Ортотопическая Мышь Модель Спонтанное рака молочной железы Метастазы

Резюме

Модель первичной опухоли ортотопическая рака молочной железы и хирургическое удаление первичной опухоли, чтобы продлить срок службы мыши, чтобы сгенерировать спонтанное метастазирование описаны. Рост опухоли и прогрессирование контролируются и количественно с помощью люциферазы флуоресцентных изображений.

Аннотация

Метастазы являются основной причиной смертности больных раком молочной железы. Механизм, лежащий в основе раковых клеток метастазы, включая метастазы рака молочной железы, в значительной степени неизвестен и является центром в исследовании рака. Различные виды рака молочной железы спонтанные модели метастаза мыши были установлены. Здесь мы приводим упрощенную процедуру для установления ортотопической пересаженной рака молочной железы первичной опухоли и, как следствие спонтанное метастазирование, которые имитируют человека метастазирование рака молочной железы. В сочетании с изображениями живой опухоли биолюминесценции, эта модель позволяет мыши рост опухоли и кинетика прогрессии, чтобы контролировать и количественно. В этой модели, низкая доза (1 х 10 ⁴ клеток) 4T1-Luc клетки рака молочной железы вводили в BALB / C молочной железы мыши жировой ткани с помощью шприца туберкулином. Мышам вводили люциферин и отображаемого в различные моменты времени с использованием биолюминесцентного системы формирования изображения. Когда первичные опухоли выросли до предела размера как в IACUC утвержденных протоколом (окoximately 30 дней), мышей анестезировали при постоянном потоке 2% изофлуран и кислорода. Площадь опухоли стерилизовали 70% -ным этанолом. Кожа мыши вокруг опухоли была вырезана, чтобы обнажить опухоль, которая была удалена с парой стерильными ножницами. Удаление первичной опухоли увеличивает выживаемость мышей, несущих опухоль 4T-1 в течение одного месяца. Мыши были затем повторно отображены для метастатического распространения опухолей в отдаленные органы. Терапевтические агенты могут быть введены для подавления метастазов опухоли в этой точке. Эта модель проста и тем не менее чувствительно при количественной оценке роста клеток рака молочной железы в основной сайт и прогрессирования кинетики в отдаленные органы, и , таким образом , является отличной моделью для изучения роста рака молочной железы и прогрессирования, а также для тестирования анти-метастаз терапевтических и иммунотерапевтических агентов в естественных условиях ,

Введение

По данным Американского общества рака, рак молочной железы является наиболее часто диагностируемых формой рака у женщин в Соединенных Штатах. Раннее обнаружение в сочетании с недавно разработанных целевых терапии привело к значительному снижению смертности рака молочной железы в течение последних двух десятилетий. Тем не менее, рак молочной железы по- прежнему является второй ведущей причиной рака , связанных смерти среди женщин в Соединенных Штатах ^1. Большинство случаев смерти больных раком молочной железы обусловлены метастазов опухолевых клеток. К сожалению, большинство рак молочной железы является инвазивным и часто метастазирует в лимфатических узлах , а затем в отдаленные органы, в том числе кости, легкие, печень и мозг. ^1,2 Там в настоящее время нет эффективной терапии метастатического рака молочной железы. Таким образом, разработка химиотерапевтических и иммунотерапии агентов для подавления метастатическим раком молочной железы имеет большое значение.

Различные виды рака молочной железы модели спонтанное метастазирование мышиных бееп разработаны для изучения молекулярных механизмов , лежащих в основе прогрессии клеток опухоли молочной железы и метастазов и для использования в качестве моделей для разработки терапевтических агентов. ^1,3-5 Тем не менее, большинство из этих моделей мышей являются генетические модели опухоли , что, в то время как отличные модели для механистической исследования, не пригодны для тестирования терапевтических агентов , так как метастазирование занимает месяцы , чтобы развиваться в этих генетических моделей, что требует дорогостоящего долгосрочного введения противораковыми агентами. опухолевой прогрессии ^6,7 Мониторинг в живых мышей также технически сложной задачей. В противоположность этому, пересаженные груди модель метастазов рака имеет преимущества прогрессии опухоли короткий срок и легкого отслеживания прогрессирования опухоли в живых мышей. 4T1 ортотопическая рак молочной железы спонтанное метастазирование мышиной модели такая пересаживают модель опухоли. ⁸ В этой модели опухолевых клеток молочной железы пересаживают в жировой ткани молочных желез , чтобы установить первичную опухоль узелки. Первичная опухольмогут затем быть удалены хирургическим путем, как у больных раком молочной железы человека. 4Т1 опухолевые клетки высоко инвазивными. ^{8,9, 3,10} Почти все опухоли мышей развиваются метастазы в течение 30 дней после пересадки опухоли в молочной жировой ткани. Тем не менее, 4Т1 опухоли растут агрессивно в первичных сайтах и ​​размеры опухоли часто превышают пределы, которые разрешены в большинстве протоколов животных. На данном этапе, метастазы часто микрометастазов. Поэтому важно, чтобы удалить первичные опухоли, чтобы прогресс метастаз для тестирования терапевтических агентов. Здесь мы сообщаем о создании простого и в то же чувствительной процедуры пересадки первичной опухоли, хирургическое удаление первичной опухоли и биолюминесценции визуализации на основе количественной оценки роста опухоли 4Т1 и прогрессирования в естественных условиях.

