Studio del reticolo endoplasmatico e mitocondri interazioni<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Assay legatura in cellule fissate

Riepilogo

Qui, descriviamo una procedura per visualizzare e quantificare con alta sensibilità le interazioni endogeni tra il reticolo endoplasmatico e mitocondri nelle cellule fissate. Il protocollo è dotato di un ottimizzato in test legatura situ prossimità targeting inositolo 1,4,5-trifosfato recettore / glucosio-regolata proteina 75 / D complesso canale anionico / cyclophilin voltaggio-dipendente all'interfaccia membrana mitocondriale associata.

Abstract

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), are crucial hubs for cellular signaling and cell fate. Particularly, these inter-organelle contact sites allow the transfer of calcium from the ER to mitochondria through the voltage-dependent anion channel (VDAC)/glucose-regulated protein 75 (GRP75)/inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) calcium channeling complex. While this subcellular compartment is under intense investigation in both physiological and pathological conditions, no simple and sensitive method exists to quantify the endogenous amount of ER-mitochondria contact in cells. Similarly, MAMs are highly dynamic structures, and there is no suitable approach to follow modifications of ER-mitochondria interactions without protein overexpression. Here, we report an optimized protocol based on the use of an in situ proximity ligation assay to visualize and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells by using the close proximity between proteins of the outer mitochondrial membrane (VDAC1) and of the ER membrane (IP3R1) at the MAM interface. Similar in situ proximity ligation experiments can also be performed with the GRP75/IP3R1 and cyclophilin D/IP3R1 pairs of antibodies. This assay provides several advantages over other imaging procedures, as it is highly specific, sensitive, and suitable to multiple-condition testing. Therefore, the use of this in situ proximity ligation assay should be helpful to better understand the physiological regulations of ER-mitochondria interactions, as well as their role in pathological contexts.

Introduzione

Mitocondri e reticolo endoplasmatico (ER) non sono organelli indipendenti nella cellula, ma interagiscono strutturalmente e funzionalmente a siti di contatto definite membrane reticolo endoplasmatico mitocondri-associato (MAM). Infatti, DAM corrispondono alle regioni in cui le membrane del ER e mitocondri sono strettamente apposto, permettendo interazioni tra proteine ​​da entrambi i lati. Ciò nonostante, le membrane di questi organelli non si fondono in queste regioni, in modo da mantenere le loro entità separate. I DAM svolgono un ruolo cruciale nel calcio (Ca ²⁺⁾ e il trasferimento dei fosfolipidi da ER a mitocondri, impattando il metabolismo energetico e la sopravvivenza delle cellule ^1-3.

L'associazione tra ER e mitocondri è stato visualizzato nel 1970 con microscopia elettronica. Da allora, la trasmissione microscopia elettronica ^4,5, elettroni tomografia ^6,7 o immuno-localizzazione di ER e specifici mitocondri fluoroforos / proteine fluorescenti ⁸ sono stati classicamente utilizzati per studiare le interazioni ER-mitocondri. Un altro strumento utile per l'analisi di MAM si basa sull'uso di frazionamento subcellulare. Esso permette di isolare frazioni MAM mediante ultracentrifugazione differenziale accoppiato ad un gradiente Percoll ^9. Tuttavia, il prodotto finale contiene frazioni arricchite MAM, anziché frazioni pure. Complessivamente, queste strategie non sono particolarmente sensibili e / o quantitativo, e non sono facilmente suscettibili di grande screening. In alternativa, utilizzando approcci genetici fluorescenti linker inter-organelli droga-inducibile sono emerse, ma non consentire l'analisi delle interazioni organelli ai livelli di espressione delle proteine endogene ^10.

