Estudio del retículo endoplasmático y las mitocondrias por Interacciones<em&gt; In Situ</em&gt; Proximidad ligadura de ensayo en células fijadas

Resumen

A continuación, describimos un procedimiento para visualizar y cuantificar con alta sensibilidad las interacciones endógenas entre el retículo endoplasmático y las mitocondrias en las células fijadas. El protocolo cuenta con una optimizada en el ensayo de ligamiento por proximidad situ la orientación del inositol receptor / proteína 1,4,5-trifosfato regulada por glucosa 75 / D compleja canal de aniones / ciclofilina dependiente de la tensión en la interfase membrana de la mitocondria asociada.

Resumen

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), are crucial hubs for cellular signaling and cell fate. Particularly, these inter-organelle contact sites allow the transfer of calcium from the ER to mitochondria through the voltage-dependent anion channel (VDAC)/glucose-regulated protein 75 (GRP75)/inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) calcium channeling complex. While this subcellular compartment is under intense investigation in both physiological and pathological conditions, no simple and sensitive method exists to quantify the endogenous amount of ER-mitochondria contact in cells. Similarly, MAMs are highly dynamic structures, and there is no suitable approach to follow modifications of ER-mitochondria interactions without protein overexpression. Here, we report an optimized protocol based on the use of an in situ proximity ligation assay to visualize and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells by using the close proximity between proteins of the outer mitochondrial membrane (VDAC1) and of the ER membrane (IP3R1) at the MAM interface. Similar in situ proximity ligation experiments can also be performed with the GRP75/IP3R1 and cyclophilin D/IP3R1 pairs of antibodies. This assay provides several advantages over other imaging procedures, as it is highly specific, sensitive, and suitable to multiple-condition testing. Therefore, the use of this in situ proximity ligation assay should be helpful to better understand the physiological regulations of ER-mitochondria interactions, as well as their role in pathological contexts.

Introducción

Las mitocondrias y del retículo endoplásmico (ER) no son orgánulos independientes en la célula, pero que interactúan estructural y funcionalmente en los sitios de contacto definidas como las membranas del retículo endoplásmico mitocondrias-asociado (MAM). De hecho, MAM corresponden a regiones en las que las membranas de la ER y mitocondrias están estrechamente yuxtapuestas, permitiendo interacciones entre las proteínas de ambos lados. No obstante, las membranas de estos orgánulos no se fusionan dentro de estas regiones, por lo que mantienen sus entidades separadas. Los MAM juegan un papel crucial en calcio (Ca2 ⁺⁾ y la transferencia de fosfolípidos de ER a las mitocondrias, lo que afecta el metabolismo energético y la supervivencia celular ^1-3.

La asociación entre el RE y las mitocondrias se visualizó por primera vez en la década de 1970 con el microscopio electrónico. Desde entonces, la microscopía electrónica de transmisión de ^{4,5, 6,7} o tomografía electrónica inmuno-localización de ER y mitocondrias específica fluoróforos / proteínas fluorescentes ⁸ fueron utilizados clásicamente para estudiar las interacciones ER-mitocondrias. Otra herramienta útil para el análisis de MAM se basa en el uso de fraccionamiento subcelular. Se permite el aislamiento de fracciones de MAM por ultracentrifugación diferencial acoplado a un gradiente de Percoll ^9. Sin embargo, el producto final contiene fracciones enriquecidas MAM, en lugar de fracciones puras. En conjunto, estas estrategias no son particularmente sensibles y / o cuantitativa, y no son fácilmente susceptibles de gran proyección. Como alternativa, utilizando enfoques genéticos fluorescentes engarces entre orgánulos inducible con las drogas han surgido, pero no permitir que el análisis de las interacciones de los orgánulos en los niveles de expresión endógena de proteínas ^10.