протокол

Все процедуры следовать рекомендациям и утвержденные протоколы Грузии регентов Университета использования животных и Комитетом по уходу.

1. Создание Ортотопическая опухоли рака молочной железы

1. За один день до эксперимента, культура приблизительно 2 х 10 ⁶ 4Т1-Luc опухолевые клетки в культуральной чашке 10 см в 10 мл RPMI , содержащей 10% FBS. Инкубируют культуры блюдо в СО ₂ инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% СО _2.
2. В день инъекции опухолевых клеток, удаления культуральной среды из культуральной чашки с вакуумом, добавляют 5 мл стерильным фосфатно-буферным раствором (PBS), рН 7,4 в чашку с культурой, и осторожно встряхните блюдо, чтобы вымыть поверхность культуры, удалить PBS с помощью вакуума.
3. Добавить 2 мл трипсин-ЭДТА (0,05% трипсина и 0,53 мМ ЭДТА) в чашку с культурой, инкубировать ее в СО ₂ инкубаторе при температуре 37 ° С в течение приблизительно 5 мин. Проверка клеток на инвертированный микроскоп, чтобы убедиться, что все клетки отделяют от дна чашки для культивирования.
4. Гасят трипсина путем добавления 8 мл среде, содержащей сыворотку, клетки Перенесите в 15 мл коническую пробирку и центрифугировать клетки при приблизительно 450 мкг в течение 3 мин при комнатной температуре.
5. Удалить супернатант с помощью вакуума и ресуспендирования клеток в 10 мл PBS. Центрифуга клетки приблизительно 450 мкг в течение 3 мин. Удалить супернатант с помощью вакуума, и ресуспендирования клеток в 10 мл PBS.
6. Пипетка 10 мкл клеточной суспензии на гемоцитометра под покровным стеклом. Граф клеток для определения концентрации клеток. Ресуспендируют клеток в PBS при плотности 2 х 10 ⁵ клеток / мл HBSS. Передача клеток в 1,5 мл стерильной пробирке и держать клетки на льду до использования.
7. Использование женского пола Balb / C мышей из 6 - 8 неделе для инъекции опухолевых клеток.
   1. Бритье волос рядом окружающих сосок # 3 с использованием электронного волос триммер. Инъекция 4Т1 клетки в молочную железу 3 жировое воспроизводимо создает метастаз легких. Очистите бритую область с помощью ватным тампоном, смоченным в 70% этанол. Ресуспендируют клетки путем переворачивания трубки микроцентрифужных 2 - 3 раза. Аккуратно аспирата 50 мкл суспензии клеток в ½ CC 27 G 1/2 туберкулин шприц.
   2. Впрыскивать выход опухолевых клеток в молочной жировой ткани под # 3 молочную железу BALB / C мышей. Поместите мышь в чистую клетку и вернуть клетку к жилищным вивария. Подождите примерно 21 - 30 дней для развития опухоли. Рост опухоли должны контролироваться на регулярной основе в соответствии с политикой учреждения для опухолевых исследований.