Sulla base di scoperta di Szabadkai del complesso IP3R / GRP75 / VDAC al MAM ^11, abbiamo sviluppato un metodo quantitativo per analizzare le interazioni ER-mitocondri. Abbiamo usato il ligati in situ di prossimitàil test di rilevare e quantificare le interazioni tra VDAC1 e IP3R1, due proteine organello-superficiali coinvolti nella -channeling complesso Ca ²⁺ all'interfaccia MAM in cellule fisse ^12. Brevemente, abbiamo sondato VDAC1 alla membrana esterna mitocondriale (topo anti-VDAC1 anticorpo primario) e IP3R1 sulla membrana ER (coniglio anti-IP3R1 anticorpo primario) (figura 1, pannello A). Quindi, secondo il test, abbiamo aggiunto sia anti-topo e IgG anti-coniglio (sonde saggio mouse e vicinanza coniglio legatura), che sono coniugato a estensioni oligonucleotidi complementari. Se le due proteine sono mirati ad una distanza inferiore a 40 nm, gli oligonucleotidi possono ibridare con oligonucleotidi connettore successivamente aggiunti per consentire la formazione di un modello circolare DNA (figura 1, pannello B). Questa molecola di DNA circolare è legatura ed amplificato, creando un prodotto singolo filamento DNA covalentemente attaccata ad una delle sonde di prossimità (figura 1, pannello c) . Poiché la distanza tra ER e mitocondri all'interfaccia MAM varia da 10 nm a 25 nm ^6, vicinanza legatura ed amplificazione può essere fatto, portando a successiva rivelazione causa della ibridazione della Texas oligonucleotidi rossi marcati sonde (Figura 1, pannello d ). Ogni punto rappresenta fluorescente interazioni tra VDAC1 / IP3R1, permettendo così la quantificazione delle interazioni in situ ER-mitocondri nelle singole celle.

Figura 1: Schema Illustrazione del rilevamento delle interazioni reticolo endoplasmatico-mitocondri in situ prossimità legatura Assay. a) Un anticorpo mouse principale diretto contro VDAC1 e un anticorpo di coniglio diretto contro primaria IP3R1 possono legarsi ai loro epitopi in prossimità all'interfaccia MAM, b) aggiunta di una coppia di sonde legatura di prossimitàdiretto contro mouse e IgG di coniglio. Queste sonde hanno attaccato filamenti di DNA che possono formare modelli per la legatura di oligonucleotidi connettore. c) Il filamento di DNA circolare formata dopo la legatura può essere amplificato e d) visualizzati mediante microscopia a fluorescenza dot utilizzando oligonucleotidi Texas red-marcato. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Simile in esperimenti di analisi in situ prossimità legatura possono essere eseguite con la coppia GRP75 / IP3R1 di anticorpi, così come cyclophilin D (CypD) / anticorpi IP3R1, se si considera che CypD ha dimostrato di interagire con il complesso IP3R / GRP75 / VDAC all'interfaccia MAM ^12-14.

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Protocollo

1. preparazione di soluzioni

1. Preparare 10% di formaldeide in PBS (bassa percentuale di sale) diluendo 5.5 ml di formaldeide al 37% in 14,5 ml di PBS. Preparare 1 M glicina, pH 8,0, sciogliendo 3,8 g di glicina in 50 ml di PBS; diluire questa soluzione per ottenere 100 mM glicina in PBS 1x.
2. Preparare 0,1% Triton-X100 in 1x PBS. Preparare 20x Saline sodio citrato (SSC) utilizzando 3,0 M di cloruro sodico e 0,30 M citrato trisodico preparato in un buffer di acqua deionizzata a pH 7,0 a 25 ° C. Diluire questo buffer a 1x e 0,01X con acqua deionizzata.

2. Fissazione delle cellule

NOTA: Abbiamo usato la linea cellulare epatocarcinoma Huh7 in questo studio, ma questo metodo è applicabile ad altre culture di cellule aderenti.