Basado en el descubrimiento de Szabadkai del complejo IP3R / GRP75 / VDAC en el MAM ^11, hemos desarrollado un método cuantitativo para analizar las interacciones ER-mitocondrias. Se utilizó la proximidad situ en ligatien ensayo para detectar y cuantificar las interacciones entre VDAC1 y IP3R1, dos proteínas orgánulo de superficie implicadas en la -channeling complejo Ca2 ⁺ en la interfaz de MAM en células fijadas ^12. En pocas palabras, que probaron VDAC1 en la membrana externa mitocondrial (ratón anti-VDAC1 anticuerpo primario) y IP3R1 en la membrana ER (conejo anti-IP3R1 anticuerpo primario) (Figura 1, panel a). Entonces, de acuerdo con el ensayo, hemos añadido tanto anti-ratón y anti-IgG de conejo (sondas de ensayo de ratón y conejo proximidad ligadura), que se conjuga con extensiones de oligonucleótidos complementarios. Si las dos proteínas específicas, son a una distancia por debajo de 40 nm, los oligonucleótidos pueden hibridar con los oligos de conectores añadidos posteriormente para permitir la formación de una plantilla circular de ADN (Figura 1, panel B). Esta molécula de ADN circular se liga y se amplifica, la creación de un producto de ADN de cadena sencilla unido covalentemente a una de las sondas de proximidad (Figura 1, panel C) . Dado que la distancia entre el ER y las mitocondrias en la interfaz de MAM se extiende de 10 nm a 25 nm ^6, la ligadura de proximidad y la amplificación se pueden realizar, lo que lleva a la detección posterior debido a la hibridación de Tejas oligonucleótidos rojo marcado sondas (Figura 1, panel D ). Cada punto representa fluorescente interacciones entre VDAC1 / IP3R1, lo que permite la cuantificación de las interacciones in situ ER-mitocondrias en las células individuales.

Figura 1: ilustración esquemática de la detección de las interacciones retículo endoplásmico-mitocondrias por In Situ proximidad ligadura de ensayo. a) un anticuerpo primario de ratón dirigido contra VDAC1 y un anticuerpo primario de conejo dirigido contra IP3R1 puede unirse a sus epítopos en la proximidad a la interfaz de MAM, b) la adición de un par de sondas de ligación de proximidaddirigida contra ratón y IgG de conejo. Estas sondas se han unido las hebras de ADN que pueden formar plantillas para la ligación de oligonucleótidos de conector. c) La cadena de ADN circular formada después de la ligadura se puede amplificar y d) se visualizaron por microscopía fluorescente como un punto mediante el uso de oligonucleótidos de Texas rojo marcado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Similares en los experimentos de ensayo situ proximidad de ligación se puede realizar con el par GRP75 / IP3R1 de anticuerpos, así como la ciclofilina D (CypD) / anticuerpos IP3R1, teniendo en cuenta que CypD ha demostrado interactuar con el complejo de IP3R / GRP75 / VDAC en la interfaz MAM ^12-14.

Protocolo

1. Preparación de soluciones

1. Preparar 10% de formaldehído en PBS (baja en sal) diluyendo 5,5 ml de formaldehído al 37% en 14,5 ml de PBS. Preparar 1 M de glicina, pH 8,0, mediante la disolución de 3,8 g de glicina en 50 ml de PBS; diluir esta solución para obtener glicina 100 mM en 1 x PBS.
2. Preparar 0,1% de Triton-X100 en 1x PBS. Preparar 20x Saline citrato de sodio (SSC) utilizando cloruro de 3,0 M de sodio y citrato trisódico 0,30 M preparado en un tampón de agua desionizada con pH 7,0 a 25 ° C. Diluir esta memoria intermedia a 1x y 0,01x usando agua desionizada.

2. La fijación de las células

NOTA: Se utilizó la línea celular de hepatocarcinoma HuH7 en este estudio, pero este método es aplicable a otros cultivos de células adherentes.