2. Живая мышь Биолюминесценция Визуализация опухолевого роста

1. Мыши изображений каждые 3 дня после инъекции опухоли мышей Transfer до объекта визуализации. Вводят 100 мкл люциферин (30 мг / мл в PBS) внутрибрюшинно (IP) для мышей до визуализации. Примерно через 10 мин, обезболить мышей в индукционной камере с 2% изофлуран O ₂ потока /. Используйте пинцет, чтобы прикоснуться к ноге мыши. Никакого ответа на ощупь не подтверждает ТНАт мыши полностью в бессознательном состоянии.
   1. Поместите мышей в камере формирования изображения с непрерывным 2% изофлуран и O ₂ , при скорости потока 2 л / мин. Поместите мышь таким образом, что область интереса (то есть, молочная подушечка из первой инъекции опухоли) обращен лицом к камере возбуждения системы формирования изображения. Убедитесь, что нос и рот мыши надежно установлен внутри анестетика трубки. Животные должны быть под наркозом в ветеринарных стандартов в учреждении.
2. Приобретать изображений биолюминесценции с массивом различного времени экспозиции. Например, установить экспозицию до 30, поле зрения (FOV) до 25, высоту объекта до 1,5 см, и получить люминесцентными фотографические изображения с низкой мощности рентгеновского излучения. Установить единицы измерения на «сиянием».
   1. Используйте автоматический линейный диапазон цвета с максимумом около 2,4 × 10 ⁷ единиц сиянием. После получения исходных изображений, настроить параметры и получить оптимизированную-изображение (рисs 3 & 4).
3. Возвращение мышей, чтобы очистить клетки и обеспечить мышей очнуться с вставанием перед возвращением животных в жилищном учреждении.
4. Анализ данных с помощью программного обеспечения живой визуализации, связанной с прибором визуализации. Используя программу обработки изображений, нарисуйте замкнутую линию вокруг области интереса (ROI). Используйте программное обеспечение обработки изображений для определения интенсивности сияния ROI. Запишите относительные интенсивности каждого ROI для каждой мыши.
   Примечание: Более высокие интенсивности радиантности указывают на более высокие уровни светящихся клеток, и, таким образом, больший рост опухоли.
5. Визуально проверьте мышью каждые 3 дня побочных эффектов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши будут взвешиваться раз в неделю. Потеря веса 15% от массы тела будет считаться побочным эффектом, а опухоль мышей будут подвергнуты эвтаназии, как описано в шаге 5. Мыши с Изъязвлённая опухолей также будут умерщвлены.

3. Хирургическое удаление первичной опухоли

НЕТTE: Автоклавы ножницы, пинцеты и раневые зажимы и наматывают зажим для наложения (рисунок 1).

1. Выполните операцию в стерильных капот, чтобы поддерживать стерильную состояние, чтобы уменьшить риск заражения. За один день до операции, брить область вокруг опухоли опухоли мышей, несущих с электрическим триммером волос.
2. Приблизительно 2 - 4 ч до операции, кормить мышей жевательные таблетки Carprofen сформулированным для мышей в дозе 5 мг / кг массы тела.
3. Помещенный мышей в камеру, содержащую 2% изофлуран в кислороде в течение примерно 30 сек. Постоянно обезболить мышь с использованием аппарата для анестезии в течение всего хирургического периода.
4. Используйте стерильный ватную палочку, чтобы применить ветеринара мазь для глаз мыши, чтобы предотвратить сухость под наркозом. Используйте пинцет, чтобы прикоснуться к ноге мыши. Никакого ответа на ощупь не подтверждает, что мышь полностью в бессознательном состоянии.
5. Лечить участок кожи вокруг участка опухоли с тремя чередующимисясалфетки из мыла дезинфицирующим скраб. Протрите хирургическую область с 70% -ным спиртом вытирания.
6. Используйте стерилизованные скальпель (рисунок 1) , чтобы вырезать небольшой разрез вблизи опухоли.
7. Вставьте кончик пары стерилизованные ножницами разрез , чтобы порезать кожу вокруг опухоли подвергать узелок опухоли (рис 2A). Держите опухоль с стерильным пинцетом и использовать ножницы , чтобы отделить опухоль от кожи (рис 2В). Сохранить образец опухоли путем замораживания в -80 ° C морозильнике или путем фиксации в 10% растворе формалина для дальнейшего использования.
8. Закройте хирургический участок с 9 мм , намотанных клипов с использованием автоматического зажима для наложения (рисунок 1). Вернуть мышь в чистую клетку с автоклавного постельные принадлежности. Животные должны быть проверены на институциональных руководящих принципов.
   Примечание: Мышь обычно возвращает себе достаточное сознание и начинает двигаться в клетке примерно 10 - 30 мин после операции.
9. Администрирование карпрофен кмышей снова 24 ч после операции. Carprofen для послеоперационного обезболивания и прописывания послеоперационное обезболивание должна быть проверена путем прямых консультаций с ветеринарным персоналом учреждения. Удалить раны клипы после того, как рана заживает (обычно в течение 5 - 7 дней после операции). Удалить раны клипы с помощью снятия автоматического зажима.

4. Живая мышь Биолюминесценция Визуализация метастазирование опухолей

1. Мыши изображений каждые 3 дня после операции, как описано в шаге 2.