1. cellule piastra Huh7 (coltivate in DMEM 1 g / L di glucosio, supplementato con 10% siero fetale bovino e 0,01% di penicillina-streptomicina magazzino) a 150.000 cellule per non patinata piatto fondo di vetro da 35 mm. Quando si lavora su cellule primarieculture, utilizzano piatti collagene rivestite.
2. Il giorno successivo, rimuovere il terreno di coltura. Lavare le cellule con 1 ml di PBS e aspirare. Fissare le cellule aggiungendo 1 ml di formaldeide al 10% e incubare per 10 min a temperatura ambiente (RT) sotto agitazione.
3. Arrestare la reazione con 1 ml di 1 M glicina e mescolare rotazione. Rimuovere la soluzione di reazione di arresto e lavare le cellule con l'aggiunta di 1 ml di PBS 1x; Agitare dalla rotazione e aspirare. Aggiungere 1 ml di 100 mM glicina alle cellule e incubare per 15 minuti a RT sotto agitazione, e poi aspirare.
   NOTA: Il protocollo può essere fermato qui e la seguente procedura può essere rimandata ad un altro giorno. In tal caso, aggiungere 1 ml di 100 mM glicina e mantenere a 4 ° C, se necessario.

3. permeabilizzazione delle cellule

1. Aggiungere 1 ml di 0,1% Triton-X100 in 1x PBS, incubare per 15 minuti a RT sotto agitazione, e poi aspirare. Questo tempo di incubazione potrebbe essere aumentato fino a 15 - 20 minuti quando si lavora su cultur cellula primariaes (ad esempio, gli epatociti topi primaria). Lavare le cellule con l'aggiunta di 1 ml di PBS 1x; aspirare.

4. Blocco

1. Aggiungere 40 ml di soluzione bloccante a ciascun campione (fornito dal kit); questo volume può essere aumentato per coprire il campione. Incubare le stoviglie per 30 min a 37 ° C in una camera umida.
2. Toccare la soluzione di saturazione fuori dei piatti. Cercare di ottenere uguali volumi residui per ogni diapositiva, come questo influirà la riproducibilità. Non lasciare i campioni a secco!

5. Anticorpi primari

1. Diluire gli anticorpi primari in 1x PBS e aggiungere la soluzione ai piatti (anticorpi del mouse VDAC1: 1/100, IP3R1 anticorpi di coniglio: 1/500). In alternativa, GRP75 o CypD anticorpi (entrambi anticorpi murini usati a 1/500) possono essere utilizzati al posto di VDAC1.
2. Incubare per una notte in una camera umida a 4 ° C. Lavare le diapositive due volte utilizzando Tris Buffered Saline con lo 0,01% di Tween (TBS-T).

6. Di prossimità Ligation Assay Sonde

1. Prossimità sonde saggio legatura sono forniti dal kit. Scegliere sonde secondo le specie di anticorpi primari.
2. Preparare le due sonde di prossimità test legatura 1: 5 nel diluente. Lasciare il composto a riposare per 20 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere la soluzione della sonda test di prossimità legatura diluito. Incubare i piatti in una camera umida preriscaldato per 1 ora a 37 ° C. Lavare i piatti due volte con TBS-T.

7. legatura

1. Utilizzare il reagente di rilevamento in situ Texas kit di rosso.
2. Diluire la legatura magazzino 5x (fornito dal kit) 1: 5 in acqua ad alta purezza e mescolare bene. Diluire ligasi nella soluzione 1x legatura (fornito dal kit) 1:40 e vortex. Attendere aggiungere ligasi solo immediatamente prima oltre ai campioni.
3. Aggiungere questa soluzione per ogni campione (40 microlitri per piatti con fondo di vetro da 35 mm) e incubare i vetrini in una umidità cham preriscaldatober per 30 min a 37 ° C. Lavare le diapositive due volte con TBS-T.

8. Amplificazione

Nota: Fare attenzione reagenti sensibili alla luce,.

