自発的乳がん転移の同所性マウスモデル

要約

同所性乳癌原発腫瘍モデルおよび原発腫瘍の外科的除去が記載されている自然転移を生成するために、マウスの寿命を延長します。腫瘍の増殖および進行をモニターし、ルシフェラーゼ蛍光イメージングにより定量化されます。

要約

転移は、乳癌患者の死亡の主要な原因です。乳癌転移を含む癌細胞の転移を、基礎となるメカニズムは、ほとんど知られていない癌研究の焦点です。種々の乳癌自然転移のマウスモデルが確立されています。ここでは、同所移植乳癌原発腫瘍を確立し、ヒト乳癌の転移を模倣自然転移を結果として生じるために簡略化された手順を報告しています。生物発光ライブ腫瘍イメージングと組み合わせることで、このマウスモデルは、腫瘍の増殖および進行速度を監視し、定量化することができます。このモデルでは、4T1-Lucの乳癌細胞の低用量（1×10 ⁴細胞）ツベルクリンシリンジを用いてBALB / Cマウスの乳房脂肪パッドに注入しました。マウスは、ルシフェリンを注射し、生物発光イメージングシステムを用いて種々の時点で画像化しました。原発腫瘍がIACUC-承認されたプロトコル（APPRのようにサイズ制限に成長したときoximately 30日）、マウスを2％イソフルランおよび酸素の一定流量下で麻酔しました。腫瘍面積を70％エタノールで滅菌しました。腫瘍の周囲のマウス皮膚を、滅菌ハサミで除去した腫瘍を露出するように切り出しました。原発腫瘍の除去は、一ヶ月4T-1腫瘍を有するマウスの生存を延長します。次いで、マウスを繰り返し遠隔臓器に広がる転移性腫瘍のために画像化しました。治療薬は、この時点で腫瘍転移を抑制するために投与することができます。このモデルは、プライマリサイトと遠隔臓器への進行速度に乳癌細胞の増殖を定量化が簡単で、まだ敏感であり、したがって、およびインビボでの抗転移治療および免疫療法剤を試験するために、乳癌の成長および進行を研究するための優れたモデルであります。

概要

米国癌協会によると、乳がんは、米国における女性の癌の中で最も頻繁に診断形です。最近開発された標的療法との組み合わせで早期発見が大幅に過去20年間に乳がんの死亡率が減少しています。しかし、乳癌は、依然として米国¹の女性における癌関連死亡原因の第2位です。乳癌患者の死亡の大部分は、腫瘍細胞の転移によるものです。残念ながら、ほとんどの乳癌が浸潤性であり、しばしばリンパ節へと続いて、骨、肺、肝臓および脳を含む遠隔臓器に転移する^。1,2転移性乳癌のための有効な治療法は現在存在しません。したがって、転移性乳癌を抑制するため、化学療法と免疫療法剤の開発が非常に重要です。

種々の乳癌自然転移のマウスモデルは、Bを有していますEENは、乳房腫瘍細胞の進行および転移および治療 ​​薬の開発のためのモデルとして使用するの根底にある分子メカニズムを研究するために開発された^。1,3-5しかし、これらのマウスモデルのほとんどは遺伝的腫瘍モデルであること、一方、機械的ための優れたモデル研究は、転移は、これらの遺伝子モデルで開発しヶ月を要するため、それによって抗がん剤の高価な長期投与を必要とし、治療剤を試験するのに適していない。生きたマウスにおける^6,7監視腫瘍進行にも技術的に困難です。対照的に、移植された乳癌転移モデルは、短期腫瘍進行と生きたマウスにおける腫瘍進行の容易な追跡の利点を有します。 4T1同所性乳癌自然転移のマウスモデルは、移植腫瘍モデルである。このモデルでは^8、乳房腫瘍細胞が原発腫瘍結節を確立するために乳房脂肪パッドに移植されています。原発腫瘍その後、外科ヒト乳癌患者のように除去することができます。 4T1腫瘍細胞は、高度に侵襲的である^{。8,9、3,10}ほとんどすべての腫瘍を有するマウスは、乳房脂肪パッドへの腫瘍移植後30日以内に転移を開発しています。しかし、4T1腫瘍は原発部位に積極的に成長し、腫瘍の大きさは、多くの場合、ほとんどの動物プロトコルで許可される限度を超えています。この段階では、転移はしばしば微小転移しています。したがって、治療剤を試験するため、転移の進行を可能にするために、原発性腫瘍を除去することが不可欠です。ここでは、原発腫瘍の移植、原発腫瘍およびin vivoでの 4T1腫瘍増殖および進行の生物発光イメージングベースの定量化の外科的除去の簡単な、まだ敏感な手順の確立を報告しています。

