Endoplazmik retikulum ve mitokondri Etkileşimleri Çalışma ile<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity ligasyon Testi Sabit Hücrelerde

Özet

Burada, sabit hücrelerde endoplazmik retikulum ve mitokondri arasındaki endojen etkileşimleri görselleştirmek ve yüksek hassasiyet ile ölçmek için bir prosedür açıklanmaktadır. Protokol, bir mitokondri ilişkili zar arayüzünde inositol 1,4,5-trifosfat reseptörü / glukoz-regüle proteini 75 / voltaj bağımlı anyon kanalı / siklofilin D kompleksi hedefleyen in situ yakınlık ligasyonu deneyinde optimize özellikleri.

Özet

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), are crucial hubs for cellular signaling and cell fate. Particularly, these inter-organelle contact sites allow the transfer of calcium from the ER to mitochondria through the voltage-dependent anion channel (VDAC)/glucose-regulated protein 75 (GRP75)/inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) calcium channeling complex. While this subcellular compartment is under intense investigation in both physiological and pathological conditions, no simple and sensitive method exists to quantify the endogenous amount of ER-mitochondria contact in cells. Similarly, MAMs are highly dynamic structures, and there is no suitable approach to follow modifications of ER-mitochondria interactions without protein overexpression. Here, we report an optimized protocol based on the use of an in situ proximity ligation assay to visualize and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells by using the close proximity between proteins of the outer mitochondrial membrane (VDAC1) and of the ER membrane (IP3R1) at the MAM interface. Similar in situ proximity ligation experiments can also be performed with the GRP75/IP3R1 and cyclophilin D/IP3R1 pairs of antibodies. This assay provides several advantages over other imaging procedures, as it is highly specific, sensitive, and suitable to multiple-condition testing. Therefore, the use of this in situ proximity ligation assay should be helpful to better understand the physiological regulations of ER-mitochondria interactions, as well as their role in pathological contexts.

Giriş

Mitokondri ve endoplazmik retikulum (ER) hücrede bağımsız organelleri olmayan, ancak mitokondri ilişkili endoplazmik retikulum zarlarının (MAM) olarak tanımlanan temas bölgelerinde yapısal ve fonksiyonel etkileşim. Aslında, MAM her iki taraftan da proteinler arasındaki etkileşimi sağlayan ER membranlar ve mitokondri yakın kapatılan bölgelere karşılık gelir. Bununla birlikte, bu organellerin membranlar bu bölgeler içinde kaynaştırmak yok, bu yüzden onların ayrı varlıklar korumak. MAM Enerji metabolizması ve hücre yaşamını ^1-3 etkileyen, mitokondri ER bir kalsiyum açısından önemli bir rol (Ca ²⁺⁾ ve fosfolipid transferi oynarlar.

ER ve mitokondri arasındaki ilişki ilk elektron mikroskobu ile 1970'lerde görüntülendi. O zamandan beri, transmisyon elektron mikroskobu ^4,5, elektron tomografi ^6,7 veya ER ve mitokondri özgü fluorofor immün lokalizasyonus / floresan proteinleri ⁸ klasik ER-mitokondri etkileşimleri çalışmak için kullanılmıştır. MAM analizi için yararlı bir araç içi fraksiyonasyon kullanımına dayanır. Bir Percoll degrade ⁹ bağlanmış diferansiyel Ultrasantrifügasyon tarafından MAM fraksiyonların izolasyonu sağlar. Bununla birlikte, nihai ürün zenginleştirilmiş MAM fraksiyonlar yerine, saf kesimlerin içerir. Toplamda, bu stratejiler özellikle hassas ve / veya kantitatif değildir ve onlar büyük tarama kolayca uygun değildir. Alternatif olarak ilaç indüklenebilir floresan arası organel bağlayıcılar kullanılarak genetik yaklaşımlar ortaya çıkmıştır, ancak protein ¹⁰ 'nın endojen ekspresyonunun seviyelerinde organel etkileşimlerin analizine izin vermez.