1. células de la placa Huh7 (cultivadas en DMEM 1 g / l de glucosa, suplementado con suero de ternera fetal al 10% y 0,01% stock de penicilina-estreptomicina) a 150.000 células por placa de fondo de vidrio sin recubrimiento de 35 mm. Cuando se trabaja en la célula primariaculturas, utilizan platos revestidos con colágeno.
2. Al día siguiente, retire el medio de cultivo. Lavar las células con 1 ml de PBS y aspirar. Fijar las células mediante la adición de 1 ml de formaldehído al 10% y se incuba durante 10 min a temperatura ambiente (RT) con agitación.
3. Detener la reacción con 1 ml de 1 M de glicina y mezclar por rotación. Eliminar la solución de reacción de parada y se lavan las células mediante la adición de 1 ml de 1x PBS; agitar por rotación y aspirado. Añadir 1 ml de glicina 100 mM a las células e incubar durante 15 min a TA bajo agitación, y después aspirado.
   NOTA: El protocolo se puede parar aquí y los siguientes pasos se puede posponer a otro día. En ese caso, añadir 1 ml de glicina 100 mM y mantener a 4 ° C, si es necesario.

3. La permeabilización de las células

1. Añadir 1 ml de 0,1% de Triton-X100 en 1x PBS, incubar durante 15 min a TA bajo agitación, y después aspirado. Este tiempo de incubación puede aumentarse hasta 15 - 20 min cuando se trabaja en Cultur célula primariaES (por ejemplo, hepatocitos primarios ratones). Lavar las células mediante la adición de 1 ml de 1x PBS; aspirar.

4. Bloqueo

1. Añadir 40 l de solución a cada muestra (proporcionado por el kit) de bloqueo; este volumen se puede aumentar con el fin de cubrir la muestra. Incubar los platos de 30 min a 37 ° C en una cámara de humedad.
2. Toque en la solución de bloqueo fuera de los platos. Trate de obtener volúmenes residuales iguales para cada diapositiva, ya que esto afectará la reproducibilidad. No permita que las muestras se sequen!

5. Anticuerpos primarios

1. Diluir los anticuerpos primarios en 1x PBS y añadir la solución a las cápsulas (anticuerpo de ratón VDAC1: 1/100, anticuerpo de conejo IP3R1: 1/500). Alternativamente, los anticuerpos o GRP75 CypD (ambos anticuerpos de ratón utilizadas en 1/500) se pueden utilizar en lugar de VDAC1.
2. Incubar toda la noche en una cámara de humedad a 4 ° C. Lavar los portaobjetos dos veces con solución salina tamponada con Tris con 0,01% de Tween (TBS-T).

6. Ligadura de proximidad ensayo Sondas

1. sondas de ensayo de ligadura de proximidad son proporcionados por el kit. Elija sondas de acuerdo con las especies de anticuerpos primarios.
2. Preparar las dos sondas de ensayo de proximidad ligadura de 1: 5 en diluyente de anticuerpo. Dejar que la mezcla repose durante 20 minutos a temperatura ambiente. Añadir la solución de sonda de ensayo de ligamiento por proximidad diluida. Incubar los platos en una cámara de humedad pre-calienta durante 1 hora a 37 ° C. Lavar los platos dos veces con TBS-T.

7. La ligación

1. Utilizar el reactivo de detección in situ kit rojo Texas.
2. Diluir la ligadura de la 5x (proporcionado por el kit) 1: 5 en agua de alta pureza y mezclar bien. Diluir la ligasa en la solución 1x ligadura (proporcionado por el kit) 01:40 y vórtice. Esperar para agregar la ligasa hasta inmediatamente antes de la adición a las muestras.
3. Añadir esta solución a cada muestra (40 l para los platos con fondo de vidrio de 35 mm) e incubar los portaobjetos en una Cham humedad precalentadoBER durante 30 min a 37 ° C. Lavar los portaobjetos dos veces con TBS-T.

8. amplificación

NOTA: Sea cuidadoso reactivos sensibles, luz.