プロトコル

すべての手順は、ジョージアリージェンツ大学の動物の使用およびケア委員会によるガイドラインおよび承認されたプロトコールに従ってください。

同所性乳癌腫瘍の1の確立

1. 一日の実験の前に、培養物を約10 mlのRPMI培地中で10 cmの培養皿中で2×10 ^6個の4T1-Lucの腫瘍細胞を、10％FBSを含みます。 37℃のCO ₂インキュベーター内で培養皿をインキュベートし、5％のCO _2。
2. 腫瘍細胞注射の日に、PBSを除去し、5ミリリットル滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、培養皿にpHが7.4を追加し、真空で培養皿から培地を除去し、静かに培養表面を洗浄する料理を振ります真空によります。
3. 、培養皿に2 mlのトリプシン-EDTA（0.05％トリプシンおよび0.53mMのEDTA）を追加し、約5分間、37℃のCO ₂インキュベーターでインキュベートします。すべての細胞が培養皿の底から切り離されていることを確認するために、倒立顕微鏡で細胞を確認してください。
4. 約450×gで室温で3分間、15 mlのコニカルチューブと遠心分離機に細胞を8 mlの血清含有培地、転送細胞を追加することによってトリプシンを急冷。
5. 10mlのPBS内の真空を再懸濁細胞により上清を取り除きます。遠心し、細胞を約450×gで3分間。真空により上清を除去し、10mlのPBSで細胞を懸濁します。
6. ピペットカバーガラスの下で血球計算板上に10μlの細胞懸濁液。細胞濃度を決定するために、細胞を数えます。 2×10 ⁵細胞/ mlのHBSSの密度でPBSで細胞を再懸濁し。 1.5ミリリットルの滅菌マイクロチューブに細胞を移し、使用するまで氷上で細胞を維持します。
7. 腫瘍細胞の注射のために8週 - 6の雌BALB / cマウスを使用してください。
   1. 電子毛のトリマーを使用して、ニップル＃3の周囲の近くで毛を剃ります。乳腺3脂肪パッドへの4T1細胞の注入は、再現性肺転移を発生させます。 70％エタノ中に浸した綿棒を使って剃ったエリアを清掃してくださいリットル。 3回 - マイクロチューブ2を反転させることによって、細胞を再懸濁します。静かに吸引1/2 CC 27 G 1/2ツベルクリン注射器に50μlの細胞懸濁液。
   2. ＃3 BALB / cマウスの乳腺下乳房脂肪体に腫瘍細胞を注射します。きれいなケージにマウスを置き、動物飼育施設にケージを返します。腫瘍発達のため30日 - 約21待ってください。腫瘍成長は、腫瘍研究のための機関の方針に従って定期的に監視する必要があります。