MAM ^11'de IP3R / GRP75 / SSVD kompleksinin Szabadkai keşfinden dayanarak, ER-mitokondri etkileşimleri analiz etmek için kantitatif bir yöntem geliştirdi. In situ yakınlığı ligati kullanılantahlil üzerinde algılamak ve VDAC1 ve IP3R1 arasındaki etkileşimleri ölçmek için, sabit hücrelerde ¹² MAM arayüzünde Ca ^{2 +} -channeling kompleksi yer alan iki organel-yüzey proteinleri. Kısaca, bizler, ER membran dış mitokondriyal zarın (fare anti-VDAC1 birincil antikor) ve IP3R1 (tavşan anti-IP3R1 birincil antikor) (Şekil 1, bir panel) de VDAC1 incelenir. Daha sonra, deney göre, anti-fare ve tamamlayıcı oligonükleotid uzantıları konjuge edilmiş anti-tavşan IgG (fare ve tavşan proksimite ligasyonu deney Probes), her iki ilave edildi. İki hedef proteinler 40 nm'nin altında bir mesafede ise, oligonükleotidler dairesel DNA şablonu (Şekil 1 Panel B) oluşmasına izin vermek için daha sonra ilave bağlayıcı oligo ile hibridize olabilir. Bu dairesel bir DNA molekülü kovalent yakınlığı probları birine bağlanmış bir tek-şeritli DNA ürününü oluşturmak, lige edilmiş ve amplifiye edilir (Şekil 1, Panel C) Ng. MAM arayüzü ER ve mitokondri arasındaki mesafe mil ^6, proksimite ligasyonu ve amplifikasyon bağlı Texas kırmızısı etiketli oligonükleotid sondalar (Şekil 1, Panel D hibridizasyonu sonraki tespiti yol yapılabilir 25-10 nm arasında değerler ). Her floresan nokta böylece tek tek hücrelerin in situ ER-mitokondri etkileşimleri sayılmasına olanak tanıyan, VDAC1 / IP3R1 arasındaki etkileşimleri temsil eder.

Şekil 1: Yerinde Proximity ligasyon Tahlili tarafından Endoplazmik Retikulum-mitokondri Etkileşimleri Algılama şematik İllüstrasyon. a) VDAC1 ve MAM arayüzü yakın kendi epitopuna bağlanabilir IP3R1 karşı bir tavşan primer antikora karşı yönlendirilmiş bir fare primer antikor, B) proksimite ligasyonu probları bir çift ilavesifare ve tavşan IgG karşı. Bu sondalar bağlayıcı oligo ligasyonu için şablonlar oluşturabilirler DNA ipliklerini eklenmiş. c) bağlanmasından sonra oluşturulan dairesel DNA zinciri Texas kırmızısı etiketli oligonükleotidler kullanılarak bir flüoresan nokta olarak mikroskopi ile görünür) yükseltilir ve D edilebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

In situ proksimite ligasyonu deneylerinde benzer antikorların GRP75 / IP3R1 çifti, hem de siklofilin D (CypD) ile yapılabilir / IP3R1 antikorlar CypD MAM arayüzü IP3R / GRP75 / SSVD kompleksi ile etkileştiği gösterilmiştir olduğu dikkate ^12-14.

Protokol

Çözümler 1. hazırlanması

1. PBS 14.5 ml% 37 formaldehit 5.5 mi seyreltilmesiyle PBS (tuz) içinde% 10 formaldehit hazırlayın. PBS, 50 ml glisin 3.8 g çözülmesiyle, 1 M glisin, pH 8.0, hazırlanması; 1x PBS içinde 100 mM glisin elde etmek için bu seyreltilir.
2. 1x PBS içinde% 0.1 Triton-X100 hazırlayın. 3.0 M sodyum klorid ve 25 ° C de pH 7.0 ile, iyonu giderilmiş su içinde hazırlanan 0.30 M trisodyum sitrat ile 20x Tuzlu sodyum sitrat (SSC) hazırlayın. 1x bu tampon sulandırmak ve deiyonize su kullanılarak 0.01x.

Hücreler 2. Sabitleme

NOT: Bu çalışmada HuH7 hepatokarsinoma hücre çizgisi kullanılır, ancak bu yöntem diğer yapışık hücre kültürleri için de geçerlidir.

