2A) yerinde bir tek tümör nodülü oluşturulmasına neden olabilir. Bu sebepten, tümör insan primer meme kanseri taklit eder. Neredeyse% 100 fareler ortotopik tümör gelişebilir. Tümör büyüklüğü, bir dijital kumpas veya canlı tümör görüntüleme

Tartışmalar

Göğüs kanseri metastazı transgenik fare modellerinde bir çok tipi geliştirilmiştir. ^1. Bu transgenik fareler, 60 ile% 100 arasında değişen yüksek bir tümör insidansı vardır. (-% 100 14) Bununla birlikte, bu transgenik farelerin metastazı sıklığı, tümör insidansı çok daha düşüktür. Tümör hücreleri, meme kanseri metastazı bu transgenik fare modellerinin çoğunda LN ve akciğerlere metastaz. Metastaz gecikme modelden modele değişir ve 2 ila 8 ay arasında değişmektedir. Meme ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ami-X Imaging System	Spectral Instruments Imaging Inc. Tucson, AZ
IsoTec SurgiVet	Anesthesia Service & Equipment , Inc., Atlanta, GA
AutoClip Physicians Kit	Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD	427638
9 mm AutoClip Applier	Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD	427630
9 mm AutoClip Remover	Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD	427637
9 mm AutoClip Wound Clip	Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD	427631
Sharp-Pointed Dissecting Scissors	Fisher	8940
Dissecting Fine-Pointed Forceps	Fisher	8875
1/2 CC 27 G 1/2 tuberculin syringe	Becton Dickinson and Co. NJ	305620
RPMI 1640 medium	Mediatech Inc	10-040-CV
PBS	Mediatech Inc	21-040-CV
70% Ethanol	Ultrapure-usa.com
Trypsin-EDTA	Mediatech Inc	25-040-CI