腫瘍増殖の2ライブマウス生物発光イメージング

1. 3日ごとに画像化施設への腫瘍注射転送マウス後の画像のマウス。撮像前にマウスに100μlのルシフェリン（PBS中の30 mg / mlで）を腹腔内（IP）を注入します。後の約10分間、2％イソフルラン/ O ₂流量で誘導チャンバ内にマウスを麻酔。マウスの足を触れないように鉗子を使用してください。タッチに対する応答は、股関節を確認していませんマウスtを完全に無意識です。
   1. 2リットル/分の流量で連続的に2％イソフルランおよびO ₂の撮像チャンバ内のマウスを置き。関心領域（ すなわち 、最初の腫瘍注射の乳房パッド）は、撮像システムのカメラに対向する。このようなマウスを置きマウスの鼻と口を確認しますが、しっかりと麻酔チューブ内に設定されています。動物は、教育機関で獣医の規格ごとに麻酔されるべきです。
2. 種々の露光時間の配列を使用して生物発光イメージングを取得します。例えば、1.5センチメートルに、25に、30にオブジェクトの高さを視野（FOV）の露出を設定し、低電力X線と発光写真画像を得ます。測定単位を設定し、「輝き」。
   1. 約2.4×10 ⁷輝きユニットの最大と自動線形色の範囲を使用してください。最初の画像を取得した後、設定を調整し、最適化された画像（ 図を得ますsの3＆4）。
3. 住宅施設に動物を返す前に、ケージをきれいにし、マウスが歩行で意識を取り戻す確実にするためにマウスを返します。
4. 撮像装置に関連した生活のイメージングソフトウェアを使用してデータを分析します。イメージングプログラムを使用して、関心領域（ROI）の周りに囲まれた線を引きます。 ROIの輝きの強さを決定するために、イメージングソフトウェアを使用してください。各マウスについて、各ROIの相対強度を記録します。
   注：より高い放射強度は、発光細胞のより高いレベルを示し、従って、より大きな腫瘍増殖。
5. 視覚的に悪影響のために3日ごとにマウスを調べます。
   注：マウスは、週に一度秤量されます。 15％の体重の減量は、潰瘍性腫瘍を有するマウスも安楽死され、ステップ5で説明したように逆効果と腫瘍を有するマウスを安楽死されると見なされます。

原発腫瘍の3外科的除去

NOTE：オートクレーブはさみ、鉗子および創傷クリップおよび創傷クリップアプライヤ（ 図1）。

1. 感染のリスクを減らすために無菌状態を維持するために、無菌フード内で手術を行います。手術の前にある日、電気ヘアトリマーと担癌マウスの腫瘍を周囲の領域を剃ります。
2. およそ2 - 手術前の4時間は、5 mg / kg体重の用量でマウスのために製剤化したマウスチュアブル錠カルプロフェンフィード。
3. 約30秒間酸素中2％イソフルランを含むチャンバーにマウスを置きます。全体に連続的外科手術期間中に麻酔装置を用いてマウスを麻酔。
4. 麻酔下ながら乾燥を防ぐために、マウスの目に獣医軟膏を適用するために滅菌綿棒を使用してください。マウスの足を触れないように鉗子を使用してください。タッチに対する応答は、マウスが完全に無意識であることを確認していません。
5. 3交互に腫瘍部位の周囲の皮膚領域を駆除石鹸消毒剤スクラブのワイプ。 70％アルコールで手術領域を拭き拭きます。
6. 腫瘍の近くに小さな切開をカットする滅菌メス（ 図1）を使用します。
7. 腫瘍結節（ 図2A）を露出させるために、腫瘍の周りの皮膚をカットするために切開部に滅菌ハサミの先端を挿入します。滅菌鉗子で腫瘍を持ち、皮膚（ 図2B）から腫瘍を分離するためにハサミを使用しています。 -80℃の冷凍庫で凍結することにより、または将来の使用のために10％ホルマリン溶液中で固定して腫瘍サンプルを保存します。
8. オートクリップアプライヤー（ 図1）を使用して、9ミリメートルの創傷クリップで手術部位を閉じます。オートクレーブ処理寝具付きの清潔なケージにマウスを返します。動物は、施設の指針ごとに監視する必要があります。
   注：マウスは、通常、十分な意識を取り戻し、約10ケージに移動を開始 - 手術後30分。
9. にカルプロフェンの管理マウスを再び手術後24時間。術後の鎮痛の術後の鎮痛および処方は、機関の獣医のスタッフとの直接協議によって検証されるべきであるためにカルプロフェンです。 （ - 手術後7日通常5以内）創傷治癒後に創傷クリップを削除します。オートクリップリムーバーを使用して、創傷クリップを削除します。

腫瘍の転移の4ライブマウス生物発光イメージング

1. 3日毎に、ステップ2で説明したように、手術後の画像マウス。

腫瘍を有する肺のインドインクインフレを使用して肺転移の5検証

注：腫瘍結節を定量化するために担癌マウ​​スの肺の墨汁のインフレを行い、ルシフェラーゼライブ腫瘍イメージングの結果を検証するには。 4T1細胞は、他の臓器や組織（ 図5）に転移し、必要に応じて、したがって、腫瘍転移を確認するために、これらの器官の組織学的検査を実施すべきです。このプロトコルの使用LUN一例として、グラム転移。