1. kaplanmamış 35 mm'lik cam alt tabak başına 150.000 hücre (% 10 fetal dana serumu ve% 0.01 penisilin-streptomisin stok ile desteklenmiş DMEM, 1 g / L glikoz kültürlenmiştir) Levha Huh7 hücreleri,. Birincil hücrenin üzerinde çalışırkenKültürler, kolajen kaplı yemekler kullanımı.
2. Sonraki gün, kültür ortamı çıkarın. PBS aspire 1 ml hücreleri yıkayın. Formaldehit% 10 1 ml ekleyerek hücreleri saptamak ve ajitasyon altında oda sıcaklığında (RT) 10 dakika süreyle inkübe edilir.
3. 1 M glisin, 1 ml reaksiyonu durdurun ve rotasyon karıştırılır. Dur reaksiyon çözüm çıkarın ve 1x PBS 1 ml ekleyerek hücreleri yıkayın; rotasyon ve aspirat ile çalkalayın. hücrelere 100 mM glisin 1 ml ilave edilir ve 15 çalkalanarak oda sıcaklığında dakika ve daha sonra aspire için inkübe.
   NOT: protokol burada durdurulabilir ve aşağıdaki adımlar başka bir güne ertelenebilir. Bu durumda, 100 mM glisin, 1 ml ilave edilir ve gerektiğinde, 4 ° C'de tutun.

3. Hücrelerin Permeabilization

1. 15 çalkalanarak oda sıcaklığında dakika ve daha sonra aspire inkübe edin, 1 x PBS içinde% 0.1 Triton-X100 içinde 1 ml ilave edilir. Primer hücre kültür üzerinde çalışırken 20 dakika - Bu inkübasyon süresi 15 kadar arttırılabilires (örneğin, birincil fare hepatositler). 1x PBS 1 ml ekleyerek hücreleri yıkayın; aspire.

4. Engelleme

1. (Kit ile birlikte verilen) her bir örnek için bloke etme çözeltisi 40 ul ekle; Bu hacimli bir numunesi kapsayacak şekilde arttırılabilir. bir nemlilik bölmesi içerisinde 37 ° C'de 30 dakika boyunca yemekler inkübe edin.
2. yemekler kapalı engelleme çözümü dokunun. Bu tekrarlanabilirlik etkileyecek gibi, her slayt için eşit kalan miktarlar elde etmek için çalışın. Numuneler kurumasına izin vermeyin!

5. Birincil antikorlar,

1. 1x PBS birincil antikorlar seyreltin ve yemekler (VDAC1 fare antikoru: 1/100, IP3R1 tavşan antikoru: 1/500) için çözüm ekleyin. Seçenek olarak ise, GRP75 ve CypD antikorlar (1/500 kullanılan her iki fare antikorları) kullanılarak VDAC1 arasında kullanılabilir.
2. 4 ° C'de bir nem odasında gece boyunca inkübe edin. % 0.01 Tween (TBS-T) ile slaytlar Tris Tamponlu Salin kullanarak iki kez yıkayın.

6. Proximity ligasyon Testi Probları

1. Yakınlık ligasyon tahlil sondaları kit tarafından sağlanmaktadır. Primer antikor türlere göre problar seçin.
2. Antikor seyreltici 5: İki yakınlık ligasyon tahlil Sensörler 1 hazırlayın. Karışım, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca bekletin. seyreltilmiş yakınlık ligasyonu tahlil prob çözüm ekleyin. 37 ° C'de 1 saat boyunca önceden ısıtılmış bir nem odasında yemekler inkübe edin. TBS-T ile yemeklere iki kez yıkayın.

7. ligasyonu

1. In situ saptama reaktif maddesi Texas kırmızısı kiti kullanım.
2. Yüksek saflıkta su içinde 5 ve iyice karıştırın (kit ile birlikte verilen) 5x bağlama suyu 1 seyreltin. 1:40 ve vorteks (kit tarafından sağlanan) 1x ligasyon çözeltisi içinde ligaz sulandırmak. hemen örneklerin yanı sıra öncesine kadar ligaz eklemek için bekleyin.
3. önceden ısıtılmış bir nem Cham slaytlar her bir örnek için, bu solüsyonu (35 mm cam alt yemekler için 40 ul) ilave edilir ve kuluçkayaBER, 37 ° C'de 30 dakika karıştırıldı. TBS-T ile slaytlar iki kez yıkayın.

8. Büyütme

NOT: Dikkatli, ışığa duyarlı reaktifler olunuz.