5. Проверка легких метастазами Использование тушью Инфляция-опухоленосителей Легких

Примечание: Для проверки результатов люциферазы живого изображения опухоли, выполняют тушью раздувание легких несущих опухоль мыши для количественного определения опухолевых узелков. 4T1 клетки также метастазировать в другие органы и ткани (рисунок 5) и , следовательно, гистологическое исследование этих органов для проверки метастазов опухоли следует проводить в случае необходимости. Это использование протокола луньг метастаз в качестве примера.

1. Держите мышей в их существующей домашней клетке для эвтаназии. Когда размещены с другими животными, переселять тех мышей, не будучи подвергнуты эвтаназии на другую клетку.
2. Снимите верхнюю клетку фильтра и заменить фильтра верхней CO _2. Включите сжатого СО ₂ газовый баллон (100%) , который подключен к фильтру верхней CO _2. Установить расход на 2 л / мин и держать CO ₂ в течение не менее 10 мин. Если мышей еще дышит в конце 10 мин, не оставить CO ₂ по крайней мере , до 1 мин после того, как мыши , остановки дыхания. Выключите CO ₂ управления цилиндра и расходомера. Подождите, еще 3 минут и снимите верхний фильтр.
3. Поместите пожертвовала-мышь на спине на полистирольной борту. Pin ноги, чтобы обеспечить беспрепятственный доступ к трахее. Спрей мышей с 70% -ным этанолом.
4. Используя пару ножниц, разрезать вдоль средней линии середины живота мыши через грудную клетку и вверх по направлению к SalIварьировать железы. Обратите внимание на трахею. Используйте пинцет, чтобы удалить ткани, окружающие трахею подвергать трахеи.
5. Пропустите наконечник под трахеи. Удерживая кончик с одной стороны, осторожно поднимите трахеи вверх и в сторону от тела.
6. Поверните платформу удерживая кнопку мыши на 180 °. Используйте ½ CC 27 G 1/2 туберкулин шприца впрыснуть тушью (10% тушью и 0,1% гидроокись аммония) в легкие через трахею. Полностью раздуть легкие с чернилами, пока сильное сопротивление не ощущается.
7. Используйте пару ножниц, чтобы разрезать трахею. Используйте пинцет, чтобы держать мышь и вставить другой набор щипцов под легкие и вытащить из долей легких мыши. Ополосните кратко легкие в химический стакан, содержащий воду.
8. В химическом вытяжном шкафу, передавать легкие в стекл нный сцинтилл ционный флакон, содержащий 3 мл раствора Фекете (50% этилового спирта, 6% формальдегиде, а 3% ледяной уксусной кислоты). Пробирки закрывают крышками, чтобы предотвратить испарение раствора.
   ЗАМЕТКА: Ткани могут быть сохранены в растворе Фекете на неопределенный срок.
9. Через несколько минут, наблюдать опухолевые узелки как белые точки на черных легких (рисунок 5). Белая опухоль узелок видна глазами. Перенесите легкие блюдо в вытяжном шкафу и подсчитать количество белых пятен. Каждое белое пятно представляет собой одиночный метастатический узелок опухоли.

Результаты

Создание Ортотопическая груди модели рака мыши
4T1 является агрессивной молочной линии клеток карциномы. Инъекция всего лишь 1 × 10 ⁴ клеток в жировой ткани молочных желез может привести к созданию единого узелка опухоли в месте инъекции (рис 2А).

Обсуждение

Многие виды трансгенных мышиных моделях метастаза рака молочной железы были разработаны. ¹ Эти трансгенные мыши имеют высокую вероятность возникновения опухолей в диапазоне от 60 до 100%. Тем не менее, метастазирование частота этих трансгенных мышей значительно ниже, чем частота о?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ami-X Imaging System	Spectral Instruments Imaging Inc. Tucson, AZ
IsoTec SurgiVet	Anesthesia Service & Equipment , Inc., Atlanta, GA
AutoClip Physicians Kit	Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD	427638
9 mm AutoClip Applier	Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD	427630
9 mm AutoClip Remover	Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD	427637
9 mm AutoClip Wound Clip	Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD	427631
Sharp-Pointed Dissecting Scissors	Fisher	8940
Dissecting Fine-Pointed Forceps	Fisher	8875
1/2 CC 27 G 1/2 tuberculin syringe	Becton Dickinson and Co. NJ	305620
RPMI 1640 medium	Mediatech Inc	10-040-CV
PBS	Mediatech Inc	21-040-CV
70% Ethanol	Ultrapure-usa.com
Trypsin-EDTA	Mediatech Inc	25-040-CI