1. Diluir el Stock de amplificación de 5x (proporcionado por el kit) 1: 5 en agua de alta pureza. Retire la polimerasa del congelador usando el bloque de congelación (-20 ° C). Diluir la polimerasa (proporcionado por el kit) 1:80 en la solución de amplificación 1x y vórtice. Añadir la polimerasa inmediatamente antes de usar la mezcla.
2. Añadir esta solución a cada muestra (40 l para los platos con fondo de vidrio de 35 mm). Incubar los portaobjetos en una cámara húmeda precalentada durante 100 minutos a 37 ° C. Toque en la solución de amplificación de la polimerasa-off de las diapositivas.

9. Lavado final

1. Se lavan los portas en tampón de lavado 1x SSC durante 2 minutos. Se lavan los portas en tampón de lavado SSC 0,01x durante 2 min. Deje secar los platos a temperatura ambiente en la oscuridad.

10. Preparación de la Imagen

1. Montar las diapositivas utilizando un volumen mínimo de medio de montaje que contiene DAPI (acuoso y se solidifique), asegurándose de que no hay burbujas de aire atrapadas debajo de la hoja de la cubierta. El esmalte de uñas se puede utilizar para sellar los bordes. Esperar unos 15 minutos antes de analizar el uso de un microscopio confocal de fluorescencia o (excitación: 594 nm, emisión: 624 nm, la ampliación: 63X).
2. Después de formación de imágenes, guardar las diapositivas a -20 ° C en la oscuridad.

Resultados

Sobre la base de nuestra experiencia en el uso de este protocolo, con seguridad podemos recomendar este método para la visualización y cuantificación de las interacciones ER-mitocondrias en las células fijadas. Imágenes representativas de en las interacciones in situ de ligación proximidad de ensayo-visualizado ER-mitocondrias en la línea celular de hepatocarcinoma HuH7, utilizando varios pares de anticuerpos, se muestran. Como se muestra en la Figura 2

Discusión

Collectively, our studies indicate that the in situ proximity ligation assay is truly a relevant strategy to follow and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells, without the need for using organelle-specific fluorophores or fluorescent proteins. The specific use of VDAC1/IP3R1 antibodies has been adapted to study ER-mitochondria interactions in HuH7 cells. However, alternative isoforms of VDAC and IP3R may be used, depending on the cell type. In this case, antibodies need to be validated b...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formaldehyde	Sigma	F-8775
Glycine	Sigma	G-8898
Triton	Sigma	T8532
35mm Glass bottom culture dishes	MatTeK corporation	P35G-0-14-C
Blocking solution	Sigma	DUO-92004 or DUO-92002	provided in the Duolink PLA probes, Sigma
VDAC1 antibody	Abcam	ab14734
IP3R1-H80 antibody	Santa Cruz	sc28614
CypD antibody	Abcam	ab110324
Grp75 antibody	Santa Cruz	sc13967
TBS 10X	euromedex	ET220	Dilute to obtain 1X
Tween 100X	euromedex	2001-B	dilute in TBS to obtain 0,01%
PLA Probes Mouse MINUS	Sigma	DUO-92004	Duolink, Sigma
PLA Probes Rabbit PLUS	Sigma	DUO-92002	Duolink, Sigma
Duolink detection reagents red	Sigma	DUO-92008	Duolink, Sigma
Ligation solution	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Ligase	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Amplification solution	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Polymerase	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Duolink Mounting Medium	Sigma	DUO80102	Duolink, Sigma
Softwares:
Blob-finder software			BlobFinder is a freely distributed software that can perform calculations on cells from fluorescence microscopy images. This software can be downloaded for free from The Centre for Image Analysis at Uppsala University who have developed the software and the work was supported by the EU FP6 Project ENLIGHT and  Olink Bioscience. http://www.cb.uu.se/~amin/BlobFinder/index_files/Page430.htm
ImageJ software			Can be downloaded for free from: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html