1. Yüksek saflıkta su içinde 5: (kit ile birlikte verilen) 5x büyütme stok 1 seyreltin. donma blok kullanarak dondurucu polimeraz çıkarın (-20 ° C). (Kit tarafından sağlanan) polimeraz 1x büyütme çözüm ve vorteks içinde 1:80 seyreltilir. karışımı kullanılarak hemen önce polimeraz ekleyin.
2. Her bir örnek için, bu solüsyonu (35 mm cam alt yemekler için 40 ul) eklenir. 37 ° C'de 100 dakika boyunca önceden ısıtılmış bir nem odasında slaytlar inkübe edin. slaytlar kapalı Amplifikasyon-Polimeraz çözümü dokunun.

9. Final Yıkama

1. 2 dakika için 1 x SSC yıkama tamponunda slaytlar yıkayın. 2 dakika boyunca 0.01x SSC yıkama tamponunda slaytlar yıkayın. Yemekler karanlıkta oda sıcaklığında kurumaya bırakın.

Görüntüleme için 10. Hazırlık

1. hava kabarcıkları kapak kayma altında yakalanmak sağlanması, (sulu ve katılaşmaya değildir) DAPI içeren montaj orta minimal hacmi kullanılarak slaytlar monte edin. Tırnak cilası kenarları mühür için kullanılabilir. (: 594 nm, emisyon: 624 nm, Büyütme: 63X uyarım) bir floresan veya konfokal mikroskop kullanılarak analiz etmeden önce yaklaşık olarak 15 dakika boyunca bekleyin.
2. görüntüleme sonra karanlıkta -20 ° C'de slaytlar saklayın.

Sonuçlar

Bu protokolü kullanarak bizim deneyime dayalı, biz güvenle sabit hücrelerde ER-mitokondri etkileşimleri görselleştirme ve miktar tayini için bu yöntemi tavsiye ederim. Antikorların çeşitli çiftleri kullanılarak HuH7 hepatokarsinoma hücre çizgisinde in situ proksimite ligasyonu deneyi-görüntülenmiştir ER-mitokondri etkileşimlerine temsili görüntüleri gösterilmektedir. Flüoresans mikroskopisi ile, Şekil 2'de gösterildiği g...

Tartışmalar

Collectively, our studies indicate that the in situ proximity ligation assay is truly a relevant strategy to follow and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells, without the need for using organelle-specific fluorophores or fluorescent proteins. The specific use of VDAC1/IP3R1 antibodies has been adapted to study ER-mitochondria interactions in HuH7 cells. However, alternative isoforms of VDAC and IP3R may be used, depending on the cell type. In this case, antibodies need to be validated b...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formaldehyde	Sigma	F-8775
Glycine	Sigma	G-8898
Triton	Sigma	T8532
35mm Glass bottom culture dishes	MatTeK corporation	P35G-0-14-C
Blocking solution	Sigma	DUO-92004 or DUO-92002	provided in the Duolink PLA probes, Sigma
VDAC1 antibody	Abcam	ab14734
IP3R1-H80 antibody	Santa Cruz	sc28614
CypD antibody	Abcam	ab110324
Grp75 antibody	Santa Cruz	sc13967
TBS 10X	euromedex	ET220	Dilute to obtain 1X
Tween 100X	euromedex	2001-B	dilute in TBS to obtain 0,01%
PLA Probes Mouse MINUS	Sigma	DUO-92004	Duolink, Sigma
PLA Probes Rabbit PLUS	Sigma	DUO-92002	Duolink, Sigma
Duolink detection reagents red	Sigma	DUO-92008	Duolink, Sigma
Ligation solution	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Ligase	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Amplification solution	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Polymerase	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Duolink Mounting Medium	Sigma	DUO80102	Duolink, Sigma
Softwares:
Blob-finder software			BlobFinder is a freely distributed software that can perform calculations on cells from fluorescence microscopy images. This software can be downloaded for free from The Centre for Image Analysis at Uppsala University who have developed the software and the work was supported by the EU FP6 Project ENLIGHT and  Olink Bioscience. http://www.cb.uu.se/~amin/BlobFinder/index_files/Page430.htm
ImageJ software			Can be downloaded for free from: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html