1. Diluire il magazzino 5x amplificazione (fornito dal kit) 1: 5 in acqua ad alta purezza. Rimuovere la polimerasi dal congelatore utilizzando il blocco di congelamento (-20 ° C). Diluire la polimerasi (fornito dal kit) 1:80 nella soluzione di amplificazione 1x e vortex. Aggiungere la polimerasi subito prima di utilizzare la miscela.
2. Aggiungere questa soluzione per ogni campione (40 microlitri per piatti con fondo di vetro da 35 mm). Incubare i vetrini in una camera umida preriscaldata per 100 minuti a 37 ° C. Toccare la soluzione di amplificazione-polimerasi fuori delle diapositive.

9. lavaggio finale

1. Lavare i vetrini in tampone di lavaggio 1x SSC per 2 minuti. Lavare le diapositive 0,01X tampone di lavaggio SSC per 2 minuti. Lasciate che l'asciugatura delle stoviglie a RT al buio.

10. Preparazione per l'imaging

1. Montare le diapositive utilizzando un volume minimo di mezzo di montaggio contenente DAPI (acquosa e non solidificare), assicurando che bolle d'aria rimangano intrappolati sotto il vetrino. Smalto per unghie può essere utilizzato per sigillare i bordi. Attendere circa 15 minuti prima di analizzare con una fluorescenza o microscopio confocale (eccitazione: 594 nm, emissione: 624 nm, ingrandimento: 63X).
2. Dopo l'imaging, conservare i campioni a -20 ° C al buio.

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Risultati

Sulla base della nostra esperienza con questo protocollo, possiamo tranquillamente consigliare questo metodo per la visualizzazione e la quantificazione delle interazioni ER-mitocondri nelle cellule fisse. Immagini rappresentative della legatura in prossimità interazioni ER-mitocondri situ test-visualizzato nella linea di cellule Huh7 epatocarcinoma, utilizzando diverse paia di anticorpi, sono mostrati. Come mostrato in figura 2 mediante microscopia a ...

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Discussione

Collectively, our studies indicate that the in situ proximity ligation assay is truly a relevant strategy to follow and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells, without the need for using organelle-specific fluorophores or fluorescent proteins. The specific use of VDAC1/IP3R1 antibodies has been adapted to study ER-mitochondria interactions in HuH7 cells. However, alternative isoforms of VDAC and IP3R may be used, depending on the cell type. In this case, antibodies need to be validated b...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formaldehyde	Sigma	F-8775
Glycine	Sigma	G-8898
Triton	Sigma	T8532
35 mm Glass bottom culture dishes	MatTeK corporation	P35G-0-14-C
Blocking solution	Sigma	DUO-92004 or DUO-92002	provided in the Duolink PLA probes, Sigma
VDAC1 antibody	Abcam	ab14734
IP3R1-H80 antibody	Santa Cruz	sc28614
CypD antibody	Abcam	ab110324
Grp75 antibody	Santa Cruz	sc13967
TBS 10x	euromedex	ET220	Dilute to obtain 1x
Tween 100x	euromedex	2001-B	dilute in TBS to obtain 0,01%
PLA Probes Mouse MINUS	Sigma	DUO-92004	Duolink, Sigma
PLA Probes Rabbit PLUS	Sigma	DUO-92002	Duolink, Sigma
Duolink detection reagents red	Sigma	DUO-92008	Duolink, Sigma
Ligation solution	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Ligase	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Amplification solution	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Polymerase	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Duolink Mounting Medium	Sigma	DUO80102	Duolink, Sigma
Softwares
Blob-finder software			BlobFinder is a freely distributed software that can perform calculations on cells from fluorescence microscopy images. This software can be downloaded for free from The Centre for Image Analysis at Uppsala University who have developed the software and the work was supported by the EU FP6 Project ENLIGHT and Olink Bioscience. http://www.cb.uu.se/~amin/BlobFinder/index_files/Page430.htm
ImageJ software			Can be downloaded for free from: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html