1. 安楽死のための既存のホームケージにマウスを保管してください。他の動物で収容された場合、別のケージに安楽死させられていない、これらのマウスを移動します。
2. ケージフィルター上部を取り外し、CO ₂のフィルタトップと交換してください。 CO ₂のフィルタ頂部に接続されている圧縮されたCO ₂ガスシリンダー（100％）をオンにします。 2 L /分の流量を設定し、少なくとも10分間のCO _2を維持_します 。マウスはまだ10分の終了時に呼吸している場合は、マウスが呼吸を停止した後、少なくとも1分までにCO _2を残します。 CO ₂シリンダ制御と流量計の電源をオフにします。 3分以上待ってから、フィルタの上部を取り外します。
3. ポリスチレンボード上の背中に犠牲にマウスを置きます。気管に遮るもののないアクセスを確保するために足をピン。 70％エタノールでマウススプレー。
4. ハサミを使用して、SalIで向かって胸郭を介してマウスの半ば腹部の正中線に沿って切断し、腺を変化させます。気管を観察します。気管を露出させるために気管の周囲の組織を除去するために鉗子を使用してください。
5. 気管の下にピペットチップを通します。片手で先端を持ち、静かにアップおよび本体から離れて気管を持ち上げます。
6. マウスを180°保持台を回転させます。気管を介して肺にインドインク（10％墨汁と0.1％水酸化アンモニウム）を注入するために1/2 CC 27 G 1/2ツベルクリン注射器を使用してください。強い抵抗が感じられるまで完全にインクで肺を膨らませます。
7. 気管をカットするはさみを使用してください。マウスを保持するために鉗子を使用して、肺の下に鉗子の別のセットを挿入して、マウスの外肺葉を引き出します。水を入れたビーカーに肺簡単にすすいでください。
8. 化学ドラフト内、Feketeの溶液3ml（50％エタノール、6％ホルムアルデヒド、および3％氷酢酸）を含有するガラス製シンチレーションバイアルに肺を転送します。蒸発から解決策を防ぐために、バイアルに蓋を。
   注意：組織は、無期限にFeketeの溶液中で保存することができます。
9. 数分後、黒の肺（ 図5）上に白い点のように腫瘍結節を観察します。白の腫瘍結節は目に見えています。ドラフト内で皿に肺を移し、白い斑点の数を数えます。それぞれの白点は、単一の転移性腫瘍結節を表します。

結果

同所性乳癌のマウスモデルの確立
4T1は、攻撃的な乳癌細胞株です。乳房脂肪パッドに、わずか^4×10 1のような細胞の注入は、注射部位における単一の腫瘍結節（ 図2A）の確立につながることができます。したがって、腫瘍はヒト一次乳癌を模倣します。ほぼ100％のマウス同所性腫瘍を発症します。腫瘍サイズはデジタルキャリパ...

ディスカッション

乳癌転移のトランスジェニックマウスモデルの多くの種類が開発されてきた^。1これらのトランスジェニックマウスは、60から100％の範囲の高い腫瘍発生率を有します。 （ - 100％14）しかし、これらのトランスジェニックマウスの転移の発生率は、腫瘍の発生率よりもはるかに低いです。腫瘍細胞は、乳癌転移のこれらのトランスジェニックマウスモデルの大部分においてLNおよび肺?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ami-X Imaging System	Spectral Instruments Imaging Inc. Tucson, AZ
IsoTec SurgiVet	Anesthesia Service & Equipment , Inc., Atlanta, GA
AutoClip Physicians Kit	Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD	427638
9 MM AutoClip Applier	Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD	427630
9 MM AutoClip Remover	Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD	427637
9 MM AutoClip Wound Clip	Becton Dickinson Primary Care Diagnostics. Sparks, MD	427631
Sharp-Pointed Dissecting Scissors	Fisher	8940
Dissecting Fine-Pointed Forceps	Fisher	8875
1/2 CC 27G1/2 tuberculin syringe	Becton Dickinson and Co. NJ	305620
RPMI 1640 medium	Mediatech Inc	10-040-CV
PBS	Mediatech Inc	21-040-CV
70% Ethanol	Ultrapure-usa.com
Trypsin-EDTA	Mediatech Inc	25-040-CI